JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Özet

Entegrasyon Siteleri (IS) tahlilleri, retroviral entegrasyon sitelerinin incelenmesinin ve biyolojik öneminin kritik bir bileşenidir. Yeni retroviral gen terapi çalışmalarında, IS testleri, yeni nesil sıralama ile birlikte, aynı IS'yi paylaşan klonal kök hücre popülasyonlarının karakterize edilmesi için bir hücre izleme aracı olarak kullanılmıştır. Farklı örnekler içindeki ve üzerinde yeniden popülasyon kök hücre klonlarının doğru bir şekilde karşılaştırılması için, tahlil hassasiyeti, veri tekrarlanabilirliği ve tahlilin yüksek verim kapasitesi, en önemli deney kalitesi arasındadır. Bu çalışma, iki yönlü IS analizi için ayrıntılı bir protokol ve veri analizi iş akışı sağlar. İki yönlü test, aynı anda hem yukarı akış hem de aşağı doğru vektör-konak kavşaklarını sıralayabilir. Geleneksel tek yönlü IS sıralama yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, iki yönlü yaklaşım IS bulma oranlarını önemli ölçüde geliştirir ve t her iki ucundaki entegrasyon olaylarının karakterizasyonuDNA'yı hedef alıyor. Burada açıklanan veri analizi boru hattı, IS dizilerinin referans genom üzerine eşlendiği ve sıralama hatalarını belirleyen çok sayıda karşılaştırma adımıyla özdeş IS dizilerini doğru olarak tanımlar ve numaralandırır. Optimize edilmiş bir analiz prosedürü kullanarak son zamanlarda binlerce Hematopoietik Kök Hücre (HSC) klonunun rhesus makaklarda transplantasyonun ayrıntılı repopülasyon kalıplarını yayınladık ve ilk kez HSC repopülasyonunun kesin zaman noktasını ve HSC reprodüksiyonunun fonksiyonel heterojenliğini gösterdik. Primat sistemi. Aşağıdaki protokol, özdeş IS dizilerini doğru olarak tanımlayan ve nicelik kazandıran adım adım deneysel işlem ve veri analizi iş akışını tanımlar.

Giriş

Retrovirüsler, genomik DNA'larını çeşitli yerlerde konukçu genomuna yerleştirir. Kanserlerin ve viral patogenezin diğer formlarının gelişmesine katkıda bulunabilecek bu benzersiz mülk, bu virüsleri, gen terapisi ve temel biyoloji araştırmaları için hücresel mühendisliğe oldukça uysal hale getirmenin ironik yararımına sahiptir. Viral Entegrasyon Sitesi (İS) - yabancı bir DNA'nın (virüsün) entegre olduğu konak genomu üzerindeki yeri hem entegre virüslerin hem de konakçı hücrelerin kaderi için önemli etkilere sahiptir. IS tahlilleri, retroviral entegrasyon bölgesi seçimini ve patogenezini, kanser gelişimini, kök hücre biyolojisini ve gelişimsel biyolojiyi incelemek için çeşitli biyolojik ve klinik araştırmalar ortamında kullanılmıştır. 1 , 2 , 3 , 4 . Düşük algılama hassasiyeti, zayıf veri tekrarlanabilirliği ve sıkça çapraz bulaşmaIS tahlillerinin mevcut ve planlanan çalışmalara uygulanmasını sınırlayan başlıca faktörler.

Pek çok IS analiz teknolojisi geliştirildi. Bağlayıcı-Aracılı (LM) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 5 , ters PCR 6 ve Lineer-Amplifikasyon-Aracılaştırılmış (LAM) PCR 7 dahil olmak üzere sınırlama enzimine dayalı entegrasyon bölgesi testleri en çok kullanılanlardır. Bununla birlikte, alana özgü kısıtlama enzimlerinin kullanılması, IS'nin alınması esnasında bir önyargı üretir ve kısıtlama bölgesi çevresinde yalnızca integromların bir alt kümesinin (konakçı genomuna entegre edilmiş yabancı bir DNA'nın) elde edilmesine izin verir 4 . Vektör IS'yi daha kapsamlı olarak değerlendiren tahlil teknolojileri de son yıllarda tanıtıldı. Bu tahliller, Mu transpozon aracılı PCR 8 , nonrestrictif (nr) -LAM PCR 9 , tip-II kısıtlama enzimi-m( 10) , mekanik kesme ( 11 ) ve genomik DNA'ları parçalamak için Rasgele Heksamer'e Dayalı PCR (Re-free PCR) ( 12 ) kullanılarak çoğaltılabilir. Mevcut teknolojiler, tespit hassasiyeti, genom kapsama alanı, hedef özgünlüğü, yüksek verimli kapasite, analiz prosedürlerinin karmaşıklığı ve hedef bölgelerin göreceli frekanslarının saptanmasında önyargılar olmak üzere farklı seviyelerde değişir. Mevcut tahlillerdeki değişen nitelikler ve bunların kullanılabileceği çeşitli amaçlar göz önüne alındığında, optimal tahlil yaklaşımı dikkatle seçilmelidir.

Bu çalışma, entegre hedef DNA'nın yukarı akış ve akış aşağısında eşzamanlı olarak analiz ederek bulma hızlarını ve dizi nicelik doğruluğunu önemli ölçüde geliştiren çift yönlü bir analiz için ayrıntılı deneysel prosedürleri ve hesaplama veri analizi iş akışını sağlar (bakınız, tahlil prosedürlerinin şematik bir görünümü için Şekil 1). ). Bu yaklaşım aynı zamandaRetroviral entegrasyon sürecini karakterize etmek için araçlar (örneğin, hedef bölge duplikasyonunun geçerliliği ve yukarı akış ve aşağı akış eklemelerinin genomik sekanslarındaki değişiklikler). Diğer iki yönlü yöntemler öncelikle hedef DNA 11 , 13 , 14'ün her iki ucunun klonlanması ve dizilmesi için kullanılmıştır. Bu tahlil, iyi kurulmuş LM-PCR yöntemi ve hesaplama analizi haritalaması kullanılarak ve hem yukarı hem de aşağı doğru kavşakların nicelleştirilmesi için vektör işaretli klonların yüksek verimli ve tekrarlanabilir kantifikasyonu için kapsamlı şekilde optimize edilmiştir. TaqαI enzimi ile çift yönlü analiz, klinik öncesi çalışmalar 2 , 15'de kök hücre gen tedavisinde yüksek verimli klonal niceleme için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu makale, daha sık kesici (RsaI / CviQI - motif: GTAC) kullanılarak tTaqαI tabanlı bir teste kıyasla integromlar tespit etme şansı . Lentiviral (NL4.3 ve türevleri) ve gamma-retroviral (pMX vektörleri) vektör IS analizi için GTAC motif enzimlerini kullanan ayrıntılı deneysel ve veri analizi işlemleri anlatılmıştır. Deneyde kullanılan oligonükleotidler Tablo 1'de listelenmiştir. IS dizisi analizi için bir dahili programlama betiği ek belgede sağlanmaktadır.

Protokol

1. Upstream (sol) - ve Downstream (sağ) -Junction Sıralı Kütüphaneleri Oluşturma

  1. DNA bağlayıcı preparatı:
    1. 100 uM LINKER_A oligos (son: 20 uM) 2 mcL, 100 uM LINKER_B oligos (final: 20 uM) 2 mcL, 5 M NaCl (final: 1M) 2 mcL ve 2 mcL ekleyerek 10 uL linker DNA çözeltisi hazırlayın ve PCR tüpünde 4 uL nükleaz içermeyen su. Bağlayıcı dizileri için Tablo 1'e bakın.
    2. Linker DNA çözeltisini 95 ° C'de bir PCR aletinde 5 dakika inkübe edin, çalıştırma programını durdurun ve PCR aletinin gücünü kapatın. Linker DNA'sını yavaşça soğutmak için linker solüsyonunu 30 dakika boyunca cihazda bırakın. Bağlayıcı DNA çözeltisi, 4 ° C'de saklanabilir.
  2. LTR'ye özgü biyotin-primer uzantısı:
    1. İn vivo DNA konsantrasyonunu ve genomik DNA'nın 260/280 nm değerlerini belirlemek için UV-Vis spektrofotometre kullanınVeya in vitro deneyler. Nükleaz içermeyen su kullanarak 170 μL genomik DNA çözeltisinin son bir hacmine 1-2 mikrogram örnek genomik DNA seyreltin.
    2. 10 uM HIV-1'e spesifik biotin primerleri ( Tablo 1'de L-BP'ler ve R-BP'ler): 2.5 μL'yi, dört lentivirene spesifik primerler için toplam 10 uL toplam), 10X'lik termostabil 20 mcL'yi karıştırarak 200 μL PCR reaksiyonu hazırlayın DNA polimeraz tamponu, 4 mcL 10 mM dNTP (son: 200 uM her dNTP), 3 uL 2.5 U / μL termostabil DNA polimeraz ve 163 μL genomik DNA.
      NOT: Gamaretroviral vektörler (pMX vektörleri) için, yukarıdaki dört HIV-1'e spesifik biyotin primerleri yerine iki adet 10 uM pMX spesifik biyotin primeri (L-BP ve R-BP: toplam 10 uL) her biri 5 uL kullanın.
    3. Çözümü dört PCR tüpüne bölün (her biri 50 mcL) ve aşağıdaki koşullar altında tek bir genleşme döngüsü uygulayın: 94 ° C'de 5 dakika, 56 ° C'de 3 dakika, 72 ° C'de 5Dk, depolama için 4 ° C.
    4. Dört PCR reaksiyonunu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne dökün ve PCR saflaştırma kitinin PCR saflaştırma prosedürünü izleyin. 50 uL elüsyon tamponu (kitte verilen 5 kat suyla seyreltilmiş elüsyon tamponu) ile elute edin. Adım 1.3.1 ile derhal gidiniz veya elute edilen DNA'yı -20 ° C'de saklayınız.
  3. RsaI ve CviQI sindirimi
    1. 50 mcL DNA (adım 1.2.4'ten), 10 uL 10x tampon A ve 2 uL (20 U) RsaI enzimi ekleyerek 100 μL sindirim reaksiyonu hazırlayın. Bir PCR aletinde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    2. Reaksiyona 1 uL (10 U) CviQI enzimi ekleyin ve bir PCR aleti içinde 25 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Hemen adım 1.4.1 ile devam edin
  4. Kör bitiş:
    1. 2.5 μL DNA Polimeraz I büyük (klenow) fragmanı ve 2 uL 10 mM dNTP içeren 4.5-μL karışımı hazırlayın. Transfer 1Adım 1.3.2'deki DNA örneğine 81 L karışım Toplam hacim 102 μL olacaktır. Vorteksleyerek iyice karıştırın ve bir PCR aletinde 25 ° C'de 1 saat inkübe edin. Hemen adım 1.6.1 ile devam edin.
  5. Streptavidin boncuklarının hazırlanması:
    1. Kısaca streptavidin boncuk çözeltisini vorteksleyin ve yeni bir 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne 50 mcL aktarın. Manyetik stand kullanarak süpernatantı çıkarın ve boncukları 200 μL bağlama solüsyonu ile yıkayın.
    2. Bağlayıcı çözeltinin 100 μL'sinde boncukları tekrar süspanse edin ve boruyu manyetik standın uzağına yerleştirin. Hemen adım 1.6.1 ile devam edin.
  6. Streptavidin boncuk bağlama:
    1. 100 μL yeniden süspansiyon haline getirilmiş boncuk çözeltisine (adım 1.5.2) numune DNA'sının 100 μL'sini (adım 1.4.1) aktarın ve çözeltinin köpürmesini önlemek için pipetle dikkatlice karıştırın. Tüp, dönen bir tekerlek veya silindir üzerinde oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin.
    2. Boncukları yakalamak ve süpernatanı atmak için manyetik standı kullanın. Boncukları 400 μL yıkama çözeltisi ile iki kez yıkayın ve 400 μL 1x T4 DNA ligaz tamponu (nükleaz içermeyen su ile 10X çözeltiden sulandırılmış) içinde iki kez yıkayın.
    3. 200 μL 1x T4 DNA ligaz tampon (nükleaz ücretsiz su kullanarak 10X çözüm sulandırılmış) boncuk tekrar süspanse edin ve manyetik stand uzağa yerleştirin. Hemen adım 1.7.1 ile devam edin.
  7. Linker ligasyonu:
    1. DNA bağlayıcı 0.5 mcL (adım 1.1.2), 10 x T4 DNA ligaz tampon 10 mcL, 5X T4 DNA ligaz tampon 20 mcL (% 25 polietilen içeren karıştırarak 2 mL mikrosantrifüj tüp içinde 400 mcL ligasyon reaksiyon çözümü hazırlayın Glikol), 5 uL T4 DNA ligazı, 164.5 uL nükleaz içermeyen su ve 200 uL tekrar süspansiyon haline getirilmiş boncuklar (basamak 1.6.3). Reaksiyon tüpünü döndürme tekerleğine yerleştirin ve oda sıcaklığında (22 ° C) 3 saat (veya 16 ° C / N) inkübe edin.
    2. Boncukları yıkama çözeltisi ile iki kez yıkayın ve manyetik stand kullanarak, 1X ısıya dayanıklı DNA polimeraz tamponu (nükleaz içermeyen su ile 10x çözeltiden seyreltilmiş) ile iki kez yıkayın.
    3. Boncukları 50 μL 1x termostabil DNA polimeraz PCR tamponu içinde süspansiyon haline getirin ve manyetik standın uzağına yerleştirin. Hemen adım 1.8.1 ile devam edin veya bir gün süreyle 4 ° C'de saklayın.
  8. Sol ve sağ bağlantı DNA'sının ön amplifikasyonu:
    1. 10 uM 1L primer 10 mcL, 10 mcM 1R primer 10 mcL, 10 uM primer Link1 (Tablo 1) 20 mcL, 10 uM termostabil DNA polimeraz tampon 10 mcL, 4 mcL 10 mcL ekleyerek 200 μL PCR reaksiyon hazırlayın Adım 1.7.3'teki yeniden askıya alınmış boncuklara (50 uL), 10 mM dNTP'ler (her dNTP'den 200 uM), 8 uL (20 U) termostabil DNA polimeraz ve 88 uL nükleaz içermeyen su ilave edildi.
    2. Reaksiyon karışımını 4 PCR tüpüne (her biri 501; L) ve aşağıdaki koşullarla PCR gerçekleştirin: 94 ° C inkübasyon 2 dakika boyunca; 20 saniye için 94 ° C, 25 saniye için 56 ° C ve 2 dakika boyunca 72 ° C'lik 25 döngü; Ve son uzantı 72 ° C'de 5 dakika.
    3. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 4 PCR reaksiyonu yapın ve PCR saflaştırma kitinin PCR saflaştırma prosedürünü uygulayın. 50 uL elüsyon tamponu ile elute edin.
    4. Bir UV-Vis spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve 260/280-nm değerlerini belirleyin; DNA sonraki aşamaya gelene kadar -20 ° C'de saklanabilir. 1.9.1 / 1.10.1 adımlarıyla (isteğe bağlı) veya doğrudan 1.11.1 / 1.12.1 adımlarıyla devam edin.
  9. Sol taraftaki dahili DNA amplikonunun çıkarılması (isteğe bağlı):
    1. Adım 1.8.4'ten 100 ng PCR DNA ürününü 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve nükleazsız su kullanarak hacmi 10 μL'ye ayarlayın.
    2. Sol taraftaki iç D'yi spesifik olarak hedefleyen bir kısıtlama enzimi reaksiyonu hazırlayınNA amplikon.
      NOT: Tepkime koşulu, enzim seçimine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Örneğin, sol taraftaki dahili DNA'yı NL4.3'e dayalı lentiviral vektörlerden çıkarırken 1 μL pvuII, 2 μL Tampon B ve 7 μL nükleaz içermeyen su ilave edin. Bir PCR aletinde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Hemen adım 1.11.1 ile devam edin veya -20 ° C'de saklayın.
  10. Sağ taraftaki dahili DNA amplikonunun çıkarılması (isteğe bağlı):
    1. Adım 1.9.1'deki gibi devam edin.
    2. Sağ taraftaki dahili DNA amplikonunu spesifik olarak hedefleyen bir kısıtlama enzimi reaksiyonu hazırlayın.
      NOT: Örneğin, sağ taraftaki dahili DNA'yı NL4.3'e dayalı lentiviral vektörlerden çıkarırken, 1 μL sfoI , 2 μL Tampon B ve 7 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. Bir PCR aletinde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Hemen adım 1.12.1 ile devam edin veya -20 ° C'de saklayın.
  11. AyrıldıBirleşime özgü amplifikasyon:
    1. Adım 1.8.4'ten 5 μL DNA (veya isteğe bağlı adım 1.9.2'den), 10 uM 2L-primer (final: 1 μM) 5 μL, 10 uM primer Link2'nin 5 μL'si karıştırılarak 50 μL PCR reaksiyonu hazırlayın (Nihai: her bir dNTP'nin 200 uM'si), 2 mcL (5 U) termostabil DNA polimeraz ve 27 uL nükleaz içermeyen (nihai: 1 uM) 5 mcL 10x termostabil DNA polimeraz tamponu, 1 uL 10 mM dNTP'ler Su.
    2. PCR'ı aşağıdaki koşullarla gerçekleştirin: 3 dakika 94 ° C inkübasyon; 20 saniye için 94 ° C, 25 saniye için 56 ° C ve 2 dakika boyunca 72 ° C'lik 8-15 döngü; Ve son uzantı 72 ° C'de 5 dakika.
      NOT: Amplified DNA, -20 ° C'de saklanabilir. * Çevrim sayısı optimizasyonu önerilir.
    3. PCR saflaştırma kitinin PCR saflaştırma prosedürünü izleyin. 50 uL elüsyon tamponu ile elute edin. DNA konsantrasyonunu ve 260/280 nm değerlerini belirleyin.
  12. Sağ kavşağa özgü amplifikasyon:
    1. Bütün prosedürler, farklı primerlerin kullanılması haricinde "Sol kavşağa spesifik amplifikasyon" (adım 1.11.1-1.11.3) ile aynıdır; Bu aşamadaki doğru bağlantıya özgü primeri (2R-primeri, bkz. Tablo 1 ) kullanın.
  13. PCR amplikon uzunluk varyasyonu testi:
    1. PCR amplikon uzunluk varyasyonları% 2 agaroz jel elektroforezi veya kapiler elektroforez uygulayarak analiz edin ( Şekil 2 ).
      NOT: Bu, tahlil prosedürlerinin tamamlandığını teyit etmek ve PCR band örüntülerine dayalı olarak IS kalıplarının kaba bir şekilde değerlendirilmesi için önemli bir adımdır. Adım 1.11.3 ve 1.12.3'teki saflaştırılmış PCR amplikonu, çeşitli DNA sıralama platformları için kullanılabilir. Klasik zincir sonlandırma (Sanger) dizilimi veya yeni nesil sıralama için uygun örnek hazırlama prosedürlerini uygulayın. DNA -20 ° C'de saklanabilirC.

2. Hesaplamalı IS Sırası Analizi

  1. Veri dosyalarının hazırlanması:
    1. Üç girdi veri dosyasını hazırlayın: fasta formatlı bir veri dosyası (Ek veri olarak Test_data.fa), vektör ve linker dizileri için arama motifleri için bir tsv dosyası (ek veride Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) ve kısıtlama enzimi bilgisi için bir tsv dosyası (Ek veri Enzyme.tsv).
      NOT: Bu dosyalar, demultipleksleme, vektör ve bağlayıcı dizilerini düzeltme ve iç vektör dizilerini kaldırma için gereklidir ( Şekil 3A ). Hesaplamalı iş akışını uygulamak için ayrıntılı adım adım talimatlar, tamamlayıcı verilerdeki README.txt dosyasında sağlanmaktadır.
  2. Hesaplamalı analiz:
    1. Çoğaltma ve kırpma komut dosyalarını çalıştırın.
      NOT: Ham dizilim, çoklama ve trimmin için işlenecektirG vektör, bağlayıcı ve primer dizileri (ek README.txt dosyasındaki ADIM-1'e bakın).
    2. İşlenmiş dizileri bir BLAST benzeri hizalama aracı (BLAT; www.genome.ucsc.edu) kullanarak referans genom üzerine eşleştirmek için mapping komutunu çalıştırın (bkz. README.txt dosyasındaki STEP-2).
    3. Kantitatif IS analiz komut dosyasını çalıştırın (README.txt dosyasındaki ADIM-3'e bakın).
      NOT: İki çıktı dosyası (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt ve Final_count.txt) oluşturulur. Haritalama ve dizi numaralandırma stratejileri hakkında daha fazla bilgi, ek verilerin README.txt dosyasında ve daha önceki yayınlar 2 , 15'de bulunabilir.

Sonuçlar

Çift yönlü IS tahlili, yukarı akış (sol) ve aşağı akış (sağ) vektör konakçı kavşakları için farklı boyutlarda PCR amplikonları üretti ( Şekil 2 ). Bir PCR amplikonunun boyutu, bir integramdan yukarı ve aşağı doğru en yakın GTAC motifinin konumuna bağlıdır. Deney ayrıca dahili DNA PCR amplikonları üretti: sırasıyla sol ve sağ bağlantıda PCR sırasında polipurin yoluna yakın retroviral sekanslar ve primer bağlanma böl...

Tartışmalar

Çift yönlü analiz hem yukarı akış (sol) hem de akış aşağı (sağ) vektör-konak DNA birleştirici dizilerinin eşzamanlı analizini mümkün kılar ve bir dizi gen terapisi, kök hücre ve kanser araştırma uygulamaları için yararlıdır. GTAC motif enzimlerinin (RsaI ve CviQI) ve çift yönlü PCR yaklaşımının kullanılması, önceki TCGA motif enzimine ( TaqαI ) dayalı tahliller 2 , 15 ve diğerlerine kıy...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Finansman, Ulusal Sağlık Teşvik Kuruluşları R00-HL116234, U19 AI117941 ve R56 HL126544 tarafından sağlandı; Ulusal Bilim Vakfı Grant DMS-1516675; Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Ve KRIBB girişim programı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Thermostable DNA polymeraseAgilent600424PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase bufferAgilent600424PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mixNew England BiolabsN0447LdNTP solution mix (10 mM each)
PCR tubesVWR International53509-304PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2 mL microcentrifuge tubeMolecular Bioproducts3453microcentrifuge tubes
PCR purification kitQiagen28106
RsaI New England BiolabsR0167Lrestriction enzyme
CviQINew England BiolabsR0639Lrestriction enzyme
Buffer ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment New England BiolabsM0210LBlunting
streptavidin beads solutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding SolutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing SolutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic standThermoFisher12321DDynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202LT4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase bufferNew England BiolabsB0202ST4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase bufferInvitrogen 46300-018T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometerFisher ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIInew England BiolabsR0151Lrestriction enzyme
sfoInew England BiolabsR0606Lrestriction enzyme
Buffer Bnew England BiolabsB7203SNEB buffer 3.1
Nuclease free waterIntegrated DNA Technologies11-05-01-14
Capillary electrophoresisQiagen9001941QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal CyclerThermo Fisher Scientific4375305PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)EppendorfM10534004Cell Culture Roller Drums
DNA size markerQiagen929559QX size marker (100 - 2,500 bp)
DNA size markerQiagen929554QX size marker (50 - 1,500 bp)
DNA alignment markersQiagen929524QX DNA Alignment Marker
genomc DNANot AvailableNot AvailableSample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments

Referanslar

  1. Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
  2. Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
  3. Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
  4. Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
  5. Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
  6. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
  7. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
  8. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  10. Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
  11. Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  12. Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
  13. Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
  14. Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
  15. Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
  16. Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
  17. Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  18. Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
  19. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
  22. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
  23. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 124Retrovir sEntegrasyon siteleriYeni nesil s ralamaRetroviral gen terapisiK k h crelerKanserlerH cresel barkodlamaBiyoenformatik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır