Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo semplice e affidabile per misurare il contenuto di ferro nei tessuti vegetali, utilizzando il metodo colorimetrico di blu di Prussia.

Abstract

Ferro, uno dei più importanti micronutrienti negli organismi viventi, è coinvolto in processi di base, come la respirazione e la fotosintesi. Contenuto di ferro è piuttosto bassa in tutti gli organismi, pari a piante a circa 0,009% del peso secco. Ad oggi, uno dei metodi più precisi per misurare la concentrazione di ferro nei tessuti vegetali è fiamma spettroscopia di assorbimento atomico. Tuttavia, questo approccio è che richiede tempo e costoso e richiede attrezzature specifiche non comunemente trovate in laboratori di pianta. Pertanto, è necessario un metodo più semplice, ma preciso che può essere utilizzato regolarmente. Il metodo colorimetrico di blu di Prussia è regolarmente utilizzato per ferro qualitativo colorazione nelle sezioni istologiche di animali e vegetali. In questo studio, abbiamo adattato il metodo per la misurazione quantitativa del ferro nel tabacco lascia il blu di Prussia. Abbiamo validato la precisione di questo metodo utilizzando sia la spettroscopia atomica e blu di Prussia macchiatura per misurare il contenuto di ferro negli stessi campioni e trovato una regressione lineare (R² = 0,988) fra le due procedure. Concludiamo che il metodo di blu di Prussia per la misurazione quantitativa del ferro nei tessuti vegetali è preciso, semplice e poco costoso. Tuttavia, la regressione lineare qui presentata non può essere appropriata per altre specie di piante, a causa di potenziali interazioni tra il campione e il reagente. Istituzione di una curva di regressione è quindi necessaria per diverse specie di piante.

Introduzione

Ferro (Fe) è un micronutriente importante in tutti gli organismi viventi. Nelle piante, è un micronutriente essenziale¹ a causa del suo coinvolgimento in processi di base, come la respirazione, la fotosintesi e la clorofilla biosintesi. Elevato accumulo di ioni di ferro libero è nociva alla pianta cellule a causa di reazioni che portano alla liberazione di radicali liberi che causano stress ossidativo. Per mantenere l'omeostasi del ferro all'interno della cellula vegetale, gli ioni sono memorizzati nei vacuoli e sequestrati all'interno di ferritine, gabbie di proteina direttamente coinvolte nell' omeostasi di ferro² e la struttura di archiviazione principale del ferro in tutti gli organismi viventi. Allo stesso tempo, l'anemia sideropenica colpisce una percentuale significativa della popolazione umana, risultante in un crescente bisogno di pianta Fe bioarricchimento. A causa delle proprietà uniche di ferritina pianta, arricchimento di cibo con ferritina-ferro offre una strategia promettente per combattere questo problema della malnutrizione³.

Gli ioni di ferro sono principalmente trovati in due stati di ossidazione, vale a dire i metalli ferrosi (ferro (II) o bivalente Fe^{2 +} ) e ferrico (ferro (III) o trivalente Fe^{3 +} ) forme. Diverse altre forme di ferro, come ferro cluster⁴, si trovano anche nelle cellule. Fe è memorizzato come ossido di ferro all'interno della cella e naturalmente ematiti forme (Fe₂O₃) e ferryhidrites ((Fe^{3 +})₂O₃0,5 H₂O) sotto condizioni fisiologiche⁵. Idrossidi formate in queste reazioni, soprattutto la forma ferrica, hanno solubilità molto bassa. Ritenzione di ferro conseguenza è influenzata dal pH della soluzione ed è in gran parte in uno stato solido sopra pH 5⁶.

Considerando la scarsa solubilità e l'alta reattività del Fe, suo trasferimento tra organi e tessuti vegetali deve essere associato a molecole chelanti adatte. Inoltre, i suoi Stati redox tra i moduli ferrosi e ferrici¹ devono essere controllati. All'interno di foglie, circa l'80% del ferro si trova nelle cellule fotosintetiche, a causa di suoi ruoli essenziali del sistema di trasporto dell'elettrone, nella biosintesi dei citocromi, clorofilla e altre molecole di eme e nella formazione di Fe-S cluster⁷. Nel caso di ferro in eccesso all'interno della cellula, l'eccedenza è traslocata nel vacuolo dove il metallo è memorizzato in molecole di ferritina⁸.

Ferro da stiro può essere misurata nei tessuti vegetali da diversi metodi, tra cui fiamma spettroscopia ad assorbimento atomico⁹ (FAAS) o saggi colorimetrici¹⁰, il primo è molto più precisa rispetto al secondo. FAAS è una tecnica estremamente precisa che consente di determinare la composizione elementare di un campione con l'emissione elettromagnetica dei singoli elementi. FAAS converte ioni metallici stati atomici di fiamma-riscaldamento del campione, che conduce agli ioni eccitazione e di emissione di una specifica lunghezza d'onda quando un determinato ione ritorna al suo stato fondamentale. Le emissioni da diversi ioni sono separate da un monocromatore e rilevate da un sensore di assorbimento¹¹. FAAS quindi serve a quantificare direttamente le concentrazioni di ferro. Altre tecniche per la visualizzazione di ferro nei tessuti biologici sono, tuttavia, disponibili. Spettroscopia di massa del plasma ad accoppiamento induttivo (ICP-MS)¹² è una tecnica molto precisa per la misurazione del ferro e altri oligoelementi, ma la mancanza di attrezzature, sia per FAAS e ICP-MS, è un problema comune. D'altra parte, misura del ferro di tiocianato colorimetria¹³ manca di precisione e non riesce a rilevare piccole variazioni tra campioni. ^14,15,16,di colorazione blu di Prussia¹⁷ è un metodo indiretto basato sulla reazione di ferrocianuro ferrico di potassio (K₄Fe(CN)₆) con cationi di Fe, producendo un colore blu forte e viene utilizzato per la rilevazione qualitativa di ferro nelle sezioni istologiche dei tessuti animali e vegetali.

Ferro metallico (zero-valent) è rara nella litosfera. La forma ionica non complessato dominante di ferro nell'ambiente è principalmente dettata dalla quantità di ossigeno nei dintorni, con ferro ferroso, essendo relativamente più abbondante in ambienti anossici e ferro ferrico che predomina nei siti di aerobiche. Quest'ultima forma è anche dominante in ambienti estremamente acidi, anche se gli agenti causali di ossidazione del ferro ferroso spesso differiscono in un ambiente anossico e acide¹⁸. Quando il ferro viene solubilizzato in 4% HCl (pH 0) in un ambiente aerobico, la maggior parte del ferro diluito esiste come forma il ferrico (Fe^{3 +})^19,20.

Le reazioni tra ioni Fe e K₄Fe(CN)₆ sono come segue:

Fe^{3 +}: FeCl₃ + K₄Fe(CN)₆ = KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl

Fe^{2 +}: 4 FeCl₂ + 2K₄Fe(CN)₆ = Fe₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 KCl

Nello studio presente, abbiamo chiesto se la colorazione blu di Prussia può essere utile per misurare i livelli di ferro in soluzione.

Inizialmente, abbiamo verificato la correlazione tra la concentrazione di Fe in soluzione acquosa e colorazione blu di Prussia. La concentrazione di Fe (come FeCl₂, FeCl₃ o una miscela di 1:1 dei due) in soluzioni acquose è stata misurata sia di assorbanza (OD) di spettroscopia atomica dopo l'aggiunta del blu di Prussia. La figura 1 Mostra le curve di regressione lineare per misurazioni ottenute da ciascun metodo. Abbiamo concluso che il metodo prussiano blu può essere utilizzato per l'analisi quantitativa della concentrazione di ferro in soluzione.

Figura 1: regressione lineare tra concentrazione di Fe misurata FAAS e assorbanza della luce (OD, 715 nm) ottenuti con il metodo prussiano blu. I quadrati blu e linea rappresentano la soluzione di Fe^{2 +} , i quadrati rossi e linea rappresentano la soluzione^{3 +} Fe e i quadrati neri e linea rappresentano una miscela 1:1 tra Fe^{2 +} e Fe^{3 +}. Le regressioni seguenti sono state ottenute: [Fe^{2 +}] = 3 + 123 x OD, r = 0,996, R² = 0,989; [Fe^{3 +}] = 1 + 292 x OD, r = 0,999, R² = 0.997; e [Fe^{2 + 3 +}] = 11 + 146 x OD, r = 0,983, R² = 0.956. Il Fe^{2 +} donatore era FeCl₂ e il Fe^{3 +} donatore era FeCl₃. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per adattare il metodo colorimetrico blu di Prussia per l'analisi quantitativa di ferro dei tessuti vegetali, il contenuto di ferro delle ceneri di foglia di tabacco è stato misurato dalla spettroscopia di assorbimento atomico di fiamma e colorazione blu di Prussia. C'era buona correlazione tra i risultati di due tecniche.

Protocollo

1. materiale e le condizioni di crescita della pianta

1. Semi di semi di tabacco di una (cultivar Samsun) per vaso di 5cm x 5cm riempito con mezzo vaso standard. Posizionare i vasi su vassoi. Crescere le piante in una stanza di crescita in condizioni di giorno lungo (16/8 h chiaro/scuro) ad una temperatura costante di 23 ° C. Irrigare con acqua di rubinetto fino a quando gli scoli dell'acqua dalla pentola.
2. Dopo giorni di 50 ± 5, iniziare trattamenti di Fe nell'irrigazione, secondo le concentrazioni adatte per l'esperimento. Ad esempio, abbiamo utilizzato un intervallo di concentrazioni di ferro da 0 a 6 mM, completato da un chelatore Fe solubile (Fe EDDHA). Irrigare le piante con la soluzione appropriata ogni due giorni (per evitare la disidratazione) per 6-8 giorni.

2. preparazione delle foglie per la misura di ferro

Note: Tutti i materiali da utilizzare devono essere esente da ferro in modo da ridurre il rischio di contaminazione da ferro. Pulire il mortaio e il pestello due volte con soluzione di HCl 4% e asciugare con carta da filtro ogni volta prima dell'uso. Se qualsiasi materiale viene riutilizzato, pulirlo due volte con una soluzione di HCl 4% e asciugare con carta da filtro.

1. Staccare le foglie dal gambo a mano, utilizzando guanti (non utilizzare qualsiasi apparecchiatura del metallo). Utilizzare circa 10 g di foglie (peso fresco) per ogni campione. Pulire ogni foglia con doppia acqua distillata (DDW) utilizzando un flacone spray. Questo passaggio è importante per evitare la contaminazione di Fe.
2. Asciugare le foglie su un tovagliolo di carta e metterli in un sacchetto di carta. Trasferire i sacchi di carta da forno ad una temperatura costante di 80 ° C per 2-3 giorni.
3. Quando asciutto, schiacciare le foglie in polvere utilizzando un mortaio e pestello e trasferimento a tubi in plastica sterili da 15 mL.

3. bruciare le foglie di frassino

Note: L'utilizzo di una basso pH (vicino a 0) soluzione di HCl è destinato per aumentare la solubilità del ferro. La lana di roccia viene utilizzata per impedire i gas di fuggire il flaconcino durante la masterizzazione.

1. Pesare una fiala di scintillazione 20ml nuovo, sigillato senza coperchio. Prendere nota del valore o impostare il valore su zero utilizzando il tasto tare. Aggiungere i fogli secchi schiacciati (campione) nel flaconcino.
2. Pesare il campione e il contenitore e prendere nota del valore. Chiudere la cuvetta con lana di roccia.
3. Pesare 3 fiale aggiuntive senza aggiungere campioni e notare i loro valori. Queste fiale usarsi come controlli per valutare la quantità di lana di roccia che potrebbe condurre ad un aumento in peso del campione.
4. Posizionare le fiale del campione e controllo in una fornace e avviare la masterizzazione utilizzando la seguente procedura di temperatura: temperatura ambiente, rapido aumento di 425 ° C e, infine, a 425° C per 4 ore. Entro questo tempo, le foglie secche si sono rivolti alla cenere.
5. Lasciate raffreddare il campioni a circa 100 ° C, ma non sotto questa temperatura per i due passaggi seguenti evitare l'umidità, che potrebbe pregiudicare il peso finale del campione. Utilizzando guanti pesanti, rimuovere i campioni dalla fornace con le pinzette, tenendo il flaconcino esteriormente.
6. Posizionare le fiale su una superficie piana, rimuovere la lana di roccia e chiudere i flaconi con i loro coperchi originali.
7. Pesare le fiale di 3 controllo (Vedi 3.3) e calcolare il loro guadagno di peso medio. Se l'aumento di peso è uguale o superiore all'1% del peso della cenere (Vedi punto 4.2), utilizzare questo valore come una stima dell'errore di misurazione.

4. preparare le ceneri per la misura di ferro

Note: La concentrazione di ferro finale nel campione iniziale viene calcolata come il peso delle ceneri diviso per il volume aggiunto di HCl.

1. Preparare una soluzione di HCl 1 M (4% HCl) con l'aggiunta di 12,5 mL di una soluzione madre di HCl 37% a 87,5 mL di DDW (in un fiasco di vetro o plastica).
2. Pesare un tubo di plastica da 15 mL e prendere nota del valore o impostare il valore su zero utilizzando il tasto tare. Trasferire le ceneri sul tubo, pesare e prendere nota del valore. Questo è il peso di cenere.
3. Aggiungere 5 mL di 1 M HCl per le ceneri. Le ceneri filtrare su un filtro 22 µm e aggiungere un ulteriore 5 mL di 1 M HCl attraverso lo stesso filtro.
4. Il volume finale deve essere di 10 mL. Si noti che parte della soluzione sarà perso nel filtro.
   Nota: I campioni sono ora pronti per la misurazione di Fe FAAS oppure dal metodo blu di Prussia.
5. Fare una curva di calibrazione con la concentrazione di Fe misurata mediante Spettrometria atomica e dal metodo prussiano blu (Vedi Figura 4) per ogni specie di pianta. Successivamente, concentrazione di Fe può essere misurata con il metodo prussiano blu da solo.

5. misurazione della concentrazione di Fe da FAAS

1. Rimuovere da 4 mL di ogni campione per la misura di FAAS.
2. Dividere i risultati ottenuti dalla misurazione FAAS dal peso delle ceneri. Dividere il valore risultante da 0,01 (perché le ceneri erano solubilizzate in 10 mL). Il valore risultante è la concentrazione di ferro per grammo cenere (ppm).

6. preparare il blu di Prussia macchiatura soluzione

1. Preparare un 4% soluzione di blu di Prussia con l'aggiunta di 4 g di K₄Fe(CN)₆ a 100 mL DDW e vortice (altri volumi e/o concentrazioni possono essere utilizzate per diverse esigenze). Si noti che in questo studio, un meno concentrata soluzione blu di Prussia che è stato utilizzato precedentemente segnalati (20%)¹⁴ .
2. Mantenere la soluzione al buio a 4 ° C fino all'utilizzo. La soluzione è stabile per 6 mesi se conservato a tali condizioni.

7. generazione di una curva di calibrazione per il metodo di blu di Prussia utilizzando FAAS risultati

Nota: Calcolare la concentrazione di ferro nella cenere utilizzando la seguente formula
Equazione 1
C: concentrazione, v: volume, peso di w: cenere (g) del campione.

1. Mescolare 0,50 mL di soluzione di blu di Prussia e 0,50 mL di 1 M HCl. Questo servirà come la soluzione vuota.
2. Mescolare 0,5 mL di campione (ceneri nel 4% HCl, come descritto nella sezione 3) e 0,5 mL di soluzione di blu di Prussia (punto 6.1) di pipettaggio. Attendere almeno 1 minuto, ma non più di 5 minuti. Dopo 5 minuti, si verificherà la sedimentazione nei campioni.
3. Trasferire il mix in una cuvetta e misurare il diametro esterno a 715 nm utilizzando uno spettrofotometro. Prendere nota del valore.
4. Dividere il valore di OD (punto 7.3) per il peso della cenere (punto 3.2) del campione. Il risultato rappresenta OD al grammo cenere.
5. Tracciare la regressione lineare fra le concentrazioni di ferro ottenuti da misurazioni FAAS (asse Y) e i valori di OD (asse X). Utilizzare i risultati ottenuti ai punti 5.2 e 7.4. Calcolare la formula di regressione, Y = a + bX, dove Y rappresenta la concentrazione di ferro, una rappresenta l'assorbanza si intersecano, b rappresenta la pendenza di assorbanza e X rappresenta il OD.

8. utilizzando il metodo di blu di Prussia per determinare i livelli di ferro in altri campioni provenienti dallo stesso tipo di pianta

Note: Dal momento che una curva di taratura è già stata stabilita per questo tipo di pianta, concentrazione di ferro in qualsiasi nuovi campioni provenienti dallo stesso tipo di pianta può essere direttamente calcolato utilizzando la formula di regressione lineare.

1. Eseguire i passaggi nelle sezioni 3 e 4, seguita da passaggi 7.1 a 7.4.
2. Calcolare la concentrazione di ferro in soluzione mediante la formula ottenuta dalla regressione lineare (punto 7.5).

Risultati

Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si dovrebbe avere ottima correlazione tra i risultati ottenuti con i metodi di spettroscopia atomica e blu di Prussia. Pertanto, il metodo blu di Prussia può essere facilmente utilizzato per ottenere una misurazione accurata della concentrazione di ferro in campioni di piante, come risulta il seguente esperimento.

Piante di tabacco erano cresciute come descritto nel protoco...

Discussione

Misurazione di ferro nei tessuti vegetali è molto importante per la valutazione degli effetti di irrigazione o altre condizioni ambientali. Qui, abbiamo descritto un metodo colorimetrico facile e preciso per la misurazione del contenuto Fe in foglie di tabacco, che può essere facilmente adattato ad altre specie di piante e tessuti.

Nell'ottimizzazione delle condizioni per il metodo colorimetrico, abbiamo usato un mezzo a basso pH (pH < 1.0) per consentire la solubilità del ferro. Il process...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.