JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לגרום של שחיקה השטח עינית של העכבר, בצע את לאחר מכן תהליך ריפוי הפצע. הפרוטוקול מנצל burr עינית חלקית להסרת האפיתל פני השטח של העין בעכברים מרדימים.

Abstract

הקרנית מאתר מספק מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע. הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של העין, וכך היא ההגנה הראשונה לפגיעה. למעשה, הוא הסוג הנפוץ ביותר של פגיעת עין שנמצאו קליניקה שחיקה הקרנית. כאן, אנו מנצלים של burr בעדשת העין לזירוז של שחיקה וכתוצאה מכך הסרת אפיתל הקרנית ויוו על עכברים מורדם. שיטה זו מאפשרת להפרעה יישוב, לשחזור אפיתל, עוזב בתחומים אחרים ללא פגע. בנוסף, אנו מתארים את הפריט החזותי של האפיתל משופשפים עם fluorescein מכתים, לספק ייעוץ קונקרטי על דרך להמחיש את הקרנית משופשפים. לאחר מכן, אנו עוקבים אחר ציר הזמן של ריפוי 0, 18 ו- 72 h לאחר שחיקה, עד שהפצע הוא epithelialized מחדש הפצע. המודל שחיקה אפיתל הקרנית הפגיעה הינו אידיאלי עבור מחקרים על התפשטות תאים אפיתל, הגירה, epithelialization מחדש של השכבות הקרנית. עם זאת, שיטה זו אינה אופטימלית ללמוד הפעלה סטרומה במהלך ריפוי הפצע, כי burr עינית שאינה לחדור אל הרבדים תאי סטרומה. שיטה זו מתאימה גם ליישומים קליניים, לדוגמה, ניסויים פרה-קליניים מבחן של יעילות התרופה.

Introduction

שכבות אפיתל של איברים רבים נחשפים לפציעות. עם זאת, הם גם מכילים את היכולת לפצות על אובדן הרקמות דרך ריפוי הפצע. הקרנית מציע מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע. זה יוצר על המשטח החיצוני של העין ומספק שכבת הגנה מכונות רישיות עינית. לפיכך, קרנית פונקציות כמו גדר ההפרדה גורמי מחלה, אובדן מים. הוא מורכב משלוש שכבות; האפיתל, משתית, אנדותל. האפיתל של הקרנית הופכת את השכבה החיצונית ביותר של הקרנית. תאים אפיתל לשמור על הפונקציה מכשול של הקרנית על ידי הקפדה זו לזו דרך צמתי צר1,2,3. Acellular הקרנית קרום המרתף, הקרום של באומן, מהנוזל האפיתל stroma מקיף, המכיל keratocytes עקשן. תחת stroma, תאי אנדותל ערוץ חומרים מזינים מים, חמצן על השכבה העליונה.

שריטות הקרנית נפוצים מאוד המרפאה4. פציעות בקרנית מגוונים, אך במידה רבה נגרמות על ידי חלקיקים קטנים כגון אבק או חול, שריטות או חפצים זרים אחרים. הפרוטוקול המתוארים כאן מטרות-להתרבות סוג הרלוונטית קלינית של שחיקה אפיתל הקרנית. בעשותו כן, פרוטוקול זה מספק שיטה לשליטה הזרע רופאים ומדענים הקרנית ליישם במחקרים משלהם. אנחנו שביצעת ויוו פציעה תיקון assay על הקרנית מאתר מאת ששרט את הרקמה עם צמח קוצני עינית dulled, השני Algerbrush. כאן, אנחנו למקד את השריטה רק על האפיתל הקרנית המרכזית ולהשאיר חלקים אחרים של איבר המין ללא נזק. כך, הפרוטוקול הוא אידיאלי כדי מחקר תאים אפיתל הקרנית דינמיקה או קרום המרתף במהלך epithelialization מחדש, התא ההעברה, התפשטות ובידול ויוו5. לאחרונה, מודל זה שימש כדי לנתח קדמון dynamics תא הקרנית מאתר כמו גם כדי לחשוף את היכולת של תאי אפיתל הקרנית הבדיל ביצירה מחדש את גומחת תאי גזע הקרנית לאחר פציעה6,7. בעקבות שחיקה, הקרנית חוזר חוזק ובשקיפות הרגיל שלה. מעניין, במחקר במבחנה ציינו שאת epithelialization מחדש תתרחש ללא התפשטות תאים מוגברת8. פרוטוקול זה מתאר את ציר הזמן של ריפוי ללא הפרעה הקרנית מאתר. השיטה ישימה ובכך לבחון את השפעת הסמים על ריפוי דפוסים ומהירות.

הקרנית כבר בשימוש נרחב עבור לימודי ריפוי הפצע. עם זאת, מחקרים רבים צריכים לסמוך על דגמים אחרים של פציעה. מודל ומבוססת של פגיעה הקרנית היא הכוויה אלקליין שהתבצעה על-ידי החלת הידרוקסיד הנתרן (NaOH) עם או בלי נייר סינון על פני הקרנית9. חשיפה אלקליין גורמת פגיעה גדולה, ' מאטום לשקוף ' משפיעה לא רק על אפיתל הקרנית, אלא גם את לחמית, משתית9,10. פתרונות אלקליין חזקה הוכחו לגרום כיבים הקרנית, opacification וכורוידאלית9. תאים דלקתיים לפלוש stroma בדרך כלל תוך 6 שעות ולהישאר שם עד 24 שעות11. לכן, פגיעה אלקליין היא שיטה מומלץ במחקרים הקשורים להפעלה סטרומה. סוג אחר של פגיעה כימיים יכולים להנחיל על-ידי החלת דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)9,הקרנית10. דגמים אחרים פציעה נפוצים כוללים incisional פצעים החודרים דרך הפצעים stroma, keratectomy, אשר מוגבלים לחלק העליון של ה-14,משתית15. שיטות אלה שימושיים גם לענות על שאלות לגבי ריפוי הפצע סטרומה. פציעה שונות הדגמים יש יתרונות וחסרונות משלהם. שחיקה, או הטריה, של האפיתל הקרנית פותחה לראשונה באמצעות ואזמלי מנתחים הושלו או להבים שמחוץ לקרנית16. שיטה זו כבר מאוחר יותר בשימוש ב- vivo על עכבר, חולדה ארנבת17,18,19,20,21,22. באמצעות של burr עינית (איור 1), אנחנו להסיר רק אזור שנבחר של האפיתל, משאיר את שאר האפיתל מעושה. בדרך זו, זה אפשרי למקד בדיוק להסרת האפיתל לחלקים שונים של הקרנית. בנוסף, גודל שחיקה יכול להידרש עם fluorescein מכתים. יתר על כן, כאן אנו עוקבים אחר הסגר שחיקה במהלך תקופת ההחלמה.

שיטה זו מהווה מספר יתרונות, i) כולל מיקומו המדוייק של שחיקה האתר, שאינה אפשרית עם פגיעה כימית, ii) שחיקה מהירה לביצוע, השלישי) זה לא פולשנית. במסמך זה, אנו מתארים את השיטה באמצעות העכבר NMRI outbred כמודל, אולם זה יכול להיות מיושם במגוון רחב של דגמים גנטיים העכבר, כמו גם עכבר, ארנב, אשר הם הדגמים הנפוצים המשמשות ללימוד הפרעה הקרנית האנושית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ניסויים אושרו על ידי מועצת המנהלים הלאומית ניסויים בבעלי חיים.

1. תכשירים

  1. להכין את כל הפתרונות ולשמור בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. עקוב אחר כללי סילוק פסולת חומרים השלך בשימוש ופתרונות.
  2. שימוש NMRI ו- ICR outbred מניות, בין הגילאים 4-12 שבועות או מגדר. אם משתמש המתח C57BL/6, בצע את שיטת ההכנה של קטמין-medetomidine בשלב 1.3.2. לקבלת צעדים נוספים, בצע את ההוראות המתוארות 1.3.3.-1.3.5.
  3. הכינו את רפואה וטרינרית טרי, בזמן לפני תחילת הפעולה. Carprofen ייעשה שימוש מאוחר יותר, ולכן זה לא הכרחי להכין אותו בשלב זה.
    1. כדי להתכונן פתרון של קטמין-medetomidine הרדמה, לערבב 0.375 mL (במניה ריכוז 50 מ"ג/מ"ל) של קטמין (Ketaminol וטרינר) עם 0.25 mL (במניה ריכוז 1 מ"ג/מ"ל) של medetomidine (Cepetor וטרינר) ולהוסיף 1.25 מ ל סטרילי 0.9% NaCl. לנהל 0.15 מ ל/20 גרם של משקל העכבר (7.5 מ"ג/ק"ג, קטמין, 1 מ"ג/ק"ג, medetomidine).
    2. כדי להתכונן פתרון ובדילול של קטמין-medetomidine הרדמה על עכברים C57BL/6, לערבב 0.375 mL (במניה ריכוז 50 מ"ג/מ"ל) של קטמין עם 0.25 mL (במניה ריכוז 1 מ"ג/מ"ל) של medetomidine ולהוסיף 2.5 מ של סטרילי 0.9% NaCl. לנהל 0.15 מ ל/20 גרם של משקל העכבר (3.75 מ"ג/ק"ג, קטמין ו- 0.5 מ"ג/ק"ג, medetomidine).
      הערה: זהו שלב חלופיים, רק עבור עכברים C57BL/6 למבוגרים.
    3. כדי להתכונן buprenorfin נגד כאבים, להוסיף 0.1 מ"ל (במניה ריכוז 0.3 מ"ג/מ"ל) של buprenorfin מ ל 1.9 של סטרילי 0.9% NaCl. לנהל 0.2 מ"ל/20 g העכבר משקל (0.15 מ"ג/ק"ג).
    4. כדי להכין atipamezole להפסקת הרדמה, להוסיף 0.1 מ"ל (במניה ריכוז 5 מ"ג/מ"ל) של atipamezole 4.9 מ של 0.9% NaCl. לנהל 0.15 מ ל/20 g העכבר משקל (0.75 מ ג/ק ג).
    5. לשימוש נגד כאבים במהלך פוסט-הרדמה carprofen. להוסיף 0.1 מ"ל (במניה ריכוז 50 מ"ג/מ"ל) של carprofen 4.9 מ של 0.9% NaCl. לנהל 0.15 מ ל/20 גרם של משקל העכבר (7.5 מ"ג/ק"ג).
  4. להכין פתרון מכתימים פלורסנט
    1. המדגימה את השריטה תחת אור כחול קובלט (איור 1), להשתמש פתרון פלורסנט. להכין פתרון fluorescein 0.1% על-ידי הראשון מדידה 10 מ ג של fluorescein מלח עם קנה מידה בסדר ולאחר מכן להוסיף אותה 10 מ ל תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
    2. על הפתרון fluorescein מפני אור ומנערים למשך 5 דקות על מטרף.
      הערה: הפתרון fluorescein הוא רגישים לאור; שמור את הפתרון מכוסה אור. פתרון זה ניתן לאחסן +4 ° C 2-3 ימים. לשימוש, זה עוזר למקם את הפתרון fluorescein בבקבוק טפי המשמשת עבור טיפות עיניים. השתמש במסנן-סטריליים בעת העברת הפתרון של הבקבוק טפי.
  5. לנקות את הטיפ עינית burr לפני ואחרי השימוש; בהתחלה עם PBS ולאחר מכן עם 70% EtOH. אם עושה שחיקה של מספר עכברים במהלך הפעולה זהה, לעשות את השלבים ניקוי בין כל עכבר.
  6. לשים את הצלחת מחוממת (+37 ° C) ומניחים מגבת נייר על זה.

2. שחיקה הקרנית

התראה: שימוש מגן ללבוש (כפפות, חלוק המעבדה) כאשר טיפול עכברים. שוקלים את העכבר כדי להעריך את עוצמת הקול של תרופות כדי לנהל.

  1. השתמש בשיטת scruffing עם יד אחת כדי להתמודד עם העכבר23. לנהל את התערובת קטמין-medetomidine intraperitoneally (i.p.) אל הבטן התחתונה השמאלית. הנח את העכבר לכלוב הפרט ולחכות לו להירדם. זה בדרך כלל לוקח פחות מ-5 דקות. לאחר מכן, לנהל buprenorfin הראשון ולאחר מכן atipamezole ויה i.p. זריקות. השתמש באותה שיטה טיפול.
    הערה: לאחר ההרדמה ניתנת, הפרוטוקול צריך לא ניתן להשהות בכל רגע.
  2. לפני שתמשיך, ודא לצלחת מחוממת חמים. הנח את העכבר anesthetized בצלחת מחוממת. הרמה של הרדמה היא טובה אם רפלקס הזנב נעדר, אך רפלקס הבוהן קיים. בדוק את הרפלקסים הללו על ידי צובט את הזנב ואת כל הבוהן עם אצבעות או מלקחיים. אל תשתמש בכוח מופרז. הרדמה יהיה האחרון 20-25 דקות.
  3. כדי להפוך של שחיקה, השתמש את burr עינית נקי. לסובב את בסיס burr כדי להפעיל את הרטט זה חיוני כדי להפוך את השריטה. מרגיש את הרטט ביד, כאשר burr מתפקד כראוי.
    1. פתח עין אחת בכל פעם על-ידי החזקת העפעפיים בנפרד עם האצבעות. לאחר מכן בחוזקה לגעת את burr בקרנית, לזוז אחורה וקדימה גם המכשיר כמו הצדה על פני עינית. הרטט burr יבצע השריטה; לא ללחוץ, ללחוץ או לקרוע את הקרנית. הקרנית המרכזית, 20 ששרט תנועות על פני השטח הם מספיק כדי לגרום את הפצע. לא להרים את burr ולנסות להישאר באזור של הקרנית כדי להיות שפשף בכוח. רכישת שחיקה בגודל סטנדרטי ידרוש מספר מחזורים של תרגול.

    הערה: asepsis המצמוץ יכולה להיות מושגת לפני שחיקה באמצעות פתרון אופטלמולוגיות betadine.

3. הדמיה של שחיקה

  1. להאיר את האזור משופשפים באמצעות האור עט כחול קובלט (איור 1) ו- fluorescein פתרון. השטח עינית מופיע צבע אור הסביבה. לאחר יישום fluorescein, האזור משופשפים שזוהר בירוק כאשר מאירים את העין בעזרת העט אור.
    1. אם יש צורך, לפתוח את העין משופשפים באופן דומה כמו 2.3 ולפקח טיפה אחת של fluorescein פתרון מהבקבוק טפי. לשטוף את העיניים פעם אחת עם PBS או 0.9% NaCl כדי להפחית את הרקע של fluorescein. השתמש בקבוק טפי או פיפטה לרחצה. וארוקן את הנוזלים משם עם מגבון רך ולנקות את הריסים, במידת הצורך. הנוזל העודף אוספת בדרך כלל על הגבול האף של העין, ליד הפתח של תעלת דמעות.
      התראה: להימנע מלגעת הקרנית בזמן cleaining כמו שריטות קלות עלול להיגרם.
  2. לצלם שחיקה הקרנית.
    1. כדי לקבל תמונות דומות בכל מפגש הדמיה, להשתמש בכלים מצורף יציב האור עט כחול קובלט, מצלמות slr דיגיטליות (איור 2). פרוטוקול זה מספק התקנה קלה לחזור (איור 2).
      1. כדי לצרף את האור עט ואת המצלמה, השתמש מנורת שולחן עם זרוע גמישה, מלחציים, זרוע מתכווננת מצלמה עם מלחציים, בהתאמה. אזיקון אור מנורת שולחן, עמדה מעל העין העכבר? העט. מיצוב האור אחרת עלולה לשנות את החזיית השריטה. הצעה עבור מיקום כלים אלה מתוארת באיור2.
    2. להשתמש מצלמות slr דיגיטליות לצלם תמונות של העין. מקום בעל החיים המרחק הרצוי ומעמד מיקוד המצלמה (1:12) חדר אור. לאחר מכן, סגור את כל האורות האחרים מלבד האור עט כחול קובלט.
      הערה: קלטת הידית האור עט למטה או השתמש גומייה כדי להשאיר את האור דולק כל הזמן במהלך דימות. זה יכול לעזור אם התמונה הופכת להיות מטושטש. . זה קל יותר לבצע את הצעד הדמיה עם עמית.

4. להתעורר לאחר שחיקה הקרנית

  1. לנהל buprenorfin הראשון ולאחר מכן atipamezole ויה i.p. זריקות. השתמש באותה שיטה טיפול כמו 2.1.
  2. הניחו טיפת, fucidin העין חומצה פלסטר (Isathal) לעיניים משופשפים והן שפשף בכוח ללא לחות ולשמור על פני עינית נקי מחיידקים לאחר הרדמה.
  3. כמו העכבר יתעורר בעוד 5-20 דקות בצלחת מחוממת, להתבונן בעכבר במהלך התקופה שלאחר הרדמה השכמה. כאשר זה הופך ניידים, למקם אותו לכלוב נפרד.
    הערה: אם מתעורר לוקח יותר זמן, הנח את העכבר בתוך הכלוב עם כרית מחוממת או למקם את הכלוב כולו על הצלחת מחוממת, לפקח על העכבר באופן קבוע. בזמן ההרדמה מתנדף, העכבר בדרך כלל מנערת, מגיע כלפי מעלה עם הגוף הקדמי. אופן פעולה זה יחזור להיות נורמאלי ב 3-4 שעות, ואז ניתן למקם את העכבר בחזרה אל כלוב משותפים.
  4. לנהל carprofen i.p. לקבלת משחה נגד כאבים ועין בשני ימים עוקבים אחרי השריטה, באופן דומה כמו צעדים 2.2. 4.2.

5. דימות במהלך ריפוי הפצע

  1. ב פרוטוקול זה, זמן שימוש הנקודות 18 h ו- 72 h לאחר שחיקה להתבונן על סגירת הפצע.
    1. עבור הדמיה רצופים, עזים ומתנגד העכברים כפי שהוסבר ב 2.2.
    2. צלם תמונות כפי שהוסבר ב 3.
    3. תתעורר של בעלי חיים atipamezole i.p. ונטר תקופת התעוררות כפי שהוסבר ב- 4.3.
      הערה: אם לא ממשיכים את המעקב, המתת חסד העכבר מיד אחרי 5.1.2. המתת חסד מתואר ב- 6.1.

6. קרנית אוסף והטבעה פרפין

  1. לאחר הנקודה בזמן האחרון, להקריב את החיה. הנח את העכבר בחדר זה יכול להיות מלא עם CO2. למלא את האוויר קאמרית עם CO2- כאשר החיה משותק, לנקוע חוליות צוואר הרחם על ידי מושך בחוזקה מבסיס של הזנב והקשה על אזור הצוואר למטה באותו הזמן.
    התראה: תמיד את ההנחיות של הגוף רווחת בעלי חיים מקומיים.
  2. לאסוף את כל גלגל העין על ידי חיתוך פתח בעור לצד של העין במספריים לנתיחה. מקם את המספריים תחת גלגל העין וחותכים העצב עינית כדי לפוצץ את גלגל העין מתוך המסלול. להשתמש מלקחיים אם העין לא יצא בקלות.
    1. תעשה חור בחלק האחורי של העין, בצד ברשתית, עם מחט 26G כדי לאפשר חדירה חינם של פתרונות בתוך העין.
      הערה: אל תתנו את העין להיות יבש, במקום זאת, נזכרתי ב- PBS עד שתמשיך עם הפרוטוקול.
  3. לאסוף את גלגל העין צינור 2 מ"ל עם PBS. אל תשתהה בנקודה הזאת מהניסוי.
  4. הסר PBS, לתקן את העיניים ב 4% paraformaldehyde (PFA) +4 º C למשך 4-5 שעות.
  5. להעביר את גלגל העין קבוע קלטת רקמות לצורך עיבוד רקמה. השתמש בממחטה עיבוד מחשב לבין התוכנית הבאה:
    1. לשטוף עם PBS.
    2. דגירה 2 x 45 דקות ב- 70% אתנול בטמפרטורת החדר.
    3. דגירה 2 x 1 h ב- 94% אתנול בטמפרטורת החדר.
    4. דגירה 3 x 45 דקות באתנול מוחלטת בטמפרטורת החדר.
    5. דגירה 3 x 1 h, קסילן, בטמפרטורת החדר, קסילן האחרון ב 37 º C.
    6. דגירה 3 x 1 h בפרפין ב 60 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר עיבוד רקמה, להטביע את גלגל העין לתוך שמן פראפין (+ 60 ° C) באמצעות בלוק ההטבעה רקמות. המקום העין בתוך הרחוב כך זה נראה מהצד, הגבול היקפיים פונה כלפי מעלה. תן את הבלוק לחזק על צלחת מגניב במשך 5-10 דקות.

7. פרפין מקטעים של הקרנית

  1. הכינו את האזמל הקטן על חלוקתה לפי ההוראות של מוסד או של היצרן.
    התראה: להיות זהיר בעת טיפול הלהב מיקרוטום חדה.
  2. המקום אמבט מים אחד עם מים בטמפרטורת החדר הנדסה גנטית לצד האזמל הקטן ועוד עם הנדסה גנטית מים מחומם ל +50 ° C.
  3. הפוך את 5 מיקרומטר. הסעיפים עבה של גלגל העין.
    הערה: העדשה מעברי בקלות במהלך חלוקתה. כדי למנוע זאת, לנגב את המשטח עם ממחטה לחה בכל שורה חדשה של מקטעים מופעל. להשתמש במי ברז כדי להרטיב את הרקמה.
  4. במקום הסעיפים לצד השני באמבט מים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להעביר אותם אמבט מים חמים עם העזרה של זכוכית. למתוח את הסעיפים לאמבט מים חמים עד כל הקמטים להירגע, צבע המאט מקטעים להפוך.
  5. יבש את השקופיות זכוכית עם מקטעים לילה ב- +37 ° C.
  6. לצרף את המקטעים השקופיות על ידי שמירה על השקופית במשך דקה אחת על צלחת מחוממת ב +60 ° C. אחרי זה, הסעיפים ניתן ישירות מעובד עבור צביעת, שיטות immunohistological או מאוחסנים +4 ° C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר מודל לגרום פגיעה שחיקה הקרנית העכבר ומציעה כיצד פעל והמחש את תהליך הריפוי לאחר שחיקה. לאחרונה, אנחנו מועסקים בשיטה זו כדי ללמוד את התפקיד של ובתאים אפיתל הקרנית במהלך6ריפוי הפצע. שימוש בכלים הוקמה היא המפתח ניסוי מוצלח שחיקה. אנחנו, ואחרים, ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיטות ופצעו הם כלים פופולריים ללמוד היבטים שונים של הומאוסטזיס הקרנית, פתולוגיות. המודל שחיקה מציע שיטה ומבוקרות היטב כדי לטפל בבעיות רלוונטיות עיניים. עם זאת, נקודות קריטיות מסוימות בפרוטוקול שווים תוך שימת דגש. ראוי לציין, הפרטים המפורטים לגבי רפואה וטרינרית, ציר זמן ריפוי הפצע, ו התוצא?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות Ikkala קאיזה שלה בפז סיוע טכני, תובנה עזרה בעת שמצדדי בשיטה זו, כמו גם בהמשך במהלך הביצוע שלנו שאלות מחקר מרכזי. אנחנו גם רוצה להודות לה עזרה בתכנון הקווים המנחים של העבודה וטרינרית מעבדה חיה במרכז, אנה מלר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NMRI mouseEnvigo275
0.9% NaCluse sterile
MedetomidineVetmedicVnr087896Market name: Cepetor Vet
KetamineIntervetVnr511485Market name: Ketaminol Vet
BuprenorfinInvidior3015248Market name: Temgesic
AtipamezolOrion PharmaVnr471953Market name: Antisedan Vet
CarprofenNorbrookVnr027579Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointmentDechraVnr080899Market name: Isathal
Fluorescein saltSigma-AldrichF6377
Phosphate-buffered saline solutionPBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)Algerbrush6.39768E+11
Cobalt Blue pen lightSP ServicesDE/003
Hot plateKunz Instruments2007-0217
Digital SLR cameraNikonD80
Adjustable camera arm and clampNeewer10086132Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clampPrisma
Soft wipeKimtechScience7552
CO2 chamber
Dissection toolsetFine Science Tools
SyringesBeckton Dickinson303172
26G needlesBeckton Dickinson303800
2 mL Eppendorf tubeSarstedt689
Tissue casetteSakura Finetech4118F
Tissue processing machine ASP200SLeica
XyleneVWRUN1307
Paraffin waxMilliporeK95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mmSakura Finetech4123
MicrotomeMicromHM355
Water bath for sectioningOrthex60591
Water bath for sectioningLeicaHI1210
Microtome bladeFeatherS35
Glass slideTh.Geyer GmbH & Co.7,695,019
Ultrapure waterMilliporeMPGP04001MilliQ
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127PFA

References

  1. Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
  2. Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
  3. Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
  4. Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713(1960).
  5. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  6. Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
  7. Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
  8. Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936(2012).
  9. Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  10. Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
  11. Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  12. Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370(2015).
  13. Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505(2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262(2013).
  16. Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
  17. Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
  18. Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
  19. Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776(2015).
  20. Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
  21. Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
  22. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  23. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
  24. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  25. Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
  26. Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
  27. Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
  28. Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786(2012).
  29. Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
  30. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137burrfluorescein

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved