植物の鉄含有量を測定するための比色定量法

要約

比色のプルシアン ブルーを用いた植物組織の鉄含有量を測定するための簡潔かつ信頼できるプロトコルを提案します。

要約

鉄生体内で最も重要な栄養素の一つは、呼吸や光合成などの基本的なプロセスに関与しています。鉄の含有量は乾燥重量の約 0.009% に相当する植物で、すべての生物で幾分低いです。日付、火炎吸収原子分光学植物組織中の鉄濃度を測定する最も正確な方法の一つです。ただし、この方法は時間がかかり、高価な一般的植物研究所は、特定の機器が必要です。したがって、日常的に使用することができます簡単に、まだ正確な方法が必要です。比色のプルシアン ブルー メソッドは、動物や植物の組織切片の染色質の鉄の定期的に使用されます。本研究では、タバコ中の鉄の定量計測法の葉プルシアン ブルーを適応.原子分光学と同じ試料中の鉄の含有量を測定し、線形回帰を発見する染色プルシアン ブルーの両方を使用してこのメソッドの精度を検証しました (R² = 0.988) 2 つのプロシージャの間。我々 はプルシアン ブルーの植物組織定量的鉄測定法は正確な単純な安価な結論します。しかし、ここで紹介する線形回帰はサンプルと試薬の潜在的な相互作用のための他の植物種のために適切かもしれない。回帰曲線の確立は別の植物種にしたがって必要です。

概要

鉄 (Fe) は、すべての生物に重要な微量栄養素です。植物の呼吸、光合成とクロロフィル生合成などの基本的なプロセスに関与のため必須微量栄養素¹についてです。無料鉄多価イオンの高集積植物細胞酸化ストレスを引き起こすフリーラジカルのリリースにつながる反応のために有害です。植物細胞内鉄の恒常性を維持するために、イオンは液胞に格納され、フェリチン、鉄の恒常性²に直接関与するタンパク質ケージおよびすべての生きている有機体の鉄の主要な記憶域構造内で隔離。同時には、鉄欠乏性貧血は、植物鉄 biofortification の増加が必要で、その結果、人間の人口のかなりの割合を影響します。植物フェリチンのユニークな性質上、フェリチン鉄食品濃縮栄養失調³のこの問題を戦うために有望な戦略を提供しています。

鉄イオンは、主に 2 つ酸化状態、すなわち鉄 (2価 Fe^{2 +}または鉄 (II))、鉄 (三価 Fe^{3 +}または鉄 (III)) フォーム。鉄、鉄クラスター⁴などのいくつかの他の形態はまた細胞であります。Fe はセルと自然フォーム ヘマタイト (Fe₂O₃) と ferryhidrites 内の酸化鉄として格納されます ((Fe^{3 +})₂O₃•0.5 H₂O)⁵生理学的な条件の下で。これらの反応は、特に鉄のフォームに形成された水酸化物非常に低い容解性があります。鉄保持は、pH 5⁶上固体状態で主はその結果、溶液の pH によって影響を受けます。

溶解性が悪い、Fe の高反応性を考慮した植物組織や器官の間での転送が適切なキレート分子と関連付ける必要があります。また、鉄と鉄のフォーム¹の間の酸化還元状態を制御する必要があります。葉、内鉄の約 80% は、電子伝達系、チトクローム、葉緑素と他のヘム分子の生合成に重要な役割はそのための光合成細胞で発見され、鉄 S の形成におけるクラスター⁷。セル内の余分な鉄の場合、黒字はフェリチン分子⁸金属が保存されている液胞に転流します。

鉄は、いくつかの方法、含む火炎原子吸収分光法⁹ (FAAS) または比色試金¹⁰, 前者は後者よりもはるかに正確な植物組織で測定できます。FAAS は、個々 の要素の電磁放射に基づくサンプルの元素組成を決定することができる精度の高い手法です。FAAS に変換します金属イオン原子状態のサンプルでは、炎加熱による特定イオンの基底状態に戻るときに特定の波長のイオン励起と放射に 。別のイオンからの排出量は、分光器で区切られ、吸収センサー¹¹によって検出されました。したがって、FAAS は直接鉄濃度を定量化する提供しています。しかし、生体組織中の鉄を可視化するための他の手法が利用できます。誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS)¹²は、鉄などの微量要素を測定するための非常に正確な技術、機器、FAAS と ICP-MS の両方の不足が共通問題。その一方で、チオシアン酸測色¹³による鉄の測定は、精度を欠いている、サンプル間の小さな変化を検出する失敗します。プルシアン ブルー染色^14,15,16,17は鉄フェロシアン化カリウム (K₄Fe(CN)₆) 生産、鉄イオンとの反応に基づく間接法、青い色の強い、動物や植物の組織の組織学的セクションで質的な鉄の検出に使用されます。

金属 (ゼロ原子価) 鉄は、リソスフェアのまれです。環境中の鉄の支配的な非複合イオンの形態は、ほとんど無酸素環境で比較的より豊富である鉄と鉄有酸素サイトの色合いが強い、周囲の酸素の量によって決まります。鉄酸化の原因となるエージェントはしばしば無酸素、酸性環境¹⁸で異なるが、この後者の形式、非常に酸性環境で支配的なも。4% で鉄を溶解するとき HCl (pH 0) 好気性環境で、希薄化後の鉄の主要な部分として存在する、鉄 (Fe^{3 +})^19,20を形成します。

鉄イオンと K₄Fe(CN)₆の反応は次のとおりです。

Fe^{3 +}: した FeCl₃ + K₄Fe(CN)₆ KFe(III)Fe(II)(CN)₆̄ + 3KCl =

Fe^{2 +}: 2 K₄Fe(CN)₆ + 4 のした FeCl₂ = 鉄₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 KCl

本研究で我々 はプルシアン ブルー染色することができますソリューションの鉄のレベルを測定するために役立つかどうか尋ねた。

当初は、水溶液中の Fe の濃度とプルシアン ブルー染色の相関関係を検証しました。水溶液中で (した FeCl₂、した FeCl₃または 2 つの 1:1 混合物) として Fe 濃度は、プルシアン ブルーの付加の後で原子分光法と吸光度 (OD) の両方を測定しました。図 1は、それぞれの方法によって得られる測定の線形回帰曲線を示しています。溶液中の鉄濃度の定量分析のためプルシアン ブルーのメソッドを使用できますと結論づけた。

図 1: FAAS と光の吸光度によって測定される Fe 濃度の線形回帰 (OD、715 nm) プルシアン ブルーによる得られた。青い正方形とラインは Fe^{2 +}ソリューションを表す、赤い四角形と線 Fe^{3 +}ソリューションおよび黒い正方形を表しライン Fe^{2 +}と Fe^{3 +}の間の 1:1 混合物。次の回帰が得られた: [Fe^{2 +}] = 3 + 123 x 外径 r 0.996、R² = = 0.989;[Fe^{3 +}] = 1 + 292 x 外径 r = 0.999、R² = 0.997;[Fe^{2 +/3 +}] = 11 + 146 x 外径 r = 0.983、R² = 0.956。Fe^{2 +}ドナーした FeCl₂ Fe^{3 +}ドナーした FeCl₃であった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

比色プルシアン ブルー植物組織の鉄の定量分析法を適応し、火炎吸収原子分光学とプルシアン ブルー染色によりタバコ葉灰の鉄含有量を測定しました。2 つの手法から結果の相関があった。

プロトコル

1. 植物材料と成長条件

1. 5 cm × 5 cm ポット当たり種子 1 つタバコ (品種サムスン) は標準的なポットの中に満ちています。トレイにポットを置きます。23 ° C の一定温度で長い一日 (16/8 h/暗) 条件の下で成長部屋の植物を育てるポットから排水まで水道水で灌漑します。
2. 50±5 日後、実験用に最適の濃度によると、灌漑で Fe 治療を開始します。たとえば、0 から 6 mm、可溶性鉄キレート剤 (Fe EDDHA) によって補われる鉄濃度の範囲を使いました。水を引く適切なソリューションが付いている植物 2 日毎 (脱水症状を避けるため) に 6-8 日の。

2. 鉄測定葉の準備

メモ: 使用するすべての材料がある必要があります鉄無料の鉄汚染.の危険性を減らすために4% 塩酸溶液で 2 回すりこぎをきれいにし乾燥ろ紙を使用する前にするたびに。任意の材料を再使用する場合二度 4% 塩酸溶液とそれをきれいにしろ紙を乾燥します。

1. 手袋 (任意の金属の装置を使用して) を使用して、手で茎から葉をデタッチします。各サンプルの葉 (生体重) 約 10 g を使用します。スプレー ボトルを使用して二重蒸留水 (DDW) 各葉をきれいに。この手順は、鉄の汚染を防止することが重要です。
2. ペーパー タオルの上葉を乾燥し、紙の袋に入れてください。80 ° C の一定温度でオーブンに 2 〜 3 日の紙バッグを転送します。
3. 乾燥時、モルタルと乳棒と滅菌 15 mL プラスチック チューブに転送を用いた粉体に葉を粉砕します。

3. 燃焼灰の葉

ノート: HCl (0) に近い低 pH 溶液の使用は、鉄の溶解度を増すものです。岩綿は、ガスが燃焼中にバイアルを脱出することを防ぐために使用されます。

1. その蓋なしの新しい、密封された 20 mL シンチレーション バイアルの重量を量る。値に注意してくださいまたはゼロ、風袋のボタンを使用して値を設定します。バイアルに砕いた乾燥葉 (サンプル) を追加します。
2. サンプルとコンテナーの重量を量るし、値に注意してください。ロックウールでバイアルを閉じます。
3. サンプルを追加することがなく 3 追加バイアルの重さし、その値に注意してください。これらのバイアルは、試料重量の増加につながっている可能性がありますロック ウールの量を評価するコントロールとして使用されます。
4. 炉内サンプルとコントロールのバイアルに置き温度以下を使用して書き込みを開始: 部屋の温度、高速 4 時間増資 425 ° C、および、最終的に、425 ° C。この時点で、乾燥した葉は灰になっているでしょう。
5. 約 100 ° C にダウン サンプルを冷ますがない、この温度湿度を避けるために次の 2 つの手順のため、以下は、サンプルの最終的な重量を影響するかもしれない。厚手の手袋を使用して、ピンセット、内方バイアルを保持炉からサンプルを削除します。
6. バイアルを平らな面に配置、岩綿を削除し、元の蓋と瓶を閉じます。
7. 3 コントロール バイアル (3.3 を参照) の重量を量るし、自分の平均体重を計算します。体重増加が等しい場合または上記灰重量の 1% に (手順 4.2 を参照)、測定誤差の推定値としてこの値を使用します。

4. 鉄測定の灰を準備

メモ: 初期サンプルの最終的な鉄濃度は塩酸の量で割った灰の重量として計算されます。

1. 1 M 塩酸溶液を準備 (4 %hcl) (プラスチックまたはガラス フラスコ) の DDW の 87.5 ml 12.5 mL 37% 塩酸原液を追加することによって。
2. 15 mL プラスチック チューブの重量を量ると値に注意してくださいまたは、風袋のボタンを使用してゼロ値に設定。遺灰を転送管、計量、そして値をメモします。これは、灰の重量です。
3. 灰の中に 1 M 塩酸 5 mL を追加します。22 μ m フィルターをフィルターして灰と同じフィルターを使って 1 M HCl の追加 5 mL を追加します。
4. 最終巻は 10 mL をする必要があります。フィルターにソリューションの一部が失われることに注意してください。
   注: サンプルは、FAAS またはプルシアン ブルー法による Fe 測定する準備が整いました。
5. Fe 濃度で検量線プルシアン ブルーによる原子吸光法によって測定する (図 4を参照) の各植物種。その後、単独でプルシアン ブルー法による Fe 濃度が測定できます。

5. FAAS により Fe 濃度の測定

1. FAAS による測定の各サンプルから 4 mL を削除します。
2. 灰の重さで FAAS 測定から得られた結果を分割します。(灰は 10 mL で溶いた) ので、0.01 で結果の値を分割します。結果の値はグラム灰 (ppm) ごとの鉄濃度です。

6. プルシアン ブルーの染色液の準備

1. 4% を準備 K₄Fe(CN)₆を 100 mL DDW と渦の 4 g を追加することによってソリューションをプルシアン ブルー (他のボリュームおよび/または濃度使用できます別の要求)。本研究ではより少なく集中することプルシアン ブルーのソリューションよりも以前に報告された (20%)¹⁴が使用されたことに注意してください。
2. 暗闇の中で使用されるまでの 4 ° C でのソリューションを保持します。ソリューションは、このような条件で保存する場合、6 ヶ月間安定です。

7. FAAS 結果を用いたプルシアン ブルーの較正曲線の生成

注: 次の式を使用して灰の鉄濃度を計算します。
式 1
C: 濃度、v: サンプル ボリューム w: 灰重量 (g) です。

1. プルシアン ブルーのソリューション、1 M HCl の 0.50 mL 0.50 mL を混ぜます。これは、空のソリューションとなります。
2. サンプルの 0.5 mL を混ぜる (4% 灰 HCl、セクション 3 で説明したよう)、ピペッティングによるプルシアン ブルー溶液 (ステップ 6.1) の 0.5 mL。しかし、最低 1 分間、5 分を待ちます。5 分後のサンプルで沈降が発生します。
3. キュベットにミックスを転送し、715 で外径を測定分光光度計を用いた nm。値に注意してください。
4. サンプルの灰重量 (ステップ 3.2) OD 値 (ステップ 7.3) を分割します。結果は、グラム灰あたり外径を表します。
5. FAAS 測定 (Y 軸) と OD 値から得られる鉄濃度の線形回帰のプロット (X 軸) です。5.2 と 7.4 手順で取得した結果を使用します。回帰式は、Y を計算する =、+ bX、Y が鉄濃度、吸光度が交差する表します、b を表す吸光度斜面を表し X OD。

8. 同じ植物のタイプから他のサンプルの鉄のレベルを決定するためプルシアン ブルー メソッドを使用してください。

メモ: この種の植物に、検量線は既に確立されて、以来同じ植物のタイプから任意の新しいサンプルの鉄濃度直接計算できます線形回帰式を使用します。

1. 3 と 4 の手順 7.1 7.4 に続いてのセクションで手順に従います。
2. 線形回帰 (ステップ 7.5) から得られた式を使って、溶液中の鉄の濃度を計算します。

結果

このプロトコルは正しく実施される、1 つはプルシアン ブルーと原子分光法によって得られた結果と良好な相関性を得る必要があります。したがって、次の実験に反映は、植物試料中の鉄濃度の正確な測定を取得するプルシアン ブルーのメソッドを簡単に使用できます。

タバコがプロトコルに記載を栽培され、異なる鉄?...

ディスカッション

植物組織の鉄の測定は、灌漑や他の環境条件の影響を評価するために非常に重要です。ここでは、他の植物種や組織に容易に合わせることができるタバコ葉における Fe コンテンツ測定のための簡単で正確な比色定量法について述べる。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.