מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Summary

נוגדנים נטרול שפעת לתאם עם הגנה של דלקות שפעת. מבחני Microneutralization למדוד נוגדנים נטרול של sera אנושי, משמשים לעתים קרובות על שפעת אנושית סרולוגיה. אנו מתארים וזמינותו של microneutralization באמצעות MDCK-SIAT1 תאים כדי למדוד נטרול נוגדן titers עכשווי וירוסים A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a בעקבות חיסון שפעת או זיהום.

Abstract

נטרול נוגדנים נגד hemagglutinin (HA) של וירוסים שפעת נחשבים במנגנון החיסון הראשי בקורלציה עם הגנה על דלקות שפעת. מבחני Microneutralization (MN) משמשים לעתים קרובות כדי למדוד את התגובות נוגדן נטרול סרה אנושי לאחר חיסון שפעת או זיהום. תאים Madine דארבי הכלבי הכליה (MDCK) הם המצע תא נפוץ עבור מבחני MN. עם זאת, כעת ומגבלותיהם שפעת A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a וירוסים שרכשו שינו קולטן איגוד ירידה לפרטים. הקו תא MDCK-SIAT1 עם גלקטוז sialic מוגבר של α-2, 6 moieties על פני הוכיחה לספק infectivity משופר, שכפולי נאמן יותר מאשר תאים MDCK המקובלת עבור וירוסים A(H3N2) עכשווי אלה. כאן, אנו מתארים assay MN באמצעות תאים MDCK-SIAT1 זה מוטבה כדי לכמת נטרול titers נוגדנים אלה וירוסים A(H3N2) עכשווי. ב פרוטוקול זה, חום לא פעיל סרה המכיל נוגדנים נטרול הם תחילה באופן סדרתי מדולל, ואז מתפשט 100 TCID50/טוב של שפעת וירוסים A(H3N2) כדי לאפשר נוגדנים ב sera כדי לאגד וירוסים. תאים MDCK-SIAT1 ואז מוסיפים את וירוס-נוגדן, מודגרות במשך 18-20 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ כדי לאפשר A(H3N2) וירוסים להדביק תאים MDCK-SIAT1. לאחר דגירה לילה, צלחות קבועים, הכמות של וירוס בכל טוב הוא לכמת על ידי assay מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) באמצעות נגד שפעת נוגדנים חד-שבטיים נוקלאופרוטאין (NP). נטרול כייל נוגדנים מוגדר את הדדיים של הגבוהה ביותר בסרום המספק ≥50% עיכוב של וירוס infectivity.

Introduction

וירוסים שפעת להמשיך לגרום תחלואה ותמותה באוכלוסייה האנושית בכל שנה. חה הוא גליקופרוטאין השטח הגדולות של וירוסים שפעת. נטרול נוגדנים מיקוד HA הן מנגנון החיסון הראשי זה לא מופיע עם הגנה של שפעת זיהום^1,2. Hemagglutination עיכוב (איץ ' אי) מבחני מבחני MN שתי שיטות בשימוש נרחב כדי למדוד את התגובות נוגדן סרה אנושי לאחר זיהום או חיסון שפעת³בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. וזמינותו HI מודד נוגדן עיכוב של וירוס hemagglutination של כדוריות דם אדומות, ונחשב וזמינותו של הפונדקאית. בניגוד HI, וזמינותו MN יכול למדוד ישירות את רמות נוגדנים ב סרה האדם לנטרל השפעת זיהום תרביות תאים. MDCK תאים משמשים לעתים קרובות בבידוד וירוס שפעת, MN מבחני⁴.

וירוסים שפעת עוברים כל הזמן להיסחף antigenic ו- shift לחוצים, רכישת מוטציות ב- HA חלבונים אשר יכול לשנות יחודיות איגוד קולטן של וירוסים. מאז 2014, אשכולות חדשים של וירוסים A(H3N2) בקע, המשיך לזרום עד העונה הנוכחית. הרוב המכריע של וירוסים אלה שייכים גנטי קבוצה 3C.2a ו- 3C.3a מבוסס על ניתוח פילוגנטי של החלבונים HA. רבים של וירוסים 3C.2a במחזור הייתה ירידה ביכולת hemagglutinate כדוריות דם אדומות, ולכן לא יכול להיות מאופיין על ידי מבחני HI⁵. ניטרול מבחני יש להשתמש כדי למדוד את תגובות נוגדנים אלה וירוסים לא hemagglutinate⁶. יתר על כן, מחקרים הראו כי וירוסים A(H3N2) עכשווי אלה שינו המאפיינים איגוד קולטן בהשוואה וירוסים A(H3N2) קודמות, נוטים להצטבר תרבות הותאם מוטציות, פולימורפיזם כאשר passaged בתא במבחנה תרבויות^7,8,9. לעומת תאים MDCK המקובלת, MDCK-SIAT1 הוא קו תא שפותחה על ידי. Matrosovich et al. באמצעות תרביות תאים יציב של תאים MDCK עם cDNA של האדם α2, 6-sialtransferase (SIAT1). הקו תא הזה מבטא כמויות גדולות יותר של α2, moieties גלקטוז 6-sialic, ירידה בכמויות של α2, 3-sialic חומצה moieties מאשר ההורה תאים MDCK¹⁰. תאים MDCK-SIAT1 הראו לשפר בידוד המחירים עבור וירוסים A(H3N2) לעומת תאים MDCK¹¹. לאחרונה, לין. et al. דיווח כי החדשים המתגלים 3C.2a ו- 3C.3a אנוש A(H3N2) שפעת וירוסים, נאמן יותר שכפולי וירוס, infectivity וירוס טוב יותר הושגו כאשר וירוסים היו בתרבית בשורות תא MDCK-SIAT1, לעומת תאים MDCK⁷. לפיכך, התאים MDCK-SIAT1 מתאים יותר ב- MN מבחני לאפיון נוגדנים התגובות האשכולות האחרונים של וירוסים A(H3N2).

כאן נתאר וזמינותו MN באמצעות תאים MDCK-SIAT1 כדי למדוד את תגובות נוגדנים 3C.2a עכשווי ווירוסים A(H3N2) 3C.3a של sera אנושי. וירוסים גדל או ביצים או תאים יכולים לשמש זה וזמינותו. חום סרה מוחלש המכיל נוגדנים נטרול תחילה בדילול באופן סדרתי, ואז מתפשט 100 TCID50/טוב של שפעת וירוס A(H3N2) כדי לאפשר נוגדנים ב sera כדי לאגד הוירוס. תאים MDCK-SIAT1 ואז מוסיפים את וירוס-נוגדן, מודגרות במשך 18-20 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ כדי לאפשר את הוירוס A(H3N2) להדביק תאים MDCK-SIAT1, לשכפל. לאחר דגירה לילה, הלוחיות הן קבועות, הכמות של וירוס היטב כל זה לכמת על ידי אליסה באמצעות נוגדנים חד-שבטיים נגד שפעת A NP. הגילוי של NP מצביע על הנוכחות של זיהום בנגיף ואת העדר נטרול נוגדנים. נטרול כייל נוגדנים מוגדר את הדדיים של הגבוהה ביותר בסרום המספק ≥ 50% עיכוב של וירוס infectivity.

Protocol

צריך להיות מטופל כל וירוסים שפעת על פי דרישות רמת אבטחה המתאימה (BSL-2 ומעלה) כמשמעותו אבטחה על Microbiological, מעבדות ביו (BMBL)¹².

1. הכנת ריאגנטים, חומר המוצא

1. להכין MDCK-SIAT1 תאים, תא סטרילי תרבות בינוני
   1. להכין את MDCK-SIAT1 תא תרבות בינוני באמצעות 500 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם גלוקוז גבוהות, 10% v/v חום להשבית סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין, 1 מ מ נתרן פירובט, 1 מ"ג/מ"ל G418 סולפט (למשל, geneticin), ו פניצילין U/ml 100 עם סטרפטומיצין µg/mL 100 (אופציונלי). לחטא על-ידי סינון דרך קרום 0.2 µM גודל הנקבוביות. G418 סולפט נוסף כדי להבטיח יציבות פלסמיד בתאים MDCK-SIAT1.
   2. להכין את הקו תא MDCK-SIAT1 . 162 ס' ' מ²- תרביות רקמה flask(s) המכיל 30 מ של התא סטרילי תרבות המדיה, זרע מבחנות עם 2-2.5 x 10 תאים⁶ MDCK-SIAT1, דגירה ב 37 ° C 5% CO₂ 2 ימים; זה ישמש עבור MN ונחישות זיהומיות מינון (TCID) של תרביות רקמה מבחני.
      הערה: MDCK-SIAT1 תאים בחביבות שסופקו על-ידי ד ר מ' Matrosovich, מרבורג שבגרמניה¹⁰. הקו תא הזה ניתן להשיג מסחרית (ראה את הטבלה של חומרים).
2. להכין וירוס סטרילי הפצת מדיה באמצעות 500 מ"ל של גלוקוז גבוהות DMEM 0.3% אלבומין שור (BSA) שבר V, U/mL 100 פניצילין, סטרפטומיצין µg 100/mL, ו- 20 מ מ HEPES. לחטא על-ידי סינון דרך קרום 0.2 µM גודל הנקבוביות.
3. להכין 0.75% (v/v) תאי דם אדומים שפן (gpRBCs) בפוספט buffered תמיסת מלח (PBS) המכיל PBS 0.01 M, ב- pH 7.2.
4. הכינו את וירוס סטרילי diluent באמצעות DMEM גלוקוז גבוהות, 1% V שבר אלבומין שור (BSA), פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg 100/mL, ו- 20 מ מ HEPES. לחטא על-ידי סינון עם 0.2 µm גודל הנקבוביות קרום, ולהתכונן טרי כל וזמינותו.
5. הכינו את תא קר מקבע כמו אצטון קר 80% ב- PBS (0.01 M PBS, pH 7.2).
6. להכין את לשטוף את המאגר באמצעות PBS (0.01 M PBS pH 7.2) ו- 0.3% (v/v) tween-20.
7. הכנת נוגדנים diluent באמצעות PBS (0.01 M PBS, pH 7.2), 0.3% (v/v) tween-20, ו- 5% שומן לייבש חלב.
8. להשתמש נגד שפעת A NP העכבר נוגדנים חד שבטיים שיבוט A1 ו A3 בריכה נוגדן ראשוני. לדלל ב נוגדן diluent-ריכוז אופטימלי כפי שנקבע על ידי טיטור.
9. שימוש עז העכבר אנטי איג מצומדת אל הסוס צנון peroxidase (HRP) כמו נוגדנים משניים. לדלל ב נוגדן diluent-ריכוז אופטימלי כפי שנקבע על ידי טיטור.
10. הכינו את המצע peroxidase באמצעות o- phenylenediamine dihydrochloride (OPD) במאגר ציטראט פוספט 0.05 M ב- pH 5. הכנת מאגר ציטראט 0.05 M פוספט על ידי המסת 1 כמוסה/100 mL יונים H₂O. להמיס OPD 1 טבליה (10 מ ג) / 20 מ של פוספט מאגר ציטראט מיד לפני השימוש.
11. שתשמש OPD להפסיק פתרון0.5 M של חומצה גופרתית. להוסיף 28 מ"ל של 18 מ' מניות חומצה גופרתית יונים 972 mL H₂O בשכונה כימי.
12. הטיפול של האדם ושל בעלי החיים סרה
    1. חום להשבית את האדם סרה המשמשים את מבחני MN באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני וזמינותו. להשתמש באופן מיידי או אם יש צורך, חנות הקרת sera ב 4 ° C עבור לא יותר מ 24 שעות; אם מרשו אחסון נדרש, לאחסן סרה קפוא ב-20 ° C או קר.
    2. לטיפול של sera בעלי חיים המשמשים את מבחני MN עם קולטן השמדת האנזים (RDE), חום בטל לפני וזמינותו כדלקמן.
       1. להפשיר את סרה באמבט מים של הלעפה תרוטרפמט 37 ומניחים על קרח. לערבב 1 נפח של דגימת נסיוב בעלי חיים עם שלושה כרכים של RDE. דגירה-37 הלעפה תרוטרפמט עבור h 18-20.
       2. חום להשבית את סרה RDE שטופלו ב 56 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות להוסיף 6 כרכים של PBS, pH 7.2 כל מדגם עבור דילול טרום סופי של 1:10. אם יש צורך, לאחסן המופשרים sera ב 4 ° C עבור לא יותר מ 24 שעות; אם מרשו אחסון נדרש, לאחסן סרה קפוא ב-20 ° C או קר.
          הערה: בעלי חיים סרה עשוי להכיל glycans חומצה sialic שונים אשר עשויים לאגד משמשת של וירוסים שפעת ומעכבות את הכריכה של נגד שפעת ספציפי-HA נוגדנים. לכן, יש צורך RDE מתייחסים כל חיה שרה לפני מבחני MN כדי להסיר קלסרים HA ויראלי אלה שאינם ספציפיים הדוגמאות סרום.

2. מעבר של תרבית תאים MDCK-SIAT1

הערה: יש לבצע תרביות תאים כל בבטיחות הביולוגי הקבינט למניעת זיהום.

1. Decant התרבות התא האמצעי טפט תא ב 162 ס' ' מ² מבחנות. Trypsinize התאים על ידי שטיפה של טפט עם טריפסין-EDTA. הוסף 5 מ ל טריפסין-EDTA כדי לכסות את טפט התא. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ עד טפט לניתוק (5-10 דקות). להוסיף 15 מ"ל של MDCK-SIAT1 תא תרבות המדיה כל בקבוק המכיל תאים trypsinized, פיפטה למעלה ולמטה כדי בתאים נפרדים.
2. השתמש hemocytometer. trypan כחול כדי לקבוע שהתא נחשב ואת הכדאיות. זרע לתאים חדשים 162 ס' ' מ² תרביות רקמה מבחנות המכילות 30 מ של התא תרבות המדיה עם 2-2.5 x 10⁶ תאים /flask, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO₂ 2 ימים לשימוש במבחני TCID ו- MN. זרע תאים על 4-5 x 10⁶ תאים/הבקבוק, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO₂ 2 ימים לשימוש בהפצת וירוס.
   הערה: צפיפות זריעה ניתן להתאים אם תקופות תרבות ארוכה או קצרה יותר הם הרצויה. עבור הפצת וירוס, תאים צריך להגיע מעל 100% confluency. עבור מבחני במינון זיהום תרביות רקמה (TCID) ו- MN, התאים צריך להיות confluency 75-95% (איור 1).

3. הפצת וירוסים A(H3N2) בתאים MDCK-SIAT1

הערה: A(H3N2) וירוס יכול להיות מופצות בכל יום 10-11 בתוך ביצים של בת חן embryonated לפי פרוטוקול סטנדרטי³או MDCK-SIAT1 תא תרבויות. תאים MDCK-SIAT1 צריך להגיע מעל 100% confluency על חיסון וירוס. ניתן לקבל חיסון וירוס זרע מניות עם דילולים מרובים של inoculum. Inoculum דילולים היבול הטוב הא ו infectivity יכול לשמש עבור עוד מבחני MN.

1. להסיר טפט תא המדיום התרבות התא (> 100% confluency) ב 162 ס' ' מ² מבחנות. רוחצים את טפט פעמיים עם 15 מ"ל של PBS 0.01 M סטרילי, pH 7.2, את decant.
2. תווית הבקבוק 1 כפקד ולהוסיף 20 מ"ל של אמצעי הפצת וירוס. דגירה הבקבוק ב 37 ° C עם 5% CO₂. תשאיר את הבקבוק הזה לא נגעה ולהשתמש להשוואה לאחר יום 1 של הפצת וירוס.
3. להוסיף 10 מ של אמצעי הפצת וירוס עקר flask(s), דגירה flask(s) כל ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. הפשרת בקבוקון של מניות וירוס שפעת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מניחים על קרח. לדלל עם הפצת אמצעי התקשורת וירוס דילולים היעד.
   הערה: היעד דילולים ניתן להתאים בהתאם titers HA של וירוס מניות. כדי להכין את 1:1000 מדולל inoculum, להוסיף 100 µL של וירוס 9.9 מ של אמצעי הפצת וירוס סטרילי. היפוך בעדינות, להסיר 1 מ"ל של דילול מטריים 9 מ של אמצעי הפצת וירוס סטרילי, היפוך בעדינות על inoculum 1:1000 מדולל. מניחים על קרח.
4. הסר את כל צלוחיות למעט פקד את הבקבוק של החממה. התקשורת הפצת וירוס להסיר flask(s) של תאים MDCK-SIAT1, לחסן את כל הבקבוק עם 10 מ"ל של וירוס מדולל. דגירה המבחנות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ב 1 h, סיבוב flask(s) את כל 15 דקות.
5. 5 מ של inoculum להסיר flask(s) והחלף 15 מ"ל וירוס הפצת המדיה המכילה µg 1/TPCK-טריפסין mL. דגירה של flask(s) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ב 16-18 h.
6. לאחר לילה הדגירה, לבחון את flask(s) תחת 100 X מיקרוסקופ הגדלה, חפשו השפעות cytopathic (CPE) על התאים. 15-17 מ"ל של וירוס supernatant להסיר flask(s), והחלף 15-17 מ ל שזה עתה הוכנו וירוס הפצת המדיה המכילה 2 µg/mL TPCK-טריפסין.
7. דגירה המבחנות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. לפקח על CPE של טפט (by comparison with הבקבוקון בקרה של תא) וסמנו את HA מעת לעת (כל 4 שעות) עם gpRBC 0.75% עד הקציר.
   1. להגדיר את צלחת microtiter HA 96-ובכן. להוסיף 50 µL של 0.01 M PBS, pH 7.2 כדי בארות A2 - A12 ו- B2 - B12 (כפילות), ווולס H1 - H12 עבור פקד.
   2. להוסיף 100 µL וירוס supernatant A1 ו- A2, לבצע לדילול טורי 2-fold מ A1 ו- B1 עד A12 ו- B12. להתעלם 50 µL לאחר ערבוב A12 ו B12. להוסיף 50 µL של 0.75% gpRBCs שורות A, B וח'
   3. הקש על הצלחת, דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
      1. לקבוע HA של וירוס supernatant על ידי הטיית הלוח microtiter 96-ובכן-45° עד 60 ° צלזיוס זווית.
      2. לוחות קריאה עבור hemagglutination; דילול הגבוהה של וירוס משיג hemagglutination מלאה נחשבת נקודת הקצה טיטור HA של הנגיף הספציפי. להקליט את הדדיים של הגבוהה וירוס דילול עם hemagglutination מלאה כמו כייל HA של הנגיף.
         הערה: RBCs התיישבו בשורה H (שולטת) צריך להתחיל "פועל", צורה קטנים דמעה-בשל כוח המשיכה. חכה עד RBCs בשליטה בארות לסיים ריצה, אז לקרוא הלחצנים RBC הווירוס טיטור בארות. אלה התערוכה RBC לחצנים, "לרוץ", אינם זוכים hemagglutination. אתר דילול הגבוהה של וירוס המעכבות לחלוטין hemagglutination כמו כייל HA נקודת הקצה של הנגיף.
8. הקציר הנגיף כאשר מישורים HA של התרבות הווירוס או התרבות הווירוס מגיע המטרה HA (לדוגמה, > חואה 16), אבל לפני התא טפט מתחיל להציג CPE משמעותית.
   1. Centrifuge התרבות הווירוס supernatant-300 גרם x 10 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה ההריסות הסלולר. להעביר את תגובת שיקוע בהירה המכילה וירוס הקציר כדי צינור נקי. Aliquot תגובת שיקוע המכילים את הנגיף למסוק לתוך מבחנות הקפאה סטרילי לשימוש יחיד, מקפיאים מיד ב-70 מעלות צלזיוס או כבדח.
      הערה: המניות וירוס המשמש את מבחני MN צריך כייל נוגדנים גבוה זיהומיות וחלקיקים פגומים מינימלי. דילול מינימלי של וירוס מניות כדי להשיג 100 µL₅₀/50 TCID עבור MN assay הוא 1: 100.
      הערה: המניות וירוס המשמשים את מבחני MN צריך לא להיות הקרת והוקפאו מחדש

4. קביעת TCID של הוירוס

1. יום 1: וירוס טיטור
   1. הפשרת בקבוקון של וירוס בטמפרטורת החדר ומניחים מיד על קרח.
   2. מבחן הווירוס-שני דילולים התחלה שונים: 10^-2 ו- 10^-3. להוסיף 100 µL של וירוס 9.9 מ של וירוס diluent עבור 10^-2 דילול. להוסיף 1 מ"ל של דילול^-2 10 מ ל 9.0 של וירוס diluent עבור 10^-3 דילול.
   3. שימוש microtiter שתי צלחות (צלחת 1 עבור 10 דילול^-2 ) וצלחת 2 עבור 10^-3 דילול, להוסיף 100 µL וירוס diluent בארות כל פרט עמודה 1 של צלחת microtiter 96-ובכן.
   4. ביצוע דילולים₁₀ ½log (10^-210^-2.5, 10^-3, וכו '). להוסיף µL 146 של הווירוס החל דילול כדי בארות כל עמודה 1 ולהעביר 46 µL באופן סדרתי מעמודה 1 דרך העמודה 11 (איור 2). טיפים פיפטה שינוי בין בארות. לאחר ערבוב טור 11, לבטל את העצות עם דילול 46 µL.
   5. להשתמש בעמודת 12 כמו התא שליטה (CC); זה מכיל רק וירוס diluent. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס, CO 5%_2-
2. יום 1: הכנה של תאים MDCK-SIAT1
   הערה: טפט תא MDCK-SIAT1 צריך להגיע confluency 75-95% עבור מבחני TCID ו- MN. בקבוק אחד 162 ס מ² ב 95% confluency אמור להניב מספיק תאי זרע ~ צלחות microtiter 4-5.
   1. לשטוף את טפט confluent 75-95% 20 מ ל PBS כדי להסיר את FBS בתקשורת תרבות. Trypsinize התאים כדלקמן.
      1. לשטוף את טפט עם PBS סטרילי, להוסיף 7 mL טריפסין-EDTA כדי לכסות את טפט התא. להניח את הבקבוק שטוח, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ עד טפט לניתוק (כ 5-10 דקות). להוסיף 7 מ של וירוס diluent כל הבקבוק המכילות את התאים trypsinized.
   2. לשטוף את התאים עם diluent וירוס כדי להסיר את FBS.
      1. בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי להפריד את התאים. העבר את התאים צינור חרוטי 50-mL; ממלאים את הצינור diluent וירוס.
      2. צנטריפוגה-g 485 x עבור 5 דק Decant וירוס diluent, החלף מ"ל וירוס diluent, ואת צנטריפוגה-485 g x עבור 5 דק Decant וירוס diluent והחלף וירוס טרי diluent (10 מ"ל/הבקבוק) כדי resuspend בגדר.
   3. שימוש בסיסמה hemocytometer trypan blue כדי לקבוע את ספירת התאים ואת הכדאיות. התאם את הריכוז תא עם הווירוס diluent של 1.5 x 10⁵ תאים למ"ל.
   4. להוסיף 100 µL של תאים MDCK-SIAT1 מדולל כל טוב של הלוחות microtiter (1.5 x 10⁴ תאים/טוב) ולכסות את הצלחות. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ h 18-20.
3. יום 2: אליסה
   1. קיבוע תאים
      1. הסר את המדיום של הלוחות microtiter. לשטוף כל טוב עם µL 200 ל- PBS. להוסיף 300 µL קר 80% אצטון מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות להסיר את מקבע ולאפשר את הצלחות מהאוויר יבש.
   2. אליסה
      1. תוספת נוגדן ראשוני
         הערה: נוגדנים חד שבטיים נגד שפעת A NP צריך לשמש עודף נוגדן ראשוני ב- ELISA. לקבוע דילול נוגדן האופטימלי עבור כל חלקה של נוגדנים הראשי על-ידי ביצוע נוגדן titrations ב MN. בחר את ריכוז נוגדן ראשוני עודף, עם האות הטוב ביותר ליחס רקע.
         1. לדלל את נוגדנים חד שבטיים של NP נגד שפעת (נוגדן ראשוני) לריכוז היעד בנוגדן diluent (למשל להוסיף 30 µL של נוגדן ראשוני 30 מ של נוגדן diluent לדילול היעד 1:1000).
         2. לשטוף צלחות 3 פעמים עם 300 µL שטיפת המאגר. להוסיף 100 µL נוגדן ראשוני מדולל מכל קידוח. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
      2. תוספת נוגדנים משניים
         הערה: עז אנטי עכבר IgG מצומדת כדי חזרת peroxidase (HRP) שאמור לשמש עודף נוגדן משניות ב- ELISA. לקבוע דילול נוגדן האופטימלי עבור כל חלקה של נוגדנים משניים על-ידי ביצוע נוגדן titrations. בחר את ריכוז נוגדן משני עודף עם האות הטוב ביותר ליחס רקע.
         1. לדלל עז העכבר אנטי שאיג מצומדת כדי HRP נוגדנים (נוגדנים משניים) לריכוז היעד בנוגדן diluent (למשל להוסיף 7.5 µL של נוגדנים משניים עד 30 מ"ל של נוגדן diluent לדילול בקני היעד).
         2. לשטוף צלחות 3 פעמים עם מאגר לשטוף µL 300. להוסיף 100 µL נוגדנים משניים מדולל מכל קידוח. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
      3. תוספת המצע וקריאה צלחת
         1. לשטוף צלחות 5 פעמים עם 300 µL שטיפת מאגר וברז על מחיקה נטולת מוך.
         2. להוסיף 100 µL של מצע טרי מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר עד הרוויות הפיתוח צבע, צפיפות אופטית (OD) תא בקרה בארות < 0.2.
         3. להוסיף 100 µL של להפסיק פתרון כל בארות. לקרוא את יתר של בארות 490 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים microplate.
4. חישוב ₅₀ TCID
   1. חישוב OD₄₉₀ החציוני של הפקדים תא (עמודה 12).
   2. לשקול כל מבחן טוב עם יתר₄₉₀ הגדולים מהחציון פעמיים OD₄₉₀ הבארות CC "חיוביים"; אחרת, הוא נחשב "שלילית".
   3. לחשב את TCID₅₀ של הווירוס באמצעות שיטת ריד-Muench¹³.
      1. לקבוע את מספר תוצאות חיוביות. ותשלילים -דילול בכל.
      2. לחשב את "חיובית מצטברת", "מצטבר שלילי", "יחס" ו- "% חיובי" כמו מאויר באיורים טבלה 1.
      3. לחשב את "המרחק פרופורציונלית" בין מראה דילול > 50% תוצאות חיוביות והצגה דילול < 50% תוצאות חיוביות באמצעות הפעולות הבאות:
         
         הערה: פקטור התיקון עבור ½ דילול יומן הוא 0.5. לדוגמה, ב טבלה 1: (80 − 50) /(80 − 20) x 0.5 = 0.25
      4. לחשב את הוירוס TCID₅₀ על-ידי הוספת המרחק פרופורציונלי דילול מציג > 50% חיובי.
         הערה: לדוגמה, בטבלה 2, TCID₅₀ הוא 10^-5+(-0.25) = 10^-5.25. הערה שזוהי TCID₅₀ של הנגיף לאדם 100 µL (או 10^-5.25/100 µL).
   4. לחשב דילול וירוס. עבור מבחני MN, לדלל את הוירוס µL₅₀/100 TCID 200 (שקול ל- µL₅₀/50 TCID 100 לכל טוב).
      הערה: בדוגמה 1 בטבלה, 1 TCID₅₀ 10^-5.25 ב 100 µL, דילול כדי להשיג 200 TCID₅₀/100 µL 1:891 מבוסס על החישובים: 200 x 10^-5.25 = 10^-2.95 = 1/10^2.95 = 1 / 891

5. MN Assay באמצעות תאים MDCK-SIAT1

1. יום 1: בדיקת ובקרה סרה הכנה וצלחת פריסה
   1. להפשיר את sera ב- 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים ולהסיר מיד לאחר מפשיר. Aliquot הסכום של sera שצריך לבחון אותו; מינימום של 10 µL של סרה המקורי יש צורך לבחון עם וירוס אחד בגופיה. לבחון סרה כפילויות במידת האפשר.
   2. חום להשבית את סרה אנושי במשך 30 דקות באמבט מים 56 ° C כמו שלב 1.12.1. המקום סרה על הקרח לכתוב חום איון, להוסיף את diluent וירוס סרה כדי להשיג 1:10 דילול מראש.
   3. RDE לטיפול, מראש לדלל סרה בעלי חיים כדי 1:10 לשימוש עבור פקדים לכל 1.12.2.
      הערה: המופשרים ומטופל האדם ושל בעלי החיים סרה ניתן לאחסן ב 4 ° C יותר מאשר ה 24 סרה לאחסן קפוא ב-20 ° C או תקופת אחסון קר אם עוד יש צורך לפני וזמינותו.
   4. כדי לבדוק עם וירוס אחד, להוסיף 100 µL 1:10 מדולל סרה לעמודות A1 עד A10 (איור 4). להוסיף 50 µL וירוס diluent שורות B עד H, חוץ עמודות 11 ו- 12 (איור 4). מבצע לדילול טורי 2-fold משורות A עד H, ולמחוק את µL 50 האחרון בשורה H (איור 4).
      הערה: כאשר מספר וירוסים להיבדק, להיות מדולל סרה צינורות כייל נוגדנים. הדילול של סרום, מטרת קביעת כייל נוגדנים בסרום, א' טוב הוא 1:10, ובכן B 1:20, ובכן C 1:40, ובכן D 1:80, ובכן E 1:160, ובכן F 1:320, ובכן ג'י 1:640, ובכן H 1:1,280 (איור 4).
   5. עבור הפקד וירוס, להוסיף 50 µL של וירוס diluent בארות A12, B12, C12 ו- D12 (לא סרה). עבור הפקד תא, להוסיף 100 µL של וירוס diluent בארות E12, F12, G12 ו H12 (שום וירוס, לא סרה).
   6. סרה הבקרה (לדוגמה, פקדי סרה של חמוס), להוסיף 100 µL של סרה מדוללת בקרת טוב עמודה 11 ולהוסיף 50 µL וירוס diluent בארות B11 - H11. סידורי שתדללו למטה.
   7. לכסות את הלוחות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ עד מוכן עבור תוספת וירוס.
2. יום 1: וירוס תוספת
   1. לדלל את הוירוס µL₅₀/50 TCID 100 עם וירוס diluent.
   2. להוסיף 50 µL וירוס מדולל כל בארות, למעט טור 11 על הלוחות האחוריים טיטור (BT), תאי בקרה הבארות E12, F12, G12 ו H12 בכל הלוחות (איור 4). אחרי הגלופות עם שליטה sera ב טור 11, להוסיף וירוס טור 11.
   3. חזרה טיטור (BT)
      1. כולל BT בעמודה 11 של ערכה אחת של צלחות כפולות (לדוגמה, צלחת 1A ו- 1B). להוסיף 50 µL וירוס diluent בארות כל עמודה 11. להוסיף 50 µL של הנגיף-100 TCID₅₀/50 µL הבאר הראשונה (A11). מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
      2. לערבב, להעביר 50 µL בארות רצופים כדי לבצע 2-fold דילולים טורי. לשנות את הטיפים פיפטה בין בארות כדי למנוע וירוסים carry-over. להתעלם µL 50 מ H11 היטב.
      3. הוסף µL 50 של וירוס diluent לעמודה 11 כדי להביא את עוצמת הקול הסופי µL 100. הקש את הצלחות לערבב.
   4. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ לשעה.
   5. ביצוע תוספת תא MDCK-SIAT1 ביום 1 ואליסה ביום 2 כפי שתואר בשלבים 4.2 ו- 4.3 (גם המתוארים תחת 5.3 ו- 5.4)
3. יום 1: MDCK-SIAT1 תא תוספת
   1. הכינו את התאים MDCK-SIAT1 כפי שמתואר בשלב 4.2. להוסיף 100 µL MDCK-SIAT1 תאים ב- 1.5 x 10⁵ תאים למ"ל מכל קידוח (1.5 x תאים⁴ 10/טוב...). דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ h 18-20.
4. יום 2: אליסה
   1. לאחר דגירה לילה, ביום השני, לתקן את התאים עם אצטון קר 80% כפי שמתואר בשלב 4.3.
   2. תוספת נוגדן ראשוני
      1. לשטוף צלחות 3 פעמים עם מאגר לשטוף µL 300. לדלל את נוגדנים חד שבטיים של NP נגד שפעת (נוגדן ראשוני) לריכוז האופטימלי כפי שנקבע על ידי טיטור ב נוגדן diluent (למשל להוסיף 30 µL של נוגדן ראשוני 30 מ של נוגדן diluent לדילול היעד 1:1000).
         הערה: µL 100 של נוגדן ראשוני נדרש לכל טוב. ~ 10 מ"ל צורך לכל צלחת.
      2. להוסיף 100 µL נוגדן ראשוני מדולל מכל קידוח. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
   3. תוספת נוגדנים משניים
      1. לשטוף צלחות 3 פעמים עם מאגר לשטוף µL 300. לדלל את העז אנטי עכבר IgG מצומדת כדי HRP נוגדנים (נוגדנים משניים) לריכוז היעד בנוגדן diluent (למשל להוסיף 7.5 µL של נוגדנים משניים עד 30 מ"ל של נוגדן diluent עבור בקני היעד.)
         הערה: µL 100 של נוגדנים משניים נדרש לכל 96. טוב. ~ 10 מ"ל צורך לכל צלחת.
      2. להוסיף 100 µL נוגדנים משניים מדולל מכל קידוח. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
   4. תוספת המצע וקריאה צלחת
      1. לשטוף צלחות 5 פעמים עם 300 µL שטיפת מאגר וברז על ניגוב נטולת מוך.
      2. להוסיף 100 µL של מצע טרי מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר עד הבארות שליטה וירוס מגיעים OD של₄₉₀ = 0.8 - 3, עם הפקד תא בטמפרטורות נמוכות רקע OD₄₉₀ < 0.2.
      3. להוסיף 100 µL של הפתרון להפסיק כל בארות. לקרוא את יתר של בארות 490 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים microplate.
5. ניתוח נתונים
   הערה: החישובים MN נקבעים עבור כל צלחת בנפרד.
   1. לקבוע את כייל נוגדנים נטרול של כל מדגם סרום.
      1. לחשב₄₉₀ OD שרשם של ניטרול וירוס 50% על כל צלחת באמצעות המשוואה הבאה:
         
         הערה: כאן x = 50% שרשם ניטרול. דילול הדדיים סרום המתאים דילול הגבוהה ביותר עם יתר₄₉₀ פחות מ 50% שרשם (≥50% עיכוב) נחשב את כייל נוגדנים ניטרול עבור הדגימה סרום (איור 5).
   2. בדוק הבארות בקרת התא יש OD של₄₉₀ < 0.2 ויש הבארות שליטה וירוס OD של₄₉₀ = 0.8 - 3.
   3. ודא infectivity וירוס בתוך כל assay (100 x TCID₅₀) על ידי וירוס הישיר הטווח המקובל של BT 50, 100 או 200 TCID. אם משתמש שרשם אותה כפי שהוגדרו בשלב 4.4.2, דילול וירוס הגבוה ביותר בעמודה BT עם יתר לעיל שרשם צריך להיות בבארות E11, F11, G11.
      הערה: הסרום חיובי הפקדים צריך לתת titers בתוך קיפול כפול של הערכים שהתקבלו בבדיקות קודמות. OD₄₉₀ של הפקד נסיוב שלילי צריך להיות דומה לזה שנצפה עבור הפקד וירוס.

תוצאות

קביעת infectivity של המניות וירוס הוא הצעד הראשון וזמינותו MN. איור 2 מדגים את הפריסה צלחת כדי לקבוע TCID₅₀ המניות וירוס. עבור מניות וירוס עם infectivity לא ידוע, יכול טיטרציה הוירוס מן מרובים דילולים מראש, לדוגמה 10^-2 וגם 10^-3, על מנת ללכוד את העקומה טיטור ה?...

Discussion

וזמינותו MN נמנה מבחני העיקריים המשמשים עבור שפעת סרולוגיה לזיהוי נוגדנים תגובות בעקבות שפעת זיהום או חיסון. Titers שנוצר מתוך מבחני MN משמשים לעתים קרובות התוצאה העיקרית של מחקרים רבים של seroepidemiology שפעת. מבחני MN נמצאים בשימוש נרחב גם sero-אבחון, הערכת חיסון immunogenicity. מחקרי מעבדה אינטר בינלאומיים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose	Life Science	11965	A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free	Sigma-Aldrich	3117332001
L-Glutamine	Life Science	25030-081
Sodium pyruvate	Life Science	11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPES	Life Science	15630-080
Penicillin/Streptomycin	Life Science	15140-122
Acetone	VWR	67-64-1	Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A510-P500	Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L	VWR	EM-AX0422-3	Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA	Life Science	1748048
RDE II "Seiken"	Denka Seiken	370013
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab	Millipore pool	MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP	KPL	074-1802
96-well flat-bottom plates	Thermo Scientific	3455
Plate reader	Molecular Device	Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap	Corning/VWR	3151