식물에 철 분 함량을 측정 하는 색도계 방법

요약

선물이 색도계 프러시안 블루 메서드를 사용 하 여 식물 조직에 철 분 함량을 측정 하는 간단 하 고 신뢰할 수 있는 프로토콜.

초록

철, 살아있는 유기 체에서 가장 중요 한 영양소 중 하나는 호흡과 광합성 등의 기본 프로세스에 포함 된다. 철 분 모든 생물, 식물에 건조 중량의 약 0.009%에 이른다에 오히려 낮습니다. 날짜 하려면, 화 염 흡수 원자 분광학은 식물 조직에서 철 분 농도 측정 하기 위한 가장 정확한 방법 중 하나. 그러나,이 접근은 어렵고 비싼 이며 특정 장비 공장 실험실에서 주로 발견. 따라서, 정기적으로 사용 될 수 있는 간단한 아직 정확한 방법 필요 합니다. 색도계 프러시안 블루 메서드는 정기적으로 동물과 식물 조직학 섹션에 얼룩 질적 철에 사용 됩니다. 이 연구에서 우리는 담배에 있는 철의 양적 측정 방법 나뭇잎 프러시안 블루 적응. 우리는 원자 분광학과 같은 샘플에 철 콘텐츠를 측정 하 여 선형 회귀 발견 얼룩 프러시안 블루를 사용 하 여이 방법의 정확도 확인 (R² = 0.988) 두 절차 사이. 우리는 프러시안 블루 식물 조직에서 양적 철 측정 방법은, 간단, 정확 하 고 저렴 한 결론. 그러나, 여기에 제시 된 선형 회귀 다른 식물 종, 샘플 및 시 사이 잠재적인 상호 작용 때문에 적합 하지 않을 수 있습니다. 따라서 회귀 곡선의 다른 식물 종의 필요 합니다.

서문

철 (Fe)은 모든 생명체에 중요 한 미 량 영양소 이다. 식물에는 필수 미 량 영양소¹ 호흡, 광합성과 엽록소 생 합성 등의 기본 프로세스에의 참여 때문 이다. 무료 철 이온의 높은 축적은 식물 세포 산화 스트레스를 일으키는 자유 래 디 칼의 방출에 지도 하는 반응 때문에 유해한. 식물 세포 내 철 항상성 유지, 이온 그들에 저장 하 고 ferritins, 철 항상성² 에 직접 관여 단백질 버팀대 및 모든 살아있는 유기 체에 있는 철의 주요한 저장소 구조 내에서 분리 된. 동시에 철 분 결핍 빈 혈 공장 철 영양실조 증가 필요에 따른 인간의 인구의 상당한 비율을 영향을 줍니다. 식물 ferritin의 독특한 특성으로 인해 ferritin 철 식품 농축 영양³의이 문제를 싸 우기 위하여 유망 전략을 제공 합니다.

철 이온은 주로에서 발견된 두 산화 상태, 즉 철 (divalent Fe^{2 +} 또는 철 (II))과 제 2 철 (trivalent Fe^{3 +} 또는 철 (III)) 형태. 철, 철 클러스터⁴, 등의 여러 다른 형태도 세포에서 발견 된다. Fe 철 산화물 세포와 자연스럽 게 폼 hematites (Fe₂O₃) 및 ferryhidrites로 저장 됩니다 ((Fe^{3 +})₂O₃•0.5 H₂O)에서 생리 적 조건⁵. 이러한 반응, 특히 제 2 철 형태에서에서 형성 하는 수 산화물은 매우 낮은 용 해도 있다. 철 보존 따라서 솔루션의 pH에 의해 영향을 받는 이며 주로 pH 5⁶위의 고체.

불 쌍 한 용 해도 및 Fe의 높은 반응성을 고려 하면 공장 조직 및 장기 들의 전송 적합 한 chelating 분자와 연결 되어야 합니다. 또한, 철과 제 2 철 양식¹ 사이 그것의 산화 상태를 제어 해야 합니다. 잎, 내는 철의 약 80% 한다, 엽록소와 다른 heme 분자의 생 합성에서 전자 교통 시스템에서의 필수적인 역할 때문에 광합성 세포에서 발견 되 고 Fe S의 형성에서 클러스터⁷. 셀 내에서 과잉 철 분의 경우 흑자 금속 ferritin 분자⁸에 저장 하는 공포에 translocated입니다.

철은 여러 방법을 비롯 하 여 불꽃 원자 흡수 분광학⁹ (FAAS) 또는 색도계 분석 실험¹⁰, 전 후자 보다 훨씬 더 정확한 되 고 식물 조직에서 측정할 수 있습니다. FAAS 있는 개별 요소의 전자기 방출 기초 샘플의 원소 구성을 결정 하는 매우 정확한 기술입니다. FAAS 변환 합니다 금속 이온 원자 상태 샘플의 화 염 열에 의해 주어진된 이온 접지 상태로 반환 될 때 이온 여기 및 특정 파장의 방출으로 이어지는. 다른 이온에서 방출 한 단색으로 구분 되며 흡수 센서¹¹에 의해 감지. FAAS 따라서 직접 철 농도 척도를 제공 합니다. 그러나 생물 조직에 철을 시각화에 대 한 다른 기술을,, 사용할 수 있습니다. 유도 결합 플라즈마-질량 분광학 (ICP-MS)¹² 철 및 다른 성분 측정을 위한 매우 정확한 방법 이지만 장비, FAAS와 ICP-MS, 모두의 부족은 일반적인 문제 이다. 다른 한편으로, 안산 기능성¹³ 철 측정 정밀도 결여 하 고 샘플 사이의 작은 변화를 감지 하 실패 합니다. 프러시안 파란 얼룩^14,,1516,17 Fe 양이온, 생산 되는 칼륨 제 2 철 ferrocyanide (K₄Fe(CN)₆)의 반응에 따라 간접 방법입니다는 강한 블루 색상, 질적 철 검출 동물과 식물 조직의 조직학 섹션에 사용 됩니다.

철 금속 (0-발렌타인)는 암석에 드문 경우입니다. 환경에서 철의 지배적인 비 complexed 이온 형태로 주로 에어로빅 사이트에서 우세한 제 2 철 철 철 철 무산 소 환경에서 상대적으로 더 풍부한 되 고와 주변에 있는 산소의 양에 의해 결정 됩니다. 철 철 산화의 원인이 되는 에이전트 자주 무산 소 및 산 성 주변¹⁸에 차이가 있지만이 후자의 형태는 또한 극단적으로 산 성 환경에서 지배적 이다. 때 철 분 4%에서 solubilized 이다 호 기성 환경에서 HCl (pH 0), 희석된 철의 존재는 제 2 철 (Fe^{3 +})^19,20양식.

철 이온과 K₄Fe(CN)₆ 사이의 반응을 아래와 같습니다.

Fe^{3 +}: FeCl₃ + K₄Fe(CN)₆ KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl =

Fe^{2 +}: 4 FeCl₂ + 2 K₄Fe(CN)₆ Fe₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 = KCl

현재 연구에서 우리는 프러시안 파란 얼룩 솔루션에서 철 수준을 측정 하는 데 유용 수 있습니다 여부를 물었다.

처음에, 수성 해결책에서 Fe의 농도 및 프러시안 파란 얼룩의 상관관계를 확인합니다. 수성 해결책에서 (FeCl₂, FeCl₃ 또는 2의 1:1 혼합물)로 철 농도 프러시안 블루의 추가 후 원자 분광학와 흡 광도 (OD)을 측정 했다. 그림 1 측정 각 방법으로 얻은 선형 회귀 곡선을 보여준다. 우리는 프러시안 블루 메서드 솔루션에서 철 분 농도의 정량 분석을 위해 사용 될 수 있다는 결론을 내렸다.

그림 1: Fe 농도 사이의 선형 재발 FAAS와 빛 흡 광도 측정 (OD, 715 nm) 프러시안 블루 메서드에서 얻은. 파란색 사각형 및 선 Fe^{2 +} 솔루션, 빨간 사각형 및 선 Fe^{3 +} 솔루션 및 검은 사각형을 나타냅니다 나타내고 선 사이 Fe^{2 +} Fe^{3 +}1:1 혼합물을 나타냅니다. 다음 재발 얻어 졌다: [Fe^{2 +}] 3 + 123 x OD = r = 0.996, R² 0.989; = [Fe^{3 +}] 1 + 292 x OD = r = 0.999, R² = 0.997; 그리고 [Fe^{2 + 3 +}] 11 + 146 x OD = r = 0.983, R² 0.956 =. Fe^{2 +} 기증자 FeCl₂ 이었고 Fe^{3 +} 기증자 FeCl₃했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

식물 조직의 철 정량 분석에 대 한 색도계 프러시안 블루 방법에 맞게, 담배 잎 재 철 콘텐츠 불꽃 흡수 원자 분광학 및 프러시안 파란 얼룩에 의해 측정 되었다. 두 가지 방법에 의해에서 결과 사이 좋은 상관 관계가 있었습니다.

프로토콜

1. 식물 재료와 성장 조건

1. 씨앗 한 담배 (재배 삼 순) 씨 5 cm x 5 cm 냄비 당 표준 냄비 중간으로 가득합니다. 쟁반에 냄비를 놓습니다. 23 ° C의 일정 한 온도에서 긴 하루 조건 (16/8 h 명암) 성장 방에 식물을 성장 냄비에서 물 배수까지 수돗물 관개.
2. 50±5 일 후, 관개, 실험에 대 한 적당 한 농도 따라에서 Fe 치료를 시작 합니다. 예를 들어 우리는 철 농도 0에서 6 m m, 성 철 chelator (Fe EDDHA)에 의해 보완의 범위를 사용. 관개는 적절 한 솔루션으로 식물 매 2 일 (탈수를 피하기 위해) 6-8 일.

2. 철 측정에 대 한 잎을 준비합니다.

참고: 모든 자료를 사용할 수 있어야 합니다 철 오염. 의 위험을 감소 시키기 위하여 철 무료 박격포와 유 봉 4 %HCl 솔루션과 두 번 청소 하 고 건조 한 종이 필터 사용 하기 전에 각 시간. 자료를 다시 사용 하는 경우 4 %HCl 솔루션과 두번 청소 하 고 건조 한 종이 필터.

1. 분리는 줄기에서 잎, 장갑 (모든 금속 장비 사용 안 함)를 사용 하 여. 잎 (신선한 무게)의 약 10 g를 사용 하 여 각 샘플에 대 한. 두 배 증류수 (DDW) 스프레이 용기를 사용 하 여 함께 각 잎 청소. 이 단계는 Fe 오염을 방지 해야 합니다.
2. 종이 타월에 잎을 건조 하 고 종이 가방에 넣어. 2-3 일 동안 80 ° C의 일정 한 온도에서 오븐에 종이 봉지를 전송.
3. 건조 하면, 분말 박격포와 유 봉 및 살 균 15 mL 플라스틱 튜브에 사용 하 여 나뭇잎 호감.

3. 불타는 화산재를 잎

참고 사항: HCl의 (0)에 가까운 낮은 pH 해결책의 사용 철 용 해도 증가 의미입니다. 바위 모직 불타는 동안 유리병을 탈출에서 가스를 방지 하는 데 사용 됩니다.

1. 새로운, 봉인 20 mL 섬광 유리병의 뚜껑 없이 무게. 값을 확인 하거나 자체 버튼을 사용 하 여 0 값으로 설정 합니다. 유리병에 짓 눌린된 말린된 잎 (샘플)을 추가 합니다.
2. 그리고 샘플 및 컨테이너 무게 값. 바위 양모와 유리병을 닫습니다.
3. 3 추가 튜브 샘플을 추가 하지 않고 무게 고 값을 확인 합니다. 이러한 튜브 샘플 무게 증가를 이끈 수 바위 모직의 양을 평가 하 컨트롤로 사용 됩니다.
4. 샘플 및 제어 튜브로 놓고 다음 온도 단계를 사용 하 여 레코딩을 시작: 실 온, 4 시간 동안 425 ° C, 그리고 마지막으로, 425 ° C를 빠른 증가. 이 시간까지, 마른 나뭇잎 재를 설정 할 것입니다.
5. 약 100 ° C까지 샘플 식만이 온도 습도 피하기 위해 다음 두 단계는 수 미치지 샘플의 최종 무게. 무거운 장갑을 사용 하 여, 핀셋, exteriorly 유리병을 들고와 보일 러에서 샘플 제거 합니다.
6. 평평한 표면에 튜브를 배치, 바위 모직을 제거 하 고 그들의 원래 뚜껑 튜브를 닫습니다.
7. (3.3 참조) 3 제어 튜브 무게 하 고 그들의 평균 체중 증가 계산. 체중 증가 이상 재 무게의 1% (단계 4.2 참조)이이 값을 사용 하 여 측정 오차의 견적으로.

4. 철 측정에 대 한 재 준비

참고: 초기 샘플에 최종 철 농도 HCl의 추가 볼륨 나눈 유골의 중량으로 계산 됩니다.

1. 1 M HCl 해결책 준비 (4 %HCl) (플라스틱 또는 유리 플라스 크)에 DDW 87.5 mL을 37 %HCl 재고 솔루션의 12.5 mL을 추가 하 여.
2. 15 mL 플라스틱 튜브 무게 값을 확인 하거나 자체 버튼을 사용 하 여 0 값으로 설정 합니다. 유골을 전송 튜브, 무게, 그리고 값. 이것은 재 무게 이다.
3. 유골을 1 M HCl의 5 mL를 추가 합니다. 재 22 µ m 필터를 통해 필터링 하 고 동일한 필터를 통해 1 M HCl의 추가 5 mL를 추가 합니다.
4. 마지막 볼륨 10 mL 이어야 한다입니다. 참고 필터에는 솔루션의 일부를 손실 됩니다.
   참고: 샘플은 Fe 측정 FAAS 또는 프러시안 블루 방법에 대 한 준비.
5. Fe 농도 보정 곡선 원자 분 광 분석에 의해 측정 가능한 프러시안 블루 메서드에서 확인 ( 그림 4참조) 각 식물 종에 대 한. 그 후, 혼자 프러시안 블루 메서드에서 Fe 농도 측정할 수 있습니다.

5. FAAS에 의해 Fe 농도 측정

1. FAAS 측정에 대 한 각 샘플에서 4 mL를 제거 합니다.
2. 유골의 무게에 의해 FAAS 측정에서 얻은 결과 나눕니다. (유골은 10 mL에서 solubilized 했다) 때문에 0.01로 결과 값을 나눕니다. 결과 값 그램 재 (ppm) 당 철 분 농도 이다.

6. 준비 솔루션 얼룩 프러시안 블루

1. 준비 4% K₄Fe(CN)₆ 100ml DDW와 소용돌이의 4 g를 추가 하 여 프러시안 블루 솔루션 (다른 볼륨 또는 농도 사용할 수 있습니다 다양 한 요구에 대 한). 이 연구에 덜 집중 프러시안 블루 솔루션 보다 이전에 보고 된 (20%)¹⁴ 사용을 주목 한다.
2. 사용 될 때까지 4 ° C에서 어둠 속에서 솔루션 유지. 솔루션은 이러한 조건에서 저장 될 때 6 개월 동안 안정.

7. FAAS 결과 사용 하 여 프러시안 블루 방법에 대 한 교정 곡선을 생성 합니다.

참고: 다음 수식을 사용 하 여 재에서 철 분 농도 계산
공식 1
C: 농도, v: 샘플 볼륨, w: 재 중량 (g).

1. 프러시안 블루 솔루션 및 0.50 mL의 1 M HCl 0.50 mL를 혼합. 이 빈 솔루션 될 것입니다.
2. 샘플의 0.5 mL를 혼합 (재 4 %HCl에서, 섹션 3에에서 설명 된 대로) pipetting으로 프러시안 블루 솔루션 (단계 6.1)의 0.5 ml. 1 분 이상 하지만 5 분 이상 기다립니다. 5 분 후, 샘플에서 침전이 발생 합니다.
3. 믹스는 베트 전송과 715에서 OD를 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여. 값 note
4. 샘플의 재 중량 (3.2 단계)에 의해 OD 값 (7.3 단계)를 나눕니다. 결과 그램 재 당 세를 나타냅니다.
5. FAAS 측정 (Y 축)와 OD 값에서 얻은 철 농도 사이의 선형 회귀 플롯 (X 축). 5.2와 7.4 단계에서 얻은 결과 사용 합니다. 회귀 수식 Y 계산 = a + bX, Y 철 분 농도, 교차 하는 흡 광도 나타냅니다, b를 나타냅니다 흡 광도 슬로프를 나타내고 X는 OD.

8. 동일한 식물 종류에서 다른 샘플에 있는 철 수준을 결정 하기 위한 프러시안 블루 메서드를 사용 하

참고: 식물의이 유형에 대 한 교정 곡선 이미 설정 된 이후 같은 식물 종류에서 어떤 새로운 샘플에서 철 분 농도 계산할 수 있습니다 직접 선형 회귀 수식을 사용 하 여.

1. 섹션 3, 4, 단계 7.1 7.4 다음 단계를 수행 합니다.
2. 선형 회귀 (7.5 단계)에서 얻은 수식을 사용 하 여 솔루션에서 철 분 농도 계산 합니다.

결과

이 프로토콜은 제대로 실시는, 하나 우수한 상관관계 프러시안 블루와 원자 분광학 방법으로 얻은 결과 얻어야 한다. 따라서, 프러시안 블루 메서드를 사용할 수 있습니다 쉽게 식물 샘플에서 철 분 농도의 정확한 측정을 얻기 위해 다음과 같은 실험에 반영.

담배 식물은 프로토콜에 설명 된 대로 성장 하 고 다른 철 농도 포함 ...

토론

식물 조직에서 철 측정 관개 또는 다른 환경 조건의 효과 평가 하기 위한 매우 중요 하다. 여기, 우리는 다른 종의 식물와 조직에 쉽게 적응 될 수 있는 담배 잎에 Fe 내용 측정을 위한 간단 하 고 정확한 색도계 방법 설명.

색도계 방법에 대 한 조건 최적화, 우리는 철 용 해도를 낮은 pH 매체 (pH < 1.0) 사용 있습니다. 레코딩 프로세스는 모든 형태의 철을 해제 하 고 아무 오염 물?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.