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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo manoscritto descrive la procedura sperimentale e l'analisi del software per un test di sito di integrazione bidirezionale che può contemporaneamente analizzare il DNA di giunzione vettoriale-host a monte ea valle. I prodotti bidirezionali di PCR possono essere usati per qualsiasi piattaforma di sequencing a valle. I dati risultanti sono utili per un confronto quantitativo e ad alto rendimento dei target integrati del DNA.

Abstract

I test di sito di integrazione (IS) sono una componente fondamentale dello studio dei siti di integrazione retrovirale e del loro significato biologico. Negli ultimi studi di terapia genica retrovirale, i test di IS, in combinazione con sequenziamento di nuova generazione, sono stati utilizzati come strumento di monitoraggio delle cellule per caratterizzare le popolazioni di cellule staminali clonali che condividono la stessa IS. Per il confronto preciso dei cloni di cellule staminali ripopolari all'interno e tra diversi campioni, la sensibilità di rilevazione, la riproducibilità dei dati e la capacità di trasmissione elevata del dosaggio sono tra le qualità di dosaggio più importanti. Questo lavoro fornisce un flusso di lavoro dettagliato per il protocollo e l'analisi dei dati per l'analisi bidirezionale dell'IS. Il saggio bidirezionale può simultaneamente sequenziare giunzioni sia a monte che a valle del vettore-host. Rispetto agli approcci convenzionali sequenziali unidirezionali, l'approccio bidirezionale migliora notevolmente i tassi di rilevazione di IS e la caratterizzazione degli eventi di integrazione a entrambe le estremità di tEgli mira al DNA. L'analisi dei dati descritta qui accuratamente identifica e enumera le sequenze identiche di IS attraverso più fasi di confronto che mappono le sequenze di IS sul genoma di riferimento e determinano gli errori di sequenza. Utilizzando una procedura di dosaggio ottimizzata, abbiamo recentemente pubblicato gli schemi di repopulazione dettagliati di migliaia di cloni di cellule staminali ematopoietiche (HSC) dopo il trapianto in macaques rhesus, dimostrando per la prima volta il momento preciso del ripopolamento HSC e l'eterogeneità funzionale degli HSC nel Sistema primato. Il seguente protocollo descrive la procedura sperimentale dettagliata e il flusso di lavoro di analisi dei dati che identifica con precisione e quantifica le sequenze identiche di IS.

Introduzione

Retrovirus inserire il loro DNA genomico nel genoma ospite in vari siti. Questa proprietà unica, che può contribuire allo sviluppo di tumori e altre forme di patogenesi virale, ha il vantaggio ironico di rendere tali virus altamente suscettibili all'ingegneria cellulare per la terapia genica e la ricerca di base della biologia. Il sito di integrazione virale (IS) - l'ubicazione sul genoma ospite in cui è integrato un DNA straniero (virus) - ha importanti implicazioni per il destino sia dei virus integrati che delle cellule ospitanti. I test di IS sono stati utilizzati in varie impostazioni di ricerca biologiche e cliniche per studiare la selezione e la patogenesi dei siti di integrazione retrovirale, lo sviluppo del cancro, la biologia delle cellule staminali e la biologia dello sviluppo 1 , 2 , 3 , 4 . Sono tra le minore sensibilità di rilevazione, la scarsa riproducibilità dei dati e la frequente contaminazione incrociataI fattori chiave che limitano le applicazioni dei test IS a studi attuali e pianificati.

Sono state sviluppate molte tecnologie di analisi IS. I più ampiamente utilizzati sono i test del sito di integrazione a base di enzimi di restrizione, tra cui la reazione a catena polimerasi (PCR) 5 , PCR inversa PCR 6 e LAM (PCR 7 ) mediata da amplificazione lineare (LAM). L'uso di enzimi di restrizione specifici del sito, tuttavia, genera una polarizzazione durante il recupero dell'IS, consentendo solo un sottoinsieme di integromi (un DNA straniero integrato nel genoma ospite) nelle vicinanze del sito di restrizione da recuperare 4 . Sono state introdotte anche tecnologie di analisi che valutano in modo più ampio il vettore IS negli ultimi anni. Questi test impiegano varie strategie, tra cui Mu transposone mediato PCR 8 , non restrittivo (nr) -LAM PCR 9 , tipo II restriction enzymLa digestione 10 , la tranciatura meccanica 11 e il PCR a base di esame casuale (PCR re-free) 12 , per frammentare i DNA genomici e amplificare l'IS. Le tecnologie correnti hanno diversi livelli di sensibilità di rilevazione, copertura del genoma, specificità dell'obiettivo, capacità di trasmissione elevata, complessità delle procedure di analisi e pregiudizi nel rilevare le frequenze relative dei siti target. Dato le varie qualità dei test esistenti e la varietà di scopi per cui possono essere utilizzati, l'approccio ottimale del dosaggio deve essere attentamente selezionato.

Questo lavoro fornisce procedure dettagliate sperimentali e un flusso di lavoro di analisi dei dati computazionali per un test bidirezionale che migliora notevolmente i tassi di rilevazione e la precisione di quantificazione della sequenza analizzando simultaneamente l'IS a monte ea valle del DNA target integrato (si veda la figura 1 per una visione schematica delle procedure di analisi ). Questo approccio fornisce ancheI mezzi per caratterizzare il processo di integrazione retrovirale (ad esempio, la fedeltà della duplicazione del sito di destinazione e delle variazioni nelle sequenze genomiche di inserzioni a monte ea valle). Altri metodi bidirezionali sono stati usati principalmente per la clonazione e il sequenziamento di entrambe le estremità del DNA bersaglio 11 , 13 , 14 . Questo test è ampiamente ottimizzato per la quantificazione ad alta percentuale e riproducibile di cloni marcati da vettori, utilizzando il metodo LM-PCR consolidato e mappatura di analisi computazionale e per la quantificazione delle giunzioni a monte ea valle. L'analisi bidirezionale con l'enzima TaqαI si è dimostrata utile per la quantificazione clonale ad alta percentuale in studi preclinici per la terapia genica delle cellule staminali 2 , 15 . Questo articolo descrive un metodo modificato che utilizza una taglierina più frequente (RsaI / CviQI - motivo: GTAC) che raddoppia tHa probabilità di rilevare gli integri rispetto ad un test basato su TaqαI . Sono descritte procedure dettagliate di analisi sperimentale e di dati che utilizzano enzimi motivi GTAC per lentivirali (NL4.3 e suoi derivati) e vectori gamma-retrovirali (vettori pMX). Gli oligonucleotidi usati nel saggio sono elencati nella tabella 1 . Uno script di programmazione interno per l'analisi sequenza IS è fornito nel documento supplementare.

Protocollo

1. Generazione di librerie di sequenza di giunzione a monte (a sinistra) e a valle (a destra)

  1. Preparazione del DNA linker:
    1. Preparare una soluzione di DNA a 10 μL di linker aggiungendo 2 μl di Oligos LINKER_A 100 μM (finale: 20 μM), 2 μl di Oligos LINKER_B 100 μM (finale: 20 μM), 2 μL di 5 M NaCl (finale: 1M) e 4 μl di acqua priva di nucleasi in un tubo PCR. Vedere la Tabella 1 per le sequenze di linker.
    2. Incubare la soluzione DNA del linker a 95 ° C per 5 minuti in uno strumento PCR, arrestare il programma di esecuzione e spegnere lo strumento PCR. Lasciare la soluzione del linker nello strumento per 30 minuti per raffreddare lentamente il DNA del linker. La soluzione DNA del linker può essere conservata a 4 ° C.
  2. Estensione biotina-primer specifica di LTR:
    1. Utilizzare uno spettrofotometro UV-Vis per determinare la concentrazione del DNA ei valori di 260/280 nm del DNA genomico da in vivoO esperimenti in vitro . Diluire 1-2 μg di DNA genomico di campione ad un volume finale di 170 μL di soluzione genomica del DNA usando acqua senza nucleasi.
    2. Preparare una reazione di PCR da 200 μl mescolando 2,5 μL di ciascuno dei 10 μM primari di biotina specifici HIV-1 (L-BP e R-BP nella Tabella 1 : complessivamente 10 μL per quattro primer specifici lentivirus), 20 μL di 10X termostabili DNA buffer di polimerasi, 4 μL di 10 mM dNTPs (finale: 200 μM di ciascun dNTP), 3 μL di polimerasi DNA termostabile 2,5 U / μL e 163 μL di DNA genomico.
      NOTA: Per i vettori gammaretrovirali (vettori pMX), utilizzare 5 μl ciascuno di due primer di biotina specifici pMX 10 μM (L-BP e R-BP: complessivamente 10 μL) anziché i quattro primer biotinici specifici HIV-1 sopra.
    3. Dividere la soluzione in quattro tubi PCR (ogni 50 μL) e effettuare un ciclo di estensione singolo nelle seguenti condizioni: 94 ° C per 5 min, 56 ° C per 3 min, 72 ° C per 5Min e 4 ° C per la conservazione.
    4. Stazionare tutte le quattro reazioni PCR in un tubo di microcentrifuga da 2 mL e seguire la procedura di purificazione PCR del kit di purificazione PCR. Eluire con 50 μl di tampone di eluizione (tampone di eluizione diluito a 5 volte nel kit). Procedere immediatamente con il passo 1.3.1 o memorizzare il DNA eluito a -20 ° C.
  3. RsaI e CviQI digestione
    1. Preparare una reazione di digestione da 100 μL aggiungendo 50 μL di DNA (dal punto 1.2.4), 10 μL di 10 volte tampone A e 2 μl (20 U) di enzima RsaI. Incubare a 37 ° C per 1 h in uno strumento PCR.
    2. Aggiungere 1 μl (10 U) di enzima CviQI alla reazione e incubare a 25 ° C per 30 minuti in uno strumento PCR. Procedere immediatamente con il punto 1.4.1
  4. Finale sbattuto:
    1. Preparare una miscela di 4,5 μl contenente 2,5 μL di DNA polimerasi I grande (klenow) e 2 μL di 10 mM dNTPs. Trasferimento 181 L della miscela al campione di DNA dal punto 1.3.2. Il volume totale sarà di 102 μL. Mescolare bene vorticando e incubare a 25 ° C per 1 h in uno strumento PCR. Procedere immediatamente con il passaggio 1.6.1.
  5. Preparazione di perle streptavidina:
    1. Brevemente vortex la soluzione perlato di streptavidina e trasferire 50 μl in un nuovo tubo di microcentrifuga da 2 mL. Rimuovere il surnatante usando lo stand magnetico e lavare le perle con 200 μL di soluzione di legame.
    2. Resuspendere le perle in 100 μL di soluzione di legame e posizionare il tubo dal supporto magnetico. Procedere immediatamente con il passaggio 1.6.1.
  6. Strisce leganti di Streptavidin:
    1. Trasferire 100 μL di DNA campione (punto 1.4.1) alla soluzione di rilievo ricoperto da 100 μL (punto 1.5.2) e mescolare attentamente pipettando per evitare qualsiasi schiuma della soluzione. Incubare il tubo a temperatura ambiente per 3 ore su una ruota o un rullo rotante.
    2. Usate lo stand magnetico per catturare le perle e scartare il surnatante. Lavare le perle due volte in 400 μL di soluzione di lavaggio e due volte in 400 μl di 1x T4 DNA ligase buffer (diluito da soluzione 10X usando acqua priva di nucleasi).
    3. Resuspendere le perle in 200 μl di 1x T4 DNA ligase buffer (diluito da soluzione 10X usando acqua priva di nucleasi) e metterlo lontano dal supporto magnetico. Procedere immediatamente con il punto 1.7.1.
  7. Ligation del linker:
    1. Preparare una soluzione di reazione di ligation di 400 μL in un tubo di microcentrifuga da 2 ml mescolando 0,5 μL del linker del DNA (fase 1.1.2), 10 μl di tampone ligasi 10x T4 DNA, 20 μl di 5X T4 DNA ligase buffer (contenente il 25% di polietilene Glicole), 5 μl di ligasi del DNA di T4, 164,5 μL di acqua priva di nucleasi e 200 μL di brani ri-sospesi (punto 1.6.3). Posizionare il tubo di reazione sulla ruota rotante e incubare a RT (22 ° C) per 3 ore (o 16 ° CO / N).
    2. Lavare le perline due volte con la soluzione di lavaggio e due volte con 1X tampone termoplastico DNA polimerasi (diluito da soluzione 10x utilizzando acqua senza nucleasi) utilizzando il supporto magnetico.
    3. Resuspendere le perle in 50 μl di 1x termostabile tampone PCR polimerasi di DNA e metterlo lontano dal supporto magnetico. Procedere immediatamente con il passo 1.8.1 o conservare a 4 ° C per un massimo di un giorno.
  8. Preamplificazione della giunzione sinistro e destra DNA:
    1. Preparare una reazione PCR da 200 μl aggiungendo 10 μL di 10 μM di primer di 1L, 10 μL di 10 μM di primer 1R, di 20 μL di 10 μM di primer Link1 (Tabella 1), di 10 μl di tampone DNA polimerasi termo-stabile 10X, 4 μL di 10 mM dNTPs (finale: 200 μM di ciascun dNTP), 8 μL (20 U) DNA polimerasi termostabile e 88 μL di acqua libera da nucleasi per le perline ricondizionate (50 μL) del punto 1.7.3.
    2. Aliquota la miscela di reazione in 4 tubi PCR (ogni 501; L) e realizzare PCR con la seguente condizione: incubazione a 94 ° C per 2 min; 25 cicli di 94 ° C per 20 s, 56 ° C per 25 s e 72 ° C per 2 min; E una estensione finale a 72 ° C per 5 min.
    3. Raccogliere tutte le 4 reazioni PCR in un tubo di microcentrifuga da 2 mL e seguire la procedura di purificazione PCR del kit di purificazione PCR. Eluire con 50 μl di tampone di eluizione.
    4. Determinare la concentrazione del DNA ei valori di 260/280 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis; Il DNA può essere conservato a -20 ° C fino a quando è pronto per il passo successivo. Procedere con i passaggi 1.9.1 / 1.10.1 (facoltativo) o direttamente con i passaggi 1.11.1 / 1.12.1.
  9. Rimozione dell'ampiezza del DNA interno sinistro (opzionale):
    1. Trasferire fino a 100 ng di prodotto DNA del PCR dal punto 1.8.4 in un tubo di microcentrifuga da 2 mL e regolare il volume a 10 μL usando acqua priva di nucleasi.
    2. Preparare una reazione di enzima di restrizione che punta specificamente al D interno interno sinistroAmplicone NA.
      NOTA: La condizione di reazione può variare a seconda della scelta dell'enzima. Ad esempio, quando si rimuove il DNA interno sinistro da vettori lentivirali basati su NL4.3 , aggiungere 1 μl di pvuII , 2 μL di tampone B e 7 μl di acqua priva di nucleasi. Incubare a 37 ° C per 1 h in uno strumento PCR. Procedere immediatamente con il passo 1.11.1 o conservare a -20 ° C.
  10. Rimozione dell'ampiezza del DNA interno destro (opzionale):
    1. Procedere come al punto 1.9.1.
    2. Preparare una reazione di enzima di restrizione che punta specificamente all'amplificone interno destro del DNA.
      NOTA: Ad esempio, quando si rimuove il DNA interno destro da vettori lentivirali basato su NL4.3 , aggiungere 1 μl di sfoI , 2 μL di buffer B e 7 μl di acqua priva di nucleasi. Incubare a 37 ° C per 1 h in uno strumento PCR. Procedere immediatamente con il passo 1.12.1 o conservare a -20 ° C.
  11. Sinistra- amplificazione specifica di giunzione:
    1. Preparare una reazione PCR da 50 μl mescolando 5 μL di DNA dal punto 1.8.4 (o dal punto opzionale 1.9.2), 5 μL di 10 μM primer 2L (finale: 1 μM), 5 μL di primer da 10 μM Link2 (Finale: 1 μM), 5 μl di tampone DNA polimerasi termo-stabile 10x, 1 μL di dNTP 10 mM (finale: 200 μM di ciascun dNTP), 2 μL (5 U) di DNA polimerasi termostabile e 27 μL di nucleasi acqua.
    2. Eseguire il PCR con la seguente condizione: incubazione di 94 ° C per 3 min; 8-15 cicli di 94 ° C per 20 s, 56 ° C per 25 s e 72 ° C per 2 min; E una estensione finale a 72 ° C per 5 min.
      NOTA: il DNA amplificato può essere conservato a -20 ° C. * Si suggerisce l'ottimizzazione del numero di ciclo.
    3. Seguire la procedura di purificazione PCR del kit di purificazione PCR. Eluire con 50 μl di tampone di eluizione. Determinare la concentrazione del DNA ei valori di 260/280 nm.
  12. Amplificazione a destra-giunzione:
    1. Tutte le procedure sono identiche a "Amplificazione specifica sinistro-giunzione" (fasi 1.11.1-1.11.3), ad eccezione dell'uso di diversi primer; Utilizzare il primer specifico a destra (primer 2R, vedi tabella 1 ) in questo passaggio.
  13. Prova di variazione della lunghezza di amplicon PCR:
    1. Analizzare le variazioni della lunghezza dell'ampiezza del PCR eseguendo l'elettroforesi del gel agarosico del 2% o l'elettroforesi capillare ( Figura 2 ).
      NOTA: Si tratta di un passo essenziale per confermare il completamento delle procedure di analisi e per effettuare una valutazione ruvida dei modelli IS basati sui modelli di banda PCR. L'amplicone PCR purificato dai passaggi 1.11.3 e 1.12.3 può essere utilizzato per varie piattaforme di sequenziamento del DNA. Procedere con le appropriate procedure di preparazione del campione per la sequenza classica di terminazione di catena (Sanger) o sequenziamento di nuova generazione. Il DNA può essere conservato a -20 °; C.

2. Analisi della sequenza di calcolo IS

  1. Preparazione dei file di dati:
    1. Preparare tre file di dati di input: un file di dati di sequenza di formato fasta (Test_data.fa in dati aggiuntivi), un file tsv per i motivi di ricerca per le sequenze di vettori e linker (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv nei dati aggiuntivi) e un file tsv per informazioni sull'enzima di restrizione (Enzyme.tsv in dati supplementari).
      NOTA: Questi file sono richiesti per la demultiplexing, la sequenza di vettori e sequenze di link e la rimozione delle sequenze vettoriali interne ( Figura 3A ). Le istruzioni passo per passo dettagliate per l'implementazione del flusso di lavoro computazionale sono fornite nel file README.txt nei dati supplementari.
  2. Analisi computazionale:
    1. Esegui script demultiplexing e trim.
      NOTA: la sequenza cruda verrà elaborata per demultiplexing e per il trimminG del vettore, del linker e delle sequenze di primer (vedere STEP-1 nel file README.txt supplementare).
    2. Eseguire il comando di mappatura (vedere STEP-2 nel file README.txt) per mappare le sequenze elaborate sul genoma di riferimento utilizzando uno strumento di allineamento simile a BLAST (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
    3. Eseguire lo script di analisi quantitativa IS (vedere STEP-3 nel file README.txt).
      NOTA: Verranno generati due file di output (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt e Final_count.txt). Ulteriori dettagli sulla mappatura e sulle sequenze di sequenza di sequenze possono essere trovati nel file "README.txt" nei dati supplementari e nelle pubblicazioni precedenti 2 , 15 .

Risultati

Il test bidirezionale IS ha generato diverse dimensioni di ampliconi PCR per entrambi i giunti dell'host vettore a monte (a sinistra) e a valle (destra) ( Figura 2 ). La dimensione di un amplicon PCR dipende dalla posizione del motivo più prossimo GTAC a monte ea valle di un integro. Il saggio ha inoltre prodotto ampliconi PCR a DNA interni: sequenze retrovirali vicine al tratto polipurinico e al sito di legame di primer sono stati amplificati contempor...

Discussione

Il saggio bidirezionale consente l'analisi simultanea sia delle sequenze di giunzione del DNA vettori-host a monte (a sinistra) che a valle (destra) ed è utile in una serie di terapie geniche, cellule staminali e applicazioni di ricerca del cancro. L'uso di enzimi GTAC-motif (RsaI e CviQI) e l'approccio PCR bidirezionale migliorano significativamente le possibilità di individuazione di un integro (o di una popolazione clonale) rispetto ai precedenti dosaggi 2,15 , basati su enzimi a motivo TCG...

Divulgazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Riconoscimenti

I finanziamenti sono stati forniti dai finanziamenti nazionali dell'Istituto di assistenza sanitaria R00-HL116234, U19 AI117941 e R56 HL126544; La National Science Foundation Grant DMS-1516675; La Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); E il programma di iniziativa KRIBB.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Thermostable DNA polymeraseAgilent600424PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase bufferAgilent600424PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mixNew England BiolabsN0447LdNTP solution mix (10 mM each)
PCR tubesVWR International53509-304PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2 mL microcentrifuge tubeMolecular Bioproducts3453microcentrifuge tubes
PCR purification kitQiagen28106
RsaI New England BiolabsR0167Lrestriction enzyme
CviQINew England BiolabsR0639Lrestriction enzyme
Buffer ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment New England BiolabsM0210LBlunting
streptavidin beads solutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding SolutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing SolutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic standThermoFisher12321DDynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202LT4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase bufferNew England BiolabsB0202ST4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase bufferInvitrogen 46300-018T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometerFisher ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIInew England BiolabsR0151Lrestriction enzyme
sfoInew England BiolabsR0606Lrestriction enzyme
Buffer Bnew England BiolabsB7203SNEB buffer 3.1
Nuclease free waterIntegrated DNA Technologies11-05-01-14
Capillary electrophoresisQiagen9001941QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal CyclerThermo Fisher Scientific4375305PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)EppendorfM10534004Cell Culture Roller Drums
DNA size markerQiagen929559QX size marker (100 - 2,500 bp)
DNA size markerQiagen929554QX size marker (50 - 1,500 bp)
DNA alignment markersQiagen929524QX DNA Alignment Marker
genomc DNANot AvailableNot AvailableSample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments

Riferimenti

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