双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

要約

この原稿では、上流および下流のベクター - 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。

要約

統合サイト（IS）アッセイは、レトロウイルスの組込み部位およびその生物学的意義の研究の重要な要素である。最近のレトロウイルス遺伝子治療研究において、ISアッセイは、次世代シークエンシングと組み合わせて、同じISを共有するクローン幹細胞集団を特徴付ける細胞追跡ツールとして用いられてきた。異なるサンプル内およびその間の再増殖幹細胞クローンの正確な比較のために、アッセイの検出感度、データ再現性およびハイスループット能力は、最も重要なアッセイ特性の1つである。この作業は、双方向IS解析のための詳細なプロトコルとデータ解析のワークフローを提供します。双方向アッセイは、上流および下流の両方のベクター - 宿主接合部を同時に配列決定することができる。従来の単方向ISシークエンス手法と比較して、双方向アプローチはIS検出速度を大幅に改善し、tの両端での統合事象の特徴付けを大幅に改善する彼はDNAを標的にする。ここに記載されているデータ解析パイプラインは、IS配列を参照ゲノム上にマッピングし、シークエンシングエラーを決定する複数の比較ステップを経て、同一のIS配列を正確に同定および列挙する。最適化されたアッセイ手順を使用して、近年、アカゲザルでの移植後に何千もの造血幹細胞（HSC）クローンの詳細な再増殖パターンを発表し、HSC再増殖の正確な時点およびHSCの機能的異種性を初めて示した。霊長類システム。以下のプロトコルは、同一のIS配列を正確に同定および定量する、段階的な実験手順およびデータ解析ワークフローを説明しています。

概要

レトロウイルスは、そのゲノムDNAを様々な部位の宿主ゲノムに挿入する。癌やその他のウイルス性病因の発生に寄与するこのユニークな特性は、これらのウイルスを遺伝子治療や基礎生物学研究のための細胞工学に非常に適したものにするという皮肉な利点があります。外来DNA（ウイルス）が組み込まれている宿主ゲノム上の場所であるウイルス統合サイト（IS）は、統合ウイルスと宿主細胞の両方の運命に重要な意味を持っています。 ISアッセイは、レトロウイルスの組込み部位の選択と病因、癌の発生、幹細胞の生物学、および発達生物学^1,2,3,4を研究するために、様々な生物学的および臨床的研究環境で使用されてきた。低い検出感度、低いデータ再現性、頻繁な相互汚染は現在のおよび計画された研究へのISアッセイの適用を制限する重要な要因である。

多くのIS分析技術が開発されている。リンカー媒介（LM）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR） ⁵ 、逆PCR6、および線状増幅媒介（LAM）PCR7を含む制限酵素に基づく組込み部位アッセイが最も広く使用されている。しかしながら、部位特異的制限酵素の使用は、ISの回収中にバイアスを生成し、回収される制限部位の近傍の組込み体（宿主ゲノムに組み込まれた外来DNA）のサブセットのみを可能にする⁴ 。近年、ベクターISをより包括的に評価するアッセイ技術も導入されている。これらのアッセイは、Muトランスポゾン媒介PCR8、非限定的（nr）-LAM PCR9、タイプII制限酵素-m（re-free PCR） ^{12を用いて} 、ゲノムDNAを断片化し、ISを増幅させるために、遺伝子操作された消化¹⁰ 、機械的せん断¹¹ 、およびランダムヘキサマーベースのPCR現在の技術は、検出感度、ゲノムカバレッジ、標的特異性、ハイスループット容量、アッセイ手順の複雑さ、および標的部位の相対頻度の検出における偏りのレベルが様々である。既存のアッセイの様々な性質およびそれらが使用され得る様々な目的が与えられた場合、最適なアッセイ手法を注意深く選択する必要があります。

この作業では、統合された標的DNAの上流および下流を同時に解析することにより、検出率および配列定量精度を大幅に向上させる双方向アッセイの詳細な実験手順および計算データ解析ワークフローを提供します（図1を参照） ）。このアプローチはまた、レトロウイルス組み込みプロセス（例えば、標的部位重複の忠実度および上流および下流挿入のゲノム配列の変動）を特徴付ける手段である。他の双方向法は、標的DNA11,13,14の両端をクローニングおよび配列決定するために主に使用されている。このアッセイは、十分に確立されたLM-PCR法および計算解析マッピングを使用し、上流および下流接合部の両方を定量するために、ベクター標識クローンのハイスループットおよび再現性のある定量化のために広く最適化されている。 TaqαI酵素による双方向分析は、幹細胞遺伝子治療前臨床試験における高スループットクローン定量化に有用であることが証明されている2,15 。本稿では、より頻繁に使用されるカッター（RsaI / CviQI - モチーフ：GTAC）を用いて、tTaqαIに基づくアッセイと比較してインテグロムを検出する可能性がある。レンチウイルス（NL4.3およびその誘導体）およびガンマ - レトロウイルス（pMXベクター）ベクターIS分析にGTACモチーフ酵素を用いる詳細な実験およびデータ解析手順が記載されている。アッセイに用いたオリゴヌクレオチドを表1に列挙する。補遺資料には、IS配列解析のための社内プログラミングスクリプトが用意されています。

プロトコル

1.上流（左）および下流（右）接合配列ライブラリーの作製

1. DNAリンカー調製：
   1. 100μMLINKER_Aオリゴ（最終：20μM）2μL、100μMLINKER_Bオリゴ（最終：20μM）2μL、5M NaCl（最終：1M）2μLを加えて10μLのリンカーDNA溶液を調製する。 PCRチューブ中に4μLのヌクレアーゼフリー水。リンカー配列については、 表1を参照してください。
   2. リンカーDNA溶液をPCR装置で95℃で5分間インキュベートし、実行プログラムを停止し、PCR装置の電源をオフにします。リンカー溶液を30分間機器に放置し、リンカーDNAをゆっくりと冷却します。リンカーDNA溶液は4℃で保存することができます。
2. LTR特異的ビオチン - プライマー伸長：
   1. UV-Vis分光光度計を使用して、 インビボからのゲノムDNAのDNA濃度および260 / 280nm値を決定する。またはインビトロ実験を含む。 1〜2μgのサンプルゲノムDNAをヌクレアーゼフリーの水を使用してゲノムDNA溶液の最終容量170μLに希釈する。
   2. 10μMのHIV-1特異的ビオチンプライマー（ 表1の L-BPおよびR-BP：4つのレンチウイルス特異的プライマーの合計10μL）2.5μL、20μLの10X熱安定性DNAポリメラーゼ緩衝液、4μLの10mM dNTP（最終：200μMの各dNTP）、3μLの2.5U /μL熱安定性DNAポリメラーゼ、および163μLのゲノムDNAを含む。
      注意：ガンマレトロウイルスベクター（pMXベクター）については、上記の4種類のHIV-1特異的ビオチンプライマーの代わりに2種類の10μMpMX特異的ビオチンプライマー（L-BPおよびR-BP：合計10μL）を5μLずつ使用してください。
   3. 溶液を4本のPCRチューブ（各50μL）に分け、94℃で5分間、56℃で3分間、72℃で5分間分、および保存のために4℃。
   4. すべての4つのPCR反応を2 mLのマイクロ遠心チューブにプールし、PCR精製キットのPCR精製手順に従います。 50μLの溶出緩衝液（キットに含まれている5倍の水で希釈した溶出緩衝液）で溶出する。直ちにステップ1.3.1に進み、溶出したDNAを-20℃で保存します。
3. RsaIおよびCviQI消化
   1. 50μLのDNA（ステップ1.2.4）、10μLの10倍緩衝液A、および2μL（20U）のRsaI酵素を添加することにより、100μLの消化反応を準備する。 PCR装置で37℃で1時間インキュベートする。
   2. 反応に1μL（10U）のCviQI酵素を添加し、PCR装置で25℃で30分間インキュベートする。直ちにステップ1.4.1に進みます。
4. ブラントエンディング：
   1. 2.5μLのDNAポリメラーゼIラージ（クレノウ）断片と2μLの10mM dNTPを含む4.5μL混合液を調製する。転送181; Lの混合物を、ステップ1.3.2のDNA試料と混合する。総容量は102μLになります。ボルテックスしてよく混合し、PCR装置で25℃で1時間インキュベートする。直ちにステップ1.6.1に進みます。
5. ストレプトアビジンビーズの調製：
   1. ストレプトアビジンビーズ溶液を短時間ボルテックスし、50μLを新しい2mLマイクロ遠心チューブに移す。磁気スタンドを用いて上清を除去し、ビーズを結合溶液200μLで洗浄する。
   2. 100μLの結合溶液にビーズを再懸濁し、チューブを磁気スタンドから離して置きます。直ちにステップ1.6.1に進みます。
6. ストレプトアビジンビーズ結合：
   1. 100μLのサンプルDNA（ステップ1.4.1）を100μLの再懸濁ビーズ溶液（ステップ1.5.2）に移し、ピペットで注意深く混合して溶液の発泡を避けます。チューブを回転ホイールまたはローラー上で室温で3時間インキュベートする。
   2. 磁気スタンドを使用してビーズを捕獲し、上清を捨てる。ビーズを400μLの洗浄液で2回洗浄し、400μLの1×T4 DNAリガーゼ緩衝液（ヌクレアーゼフリー水を用いて10倍溶液で希釈）で2回洗浄します。
   3. ビーズを1x T4 DNAリガーゼバッファー（ヌクレアーゼフリー水を使用して10倍溶液から希釈）200μLに再懸濁し、磁気スタンドから離して置きます。直ちにステップ1.7.1に進みます。
7. リンカーライゲーション：
   1. 0.5μLのDNAリンカー（ステップ1.1.2）、10μLの10×T4DNAリガーゼバッファー、20μLの5×T4DNAリガーゼバッファー（25％のポリエチレンを含有する）を混合することにより、2mLのマイクロ遠心チューブ中で400μLの連結反応溶液を調製する。グリコール）、5μLのT4DNAリガーゼ、164.5μLのヌクレアーゼフリー水、および200μLの再懸濁したビーズ（工程1.6.3）を含む。反応チューブを回転ホイールに置き、RT（22℃）で3時間（または16℃/ N）インキュベートする。
   2. ビーズを洗浄液で2回洗浄し、磁気スタンドを用いて1倍熱安定性DNAポリメラーゼ緩衝液（ヌクレアーゼフリー水を用いて10倍溶液から希釈）で2回洗浄する。
   3. ビーズを50μLの1×熱安定性DNAポリメラーゼPCRバッファーに再懸濁し、磁気スタンドから離して置きます。すぐにステップ1.8.1に進むか、4℃で1日まで保存します。
8. 左と右の接合DNAの両方の前増幅：
   1. 10μLの1L-プライマー、10μLの1R-プライマー、20μLの10μMプライマーLink1（表1）、10μLの10X熱安定性DNAポリメラーゼ緩衝液、4μLのステップ1.7.3からの再懸濁したビーズ（50μL）に10mM dNTP（最終：各dNTP200μM）、8μL（20U）熱安定性DNAポリメラーゼ、および88μLのヌクレアーゼフリー水を添加する。
   2. 反応混合物を4つのPCRチューブ（それぞれ501; L）、以下の条件でPCRを行う：94℃2分間のインキュベーション; 94℃で20秒間、56℃で25秒間、および72℃で2分間を25サイクル;最終伸長は72℃で5分間行った。
   3. すべての4つのPCR反応を2 mLのマイクロ遠心チューブにプールし、PCR精製キットのPCR精製手順に従います。 50μLの溶出バッファーで溶出する。
   4. UV-Vis分光光度計を用いてDNA濃度および260 / 280nm値を決定する; DNAは次のステップの準備ができるまで-20℃で保存することができます。ステップ1.9.1 / 1.10.1（オプション）またはステップ1.11.1 / 1.12.1を使用して直接実行してください。
9. 左側の内部DNAアンプリコンを取り外す（オプション）：
   1. ステップ1.8.4のPCR DNA産物100 ngを2 mLのマイクロ遠心チューブに移し、ヌクレアーゼフリーの水を使用して10μLに調整する。
   2. 左側の内部Dを特異的に標的とする制限酵素反応を調製するNAアンプリコン。
      注：反応条件は、酵素の選択によって異なる場合があります。例えば、NL4.3ベースのレンチウイルスベクターから左側の内部DNAを除去する場合は、1μLのpvuII、2μLのバッファーB、および7μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。 PCR装置で37℃で1時間インキュベートする。直ちにステップ1.11.1を実行するか、-20℃で保存します。
10. 右側の内部DNAアンプリコン（オプション）の取り外し：
    1. 手順1.9.1と同じ手順に進んでください。
    2. 右側の内部DNAアンプリコンを特異的に標的とする制限酵素反応を準備する。
       注：例えば、NL4.3ベースのレンチウイルスベクターから右側の内部DNAを除去する場合は、1μLのsfoI 、2μLのバッファーB、および7μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。 PCR装置で37℃で1時間インキュベートする。直ちにステップ1.12.1に進むか、または-20℃で保存します。
11. 左接合特異的増幅：
    1. ステップ1.8.4（またはオプションのステップ1.9.2）からの5μLのDNA、10μMの2Lプライマー（最終：1μM）5μL、10μMのプライマーLink2（1μM）の5μLを混合することにより50μLのPCR反応を調製する。 （最終：1μM）、5μLの10×熱安定性DNAポリメラーゼ緩衝液、1μLの10mM dNTP（最終：200μMの各dNTP）、2μL（5U）の熱安定性DNAポリメラーゼ、および27μLのヌクレアーゼフリー水。
    2. 次の条件でPCRを行う：94℃で3分間インキュベートする; 94℃で20秒間、56℃で25秒間、および72℃で2分間の8~15サイクル;最終伸長は72℃で5分間行った。
       注：増幅されたDNAは-20℃で保存することができます。 *サイクル数の最適化が推奨されます。
    3. PCR精製キットのPCR精製手順に従ってください。 50μLの溶出バッファーで溶出する。 DNA濃度と260 / 280nm値を決定する。
12. 右接合特異的増幅：
    1. 異なるプライマーの使用を除いて、すべての手順は「左接合特異的増幅」（ステップ1.11.1-1.11.3）と同一です。このステップで右接合特異的プライマー（2Rプライマー、 表1参照）を使用する。
13. PCRアンプリコン長変動試験：
    1. 2％アガロースゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を行うことによってPCRアンプリコンの長さの変動を分析する（ 図2 ）。
       注：これは、アッセイ手順の完了を確認し、PCRバンドパターンに基づいてISパターンの大まかな評価を行うために不可欠なステップです。ステップ1.11.3および1.12.3から精製されたPCRアンプリコンは、様々なDNAシーケンシングプラットフォームに使用できます。古典的なチェーンターミネーション（Sanger）シーケンシングまたは次世代シーケンシングのための適切なサンプル調製手順に進みます。 DNAは-20°で保存することができます; C。

2.計算ISシーケンス分析

1. データファイルの準備：
   1. fasta形式の配列データファイル（補足データのTest_data.fa）、ベクターおよびリンカー配列の検索モチーフ用のtsvファイル（補足データのDemultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv）、および制限酵素情報のためのtsvファイルの3つの入力データファイルを準備する（補充データ中の酵素.tsv）。
      注：これらのファイルは、逆多重化、ベクターおよびリンカー配列のトリミング、および内部ベクター配列の除去に必要です（ 図3A ）。計算ワークフローを実装するための詳細な手順は、補足データのREADME.txtファイルに記載されています。
2. 計算分析：
   1. デマルチプレクスとトリミングスクリプトを実行します。
      注：生のシーケンスは、逆多重化とトリムミンのために処理されますgのベクター、リンカーおよびプライマー配列（補足README.txtファイルのSTEP-1を参照）。
   2. BLAST様アライメントツール（BLAT; www.genome.ucsc.edu）を使用して、処理された配列を参照ゲノムにマッピングするために、マッピングコマンド（README.txtファイルのSTEP-2を参照）を実行する。
   3. 定量的IS解析スクリプトを実行します（README.txtファイルのSTEP-3を参照）。
      注：2つの出力ファイル（Initial_count_without_homopolymer_correction.txtとFinal_count.txt）が生成されます。マッピングおよびシーケンス列挙戦略の詳細は、補足データのREADME.txtファイルおよび以前の刊行物2,15に記載されています。

結果

双方向ISアッセイは、上流（左）および下流（右）ベクター宿主接合部（ 図2 ）の両方について、異なるサイズのPCRアンプリコンを生成した。 PCRアンプリコンのサイズは、インテグロムの上流および下流の最も近いGTACモチーフの位置に依存する。このアッセイはまた、内部DNA PCRアンプリコンを産生した：ポリプリン管の近くのレトロウイルス?...

ディスカッション

双方向アッセイは、上流（左）および下流（右）の両方のベクター - 宿主DNA接合配列の同時分析を可能にし、遺伝子治療、幹細胞および癌研究の多くの用途において有用である。 GTACモチーフ酵素（RsaIおよびCviQI）および双方向PCR法を用いることにより、以前のTCGAモチーフ酵素（ TaqαI ）に基づくアッセイ^2,15および他のものと比較して、インテグラム（またはクロー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermostable DNA polymerase	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase buffer	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix	New England Biolabs	N0447L	dNTP solution mix (10 mM each)
PCR tubes	VWR International	53509-304	PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2 mL microcentrifuge tube	Molecular Bioproducts	3453	microcentrifuge tubes
PCR purification kit	Qiagen	28106
RsaI	New England Biolabs	R0167L	restriction enzyme
CviQI	New England Biolabs	R0639L	restriction enzyme
Buffer A	New England Biolabs	B7204S	NEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment	New England Biolabs	M0210L	Blunting
streptavidin beads solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic stand	ThermoFisher	12321D	DynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L	T4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S	T4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometer	Fisher Scientific	S06497	Nanodrop 2000
pvuII	new England Biolabs	R0151L	restriction enzyme
sfoI	new England Biolabs	R0606L	restriction enzyme
Buffer B	new England Biolabs	B7203S	NEB buffer 3.1
Nuclease free water	Integrated DNA Technologies	11-05-01-14
Capillary electrophoresis	Qiagen	9001941	QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375305	PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)	Eppendorf	M10534004	Cell Culture Roller Drums
DNA size marker	Qiagen	929559	QX size marker (100 - 2,500 bp)
DNA size marker	Qiagen	929554	QX size marker (50 - 1,500 bp)
DNA alignment markers	Qiagen	929524	QX DNA Alignment Marker
genomc DNA	Not Available	Not Available	Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments