שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Summary

אנו מציגים פרוטוקול פשוטה ואמינה למדידת תוכן ברזל ברקמות הצמח באמצעות השיטה כחול פרוסי ערכי צבע מוחלטים.

Abstract

ברזל, אחד של יסודות קורט החשוב ביותר אורגניזמים חיים, מעורב תהליכים בסיסיים, כגון נשימה, פוטוסינתזה. תוכן ברזל הוא נמוכות למדי בכל היצורים, בהיקף של צמחים כ- 0.009 אחוז משקל יבש. עד כה, באחת השיטות המדויקות ביותר למדידת ריכוז ברזל ברקמות הצמח הוא הלהבה ספקטרום בליעה אטומית. עם זאת, גישה זו הוא יקרה ועתירת ואינה דורשת ציוד ספציפי לא נפוץ למצוא צמח מעבדות. לכן, דרושה שיטה פשוטה אך מדויקת יכול לשמש באופן שגרתי. השיטה כחול פרוסי ערכי צבע מוחלטים משמש באופן קבוע ברזל איכותי מכתים בסעיפים היסטולוגית מהחי והצומח. במחקר זה, שינינו את כחול פרוסי שיטת מדידות כמותיים של ברזל טבק עלים. נוכל לאמת את הדיוק של שיטה זו באמצעות ספקטרוסקופיה אטומית והן כחול פרוסי מכתים כדי למדוד את התוכן ברזל הדגימות באותו ומצא רגרסיה ליניארית (R² = 0.988) בין שני ההליכים. אנו מסיקים כי השיטה כחול פרוסי למדידה כמותית ברזל ברקמות הצמח הוא מדויק, פשוטה וזולה. עם זאת, הרגרסיה הליניארית המובאת כאן לא ייתכן המתאים עבור מינים אחרים של הצמח, בשל פוטנציאל אינטראקציות בין המדגם הכימית. הקמתה של עיקול רגרסיה ובכך צורך עבור מינים שונים.

Introduction

הברזל (Fe) הוא micronutrient חשוב בכל היצורים החיים. בצמחים, זה micronutrient חיוני¹ בגלל מעורבותה תהליכים בסיסיים, כגון נשימה, פוטוסינתזה, כלורופיל ביוסינטזה. הצטברות גבוהה של ברזל חינם יונים מזיק לשתול תאים עקב תגובות מוביל שחרור של רדיקלים חופשיים גורם סטרס חמצוני. כדי לשמור על הומאוסטזיס ברזל בתוך התא צמח, יונים המאוחסן וקואלות, מבודדות בתוך ferritins, חלבון הכלובים מעורבים ישירות הומאוסטזיס ברזל² ומבנה האחסון העיקרי של ברזל בכל היצורים החיים. במקביל, אנמיה מחוסר ברזל משפיע על חלק ניכר של האוכלוסייה האנושית, וכתוצאה מכך הצורך הגובר צמח Fe biofortification. בשל תכונותיו הייחודיות של הצמח קשירת ברזל, העשרת מזון עם קשירת ברזל-ברזל מציע אסטרטגיה מבטיח להילחם בבעיה הזאת של תת-תזונה³.

יונים של ברזל הם בעיקר שנמצאו שתי חמצון מדינות, כלומר ברזלי (כלט Fe^{2 +} או ברזל (II)), ferric (כ Fe^{3 +} או ברזל (III)) טפסים. כמה צורות אחרות של ברזל, כגון ברזל אשכולות⁴, ניתן למצוא גם בתאים. Fe מאוחסן בתור תחמוצת ברזל בתוך התא, באופן טבעי צורות hematites (Fe₂O₃), ferryhidrites ((Fe^{3 +})₂O₃•0.5 H₂O) תחת תנאים פיזיולוגיים⁵. והידרוקסידים שהוקמה ב תגובות אלו, במיוחד את הטופס ferric, יש מסיסות נמוכה מאוד. ברזל השמירה מושפע וכתוצאה מכך רמת ה-pH של התמיסה, במידה רבה במצב מוצק מעל pH 5⁶.

בהתחשב המסיסות המסכן תגובתיות גבוהה של Fe, את ההעברה בין הצמח רקמות ואיברים חייב להיות מקושר עם מולקולות chelating מתאימים. יתר על כן, המדינות חמצון-חיזור בין צורות ומתכות ferric¹ חייבים להיות מבוקרים. בתוך עלים, כ- 80% של הברזל הוא נמצא תאים פוטוסינתטיים, עקב שלה תפקידים חיוניים במערכת התחבורה אלקטרון, ביוסינטזה של cytochromes, כלורופיל, מולקולות אחרות heme, ואת היווצרות Fe-S אשכולות⁷. במקרה של ברזל עודף בתוך התא, העודף הוא translocated לתוך חלולית שבו המתכת מאוחסן בקשירת ברזל מולקולות⁸.

ניתן למדוד ברזל ברקמות הצמח על ידי מספר שיטות, כולל להבה בליעה אטומית ספקטרוסקופיה⁹ (FAAS) או מבחני ערכי צבע מוחלטים¹⁰, לשעבר להיות הרבה יותר מדויק מאשר לאחרון. FAAS היא טכניקה מאוד מדויקת המאפשר לנו לקבוע הרכב היסודות של מדגם על בסיס הפליטה האלקטרומגנטית של הרכיבים הבודדים. FAAS ממיר יונים מתכתיים למדינות אטומי מאת להבה-חימום של המדגם, המוביל עירור יון פליטה של גל מסוים יון נתון יחזור למצבו הקרקע. פליטת היונים שונה המופרדים באמצעות monochromator, זוהה על ידי חיישן הקליטה¹¹. FAAS מגישה לכן ישירות לכמת ריכוזי ברזל. טכניקות אחרות המדגימה ברזל ברקמות ביולוגיות זמינים, אולם. מצמידים inductively פלזמה המוני ספקטרוסקופיה (ICP-MS)¹² היא טכניקה מאוד מדוייק למדידת ברזל ויסודות קורט אחרים אבל העדר ציוד, גם FAAS וגם ICP-MS, היא בעיה נפוצה. מצד שני, ברזל המדידה על-ידי thiocyanate colorimetry¹³ חסר דיוק, לא יצליח לזהות וריאציות קטנות בין דגימות. כחול פרוסי מכתים^14,15,16,17 היא שיטה עקיפה בהתבסס על התגובה של אשלגן ferric ferrocyanide (K₄Fe(CN)₆) עם קטיונים Fe, ייצור צבע כחול חזק, והוא משמש לזיהוי ברזל איכותי בסעיפים היסטולוגית של רקמות הגוף.

ברזל מתכתי (אפס-עמודים ולנטיין) הוא נדיר ליתוספירה. הצורה השלטת יוניים שאינם ומורכבת של ברזל בסביבת מוכתב בעיקר על ידי כמות החמצן בסביבה, עם ברזל ברזלי להיות יחסית שופע יותר בסביבות אנאוקסיים וברזל ferric predominating באתרים אירובי. זה באחרון גם הוא דומיננטי בסביבות מאוד חומצי, למרות הסוכנים סיבתי של ברזל ברזלי חמצון לעיתים קרובות נבדלים סביבה חומצית אנאוקסיים¹⁸. מתי ברזל solubilized ב 4% HCl (pH 0) בסביבה אירובית, החלק העיקרי של הברזל מדולל קיים כפי ferric הטופס (Fe^{3 +})^19,20.

התגובות בין יונים Fe ו- K₄Fe(CN)₆ הן כדלקמן:

Fe^{3 +}: FeCl₃ + K-₄-Fe(CN)-₆ = KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl

Fe^{2 +}: 4 FeCl₂ + 2 K-₄-Fe(CN)-₆ = Fe₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 אשלגן כלורי

במחקר הנוכחי, ביקשנו אם צביעת כחול פרוסי יכול להיות שימושי עבור מדידת רמות ברזל בתמיסה.

בתחילה, נוכל לאמת את המתאם בין ריכוז Fe בתמיסה המימית מכתים כחול פרוסי. ריכוז Fe (כפי FeCl₂, FeCl₃ או תערובת של 1:1 של השני) בתחום פתרונות מימית נמדדה על ידי ספקטרוסקופיה אטומית והן על ידי ספיגת (OD) לאחר תוספת של כחול פרוסי. איור 1 מציג את עקומות רגרסיה ליניארית למדידות מתקבל על ידי כל שיטה. הגענו למסקנה כי השיטה כחול פרוסי יכול לשמש עבור ניתוח כמותי של ברזל ריכוז בתמיסה.

איור 1: regressions ליניארי בין ריכוז Fe נמדדת FAAS ואת ספיגת האור (OD, 715 ננומטר) מתקבל על ידי שיטת כחול פרוסי. ריבועים כחול וקו מייצג הפתרון^{2 +} Fe, ריבועים אדומים וקו הפתרון^{3 +} Fe מייצגים את ריבועים שחורים וקו מייצג תערובת 1:1 בין Fe^{2 +} ו Fe^{3 +}. Regressions הבאים התקבלו: [Fe^{2 +}] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R² = 0.989; [Fe^{3 +}] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R² = 0.997; ו [Fe^{2 + 3 +}] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R² = 0.956. התורם^{2 +} Fe FeCl₂ , היה התורם Fe^{3 +} FeCl₃. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

להתאים את שיטת כחול פרוסי ערכי צבע מוחלטים לניתוח כמותי ברזל של רקמות הצמח, התוכן ברזל של האפר עלה טבק נמדדה על ידי להבה ספקטרום בליעה אטומית מכתים כחול פרוסי. היה מתאם טוב בין התוצאות של ידי שתי שיטות.

Protocol

1. לשתול חומר, תנאי הגידול

1. זרע זרע אחד טבק (לדבורי לסאמסון) לכל 5 ס"מ x 5 ס"מ סיר מלא בינונית בסיר רגיל. מניחים את הסירים על המגשים. לגדל את הצמחים בחדר גדילה בתנאים יום ארוך (16/8 h/כהה) בטמפרטורה קבועה של 23 מעלות צלזיוס. להשקיית עם מי ברז עד ניקוז המים מהסיר.
2. לאחר ימים 50±5, להתחיל טיפולים Fe ההשקייה, לפי ריכוז המתאימים לניסוי. לדוגמה, השתמשנו מגוון של ריכוזי ברזל מ- 0 עד 6 מ מ, שיושלם על-ידי chelator מסיסים Fe (Fe EDDHA). להשקיית הצמחים עם הפתרון המתאים בכל יומיים (כדי למנוע התייבשות) 6-8 ימים.

2. הכנת את העלים למדידה ברזל

הערות: כל החומרים כדי לשמש חייבים להיות נטולי ברזל כדי להפחית את הסיכון של זיהום ברזל. מכתש ועלי פעמיים עם 4% HCl פתרון יבש ונקי עם נייר סינון בכל פעם לפני השימוש. אם היא להשתמש בכל חומר, זה פעמיים עם 4% HCl פתרון יבש ונקי עם נייר סינון.

1. לנתק את העלים מן הגבעול בכתב יד, באמצעות כפפות (אל תשתמש כל ציוד מתכת). השתמש בערך 10 גרם של עלים (משקל טריים) עבור כל דגימה. נקה כל עלה עם כפול מים מזוקקים (DDW) באמצעות בקבוק ספריי. השלב זה חשוב למנוע זיהום Fe.
2. לייבש את העלים על מגבת נייר, לשים אותם בשקית נייר. להעביר את שקיות נייר תנור בטמפרטורה קבועה של 80 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
3. כאשר יבש, למחוץ את העלים כדי אבקת באמצעות פצצות מרגמה, איחדו העברת צינורות פלסטיק סטרילית 15 מ"ל.

3. שריפת העלים לאפר

הערות: השימוש של פתרון pH נמוך (קרוב ל 0) של HCl נועד להגביר את מסיסות ברזל. צמר סלעים משמש כדי למנוע בריחה את המבחנה במהלך שריפת הגזים.

1. שוקלים בקבוקון נצנוץ חדש, אטום בפטרת ללא המכסה. שים לב לערך או להגדיר את הערך אפס באמצעות לחצן טרה. להוסיף עלים יבשים כתוש (דוגמה) למבחנה.
2. שוקל את הדגימה ואת מיכל ורשום את הערך. סגור את המבחנה עם צמר סלעים.
3. שוקל 3 מבחנות נוספות מבלי להוסיף דוגמאות ורשום את הערכים שלהם. את שתי המבחנות ישמש כפקדי כדי להעריך את כמות צמר סלעים יכול שהובילו לכך כל עלייה קטנה במשקל לדוגמה.
4. למקם את הבקבוקונים מדגם ושליטה תנור, להתחיל לצרוב באמצעות השלבים הבאים טמפרטורה: בטמפרטורת החדר, עלייה מהירה 425 ° C, ו, לבסוף, 425 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. בזמן הזה, שהעלים היבשים הפכו לאפר.
5. ומצננים את דגימות עד כ 100 ° C. אבל לא מתחת לטמפרטורה זו על שני השלבים הבאים למנוע לחות, אשר יכול להשפיע על המשקל הסופי של המדגם. באמצעות כפפות כבדות, הסר את הדגימות בכבשן עם פינצטה, מחזיק את הצנצנת מבחינה חיצונית וגם מבחינה.
6. מניחים את הבקבוקונים על משטח שטוח, להסיר את צמר סלעים ולסגור את הבקבוקונים בשלמותם המקורי שלהם.
7. שוקל את הבקבוקונים שליטה 3 (ראה 3.3) ולחשב שלהם במשקל ממוצע. אם במשקל שווה או מעל 1% ממשקל האפר (ראה שלב 4.2), השתמש בערך זה כהערכה לשגיאת המדידה.

4. מכינים את האפר למדידה ברזל

הערות: ריכוז הברזל הסופי במדגם הראשונית מחושבת המשקל של האפר מחולק נפח נוסף של HCl.

1. להכין פתרון HCl 1 מ' (4% HCl) על-ידי הוספת מ"ל של פתרון מניות של HCl 37% 87.5 מ ל DDW (בבקבוקון פלסטיק או זכוכית).
2. שוקל צינור פלסטיק 15 מ"ל, שים לב לערך או להגדיר את הערך אפס באמצעות לחצן טרה. להעביר את האפר הצינור, שוקל, שים לב לערך. זהו המשקל אפר.
3. הוסף 5 מ של 1 M HCl האפר. לסנן את האפר דרך מסנן מיקרומטר 22 ולהוסיף אוטם 5 נוספים של 1 M HCl דרך המסנן אותו.
4. עוצמת הקול הסופי צריך להיות 10 מ"ל. שימו לב כי חלק מהפתרון יאבדו במסנן.
   הערה: הדגימות. אתה מוכן למדידה Fe FAAS או באמצעות פעולת השירות כחול פרוסי.
5. הופכים את עקומת כיול עם ריכוז Fe נמדד לפי מסות אטומי ולפי השיטה כחול פרוסי (ראה איור 4) עבור כל מיני צמחים. לאחר מכן, ניתן למדוד ריכוז Fe בשיטה כחול פרוסי לבד.

5. מדידת ריכוז Fe מאת FAAS

1. הסר 4 מ"ל כל מדגם למדידה מאת FAAS.
2. לחלק את התוצאות שהתקבלו המדידה FAAS לפי המשקל של האפר. לחלק את הערך שהתקבל ב- 0.01 (כי האפר היו solubilized ב- 10 מ ל). הערך המתקבל הוא ריכוז הברזל לכל גרם אפר (ppm).

6. הכנת את כחול פרוסי מכתים פתרון

1. להכין a 4% כחול פרוסי פתרון על-ידי הוספת 4 g K₄Fe(CN)₆ עד 100 מ"ל DDW ו מערבולת (אמצעי אחסון אחרים ו/או ריכוז יכול לשמש עבור דרישות שונות). יצוין, כי במחקר זה, פחות מרוכזים פתרון כחול פרוסי (20%) שדווחה בעבר¹⁴ היה בשימוש.
2. לשמור את הפתרון בחושך ב 4 ° C עד השימוש. הפתרון הוא יציב במשך 6 חודשים כאשר הוא מאוחסן בתנאים.

7. הפקת את עקומת כיול עבור השיטה כחול פרוסי באמצעות FAAS תוצאות

הערה: לחשב את ריכוז הברזל באפר באמצעות הנוסחה הבאה
משוואה 1
C: ריכוז, v: לדגום נפח, w: אפר משקל (g).

1. מערבבים 0.50 מ של פתרון כחול פרוסי, מ 0.50 ל 1 M HCl. זה ישמש הפתרון ריק.
2. לערבב 0.5 מ של דגימה (האפר 4% HCl, כמתואר בסעיף 3) ו- 0.5 מ של פתרון כחול פרוסי (שלב 6.1) על ידי pipetting. המתן לפחות 1 דקה אך לא יותר מחמש דקות. לאחר 5 דקות, שקיעת הדגימות תתרחש.
3. להעביר את התערובת cuvette ולמדוד OD-715 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים. שים לב לערך.
4. לחלק את הערך OD (שלב 7.3) לפי המשקל אפר (שלב 3.2) של המדגם. התוצאה מייצג OD לכל גרם אפר.
5. להתוות את הרגרסיה הליניארית בין ריכוז הברזל המתקבל המדידות FAAS (ציר Y) ואת הערכים OD (ציר X). השתמש התוצאות המתקבלות שלבים 5.2 ו- 7.4. לחשב את נוסחת הרגרסיה, Y = + bX, כאשר Y מייצג ריכוז הברזל, מייצג ספיגת מצטלבים, b מייצג השיפוע ספיגת ו X מייצג OD.

8. בשיטת כחול פרוסי לקביעת רמות הברזל בדגימות אחרים מאותו סוג הצמח?

הערות: מאז עקומת כיול כבר הוקמה עבור סוג זה של הצמח, ריכוז הברזל בדוגמיות חדש מאותו סוג הצמח ניתן ישירות לחשב באמצעות הנוסחה רגרסיה ליניארית.

1. בצע את השלבים בסעיפים 3 ו- 4, ואחריו צעדים 7.1 ל 7.4.
2. חשב את ריכוז ברזל בתמיסה תוך שימוש בנוסחה המתקבל של רגרסיה ליניארית (שלב 7.5).

תוצאות

כאשר פרוטוקול זה מתבצעת כהלכה, יכול לעשות קורלציה מצוינת בין התוצאות המתקבלות על-ידי השיטות ספקטרוסקופיה כחול פרוסי, אטומי. לכן, השיטה כחול פרוסי בקלות ניתן להשיג של מדידה מדויקת של ריכוז הברזל דגימות צמח, כפי שמשתקף בניסוי הבא.

צמחי הטבק ...

Discussion

מדידה ברזל ברקמות הצמח חשוב מאוד להעריך את ההשפעות של השקיה או תנאים סביבתיים אחרים. כאן, אנחנו תיאר שיטה קלה ומדויקת ערכי צבע מוחלטים למדידה תוכן Fe טבק העלים, אשר ניתן להתאים בקלות מיני צמחים ורקמות אחרות.

תוך אופטימיזציה של תנאי עבור פעולת ערכי צבע מוחלטים, השתמשנו pH נמוך ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.