角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

要約

このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア マウスで目の表面の上皮を部分的に削除する眼はりのプロトコルを活用します。

要約

マウス角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供します。角膜は、目の最も外側の層となる傷害に最初の防衛.実際には、クリニックの目傷害の最も一般的なタイプは角膜上皮剥離です。ここでは、角膜上皮、体内麻酔下マウスの除去、摩耗を誘発する眼バリを利用します。このメソッドは、ターゲットで再現可能な上皮の中断、その他の部分をそのままにできます。また、フルオレセイン染色とすりむいた上皮の可視化を記述する、すりむいた角膜を視覚化する方法について具体的なアドバイスを提供しています。創傷治癒の 0、18、および 72 時間後摩耗、傷は再 epithelialized までのタイムラインを従います。角膜損傷の上皮摩耗モデルは、上皮細胞の増殖, 移行および角膜の層の再上皮化に関する研究に最適です。ただし、このメソッドは眼のバリが間質細胞の層に浸透していないため創傷が治癒過程における間質の活性化を研究するが最適ではありません。このメソッドは、薬の効果の前臨床試験などの臨床応用に適しています。

概要

多くの器官の上皮層は、傷害にさらされています。ただし、創傷治癒過程での組織の損失を賠償する能力も含まれます。角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供しています。それは眼の外部表面を形作り、敏感な眼機械の保護レイヤーを提供します。したがって、角膜は、病原体や水の損失に物理的な障壁として機能します。3 つの層から成り立っています上皮、実質、内皮細胞。角膜の上皮は角膜の最も外側の層になります。上皮細胞は互いにタイトな接合^1,2,3を厳密に遵守することで角膜のバリア機能を維持します。無細胞性角膜基底膜、ボーマン膜は、難治性の実質細胞が含まれている広範な間質から上皮を分離します。実質の下で血管内皮細胞チャネル栄養素、水、および上位層への酸素。

角膜の傷、クリニック⁴で非常に一般的です。角膜への傷害は様々 で、主にほこりや砂、傷、または他の異物のような小さな粒子によって引き起こされます。プロトコルは、角膜上皮の摩耗、臨床的に関連するタイプを再現するために目的を紹介します。そうでは、このプロトコルは、臨床医や角膜科学者が独自の研究で実装するため制御し、精液メソッドを提供します。鈍く眼バリ、Algerbrush II と組織を研磨し、マウス角膜の体内の損傷修復アッセイを行った。ここでは、ターゲット中心部の角膜上皮にのみ耐摩耗と損傷することがなく器官の他の部分を残して。したがって、移行、増殖と分化体内⁵のセル プロトコルは再上皮化時に研究角膜上皮細胞や基底膜に最適です。最近では、このモデルは、前駆細胞の動態解析けが^6、7の後角膜上皮幹細胞ニッチを再確立する差別化された角膜上皮細胞の容量を発表するだけでなくマウス角膜を分析に使用されました。次の摩耗、角膜はその通常の透明性、引張強さに返します。興味深いことに、その再上皮化が細胞増殖⁸なし発生する生体外で研究が示されます。このプロトコルでは、マウスの角膜で中断のない癒しのタイムラインについて説明します。したがって、メソッドは癒しのパターンと速度で薬の効果をテストする適用です。

角膜は、創傷治癒の研究に広く使用されています。しかし、多くの研究は、傷害の他のモデルに依存しています。⁹角膜表面にフィルター ペーパーの有無、角膜損傷の確立モデルは水酸化ナトリウム (NaOH) を適用することによって実行されるアルカリ火傷です。角膜の上皮だけでなく、結膜と実質^9,10に影響大とびまん性損傷でアルカリ暴露します。強いアルカリ液は血管新生⁹混濁、角膜潰瘍を誘発する示されています。炎症細胞は、通常 6 時間以内実質に侵入し、24 h¹¹までそこに残る。したがって、アルカリ外傷は間質の活性化に関連する研究のことをお勧め方法です。化学傷害の別のタイプは、角膜^9,10ジメチルスルホキシド (DMSO) を適用することによって加えることができます。他の一般的に使用される傷害モデル、実質^14,15の上の部分に制限されて実質と角膜切除の傷を貫通切開創の傷があります。これらのメソッドは、間質の創傷治癒に関する質問に回答もな。異なった傷害モデルには、独自の長所と短所があります。摩耗、または角膜の上皮のデブリードマンは最初鈍くメスやブレードを使用して前のヴィヴォ角膜¹⁶に開発されました。このメソッドは、使用される生体内でマウス、ラット、ウサギ^{17,18,19,20,21,22}後されています。眼のはり (図 1) を使用して、我々 上皮の残りの部分は影響を受けないまま、上皮の選択した領域のみを削除します。このように、角膜のさまざまな部分に上皮の除去を細かく指定することが可能です。さらに、摩耗のサイズは、フルオレセイン染色と評価できます。さらに、ここで我々 は治癒期間中摩耗閉鎖を従います。

このメソッドは、いくつかの利点をもたらす、i) 化学損傷では不可能です、耐摩耗のサイトの正確な位置を含む ii) 耐摩耗性を実行するクイック、iii) 非侵襲的です。ここで、しかし、これはラット、ウサギ、ヒトの角膜障害を研究するために使用の一般的なモデルであるだけでなく遺伝的マウスモデルの広大な配列に適用される可能性がモデルとしてザイモグラムの当所のマウスを使用して方法を述べる.

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プロトコル

すべての実験は、全国の動物実験委員会によって承認されています。

1. 準備

1. すべてのソリューションを準備し、特記されない場合はで部屋の温度を維持します。Dispose が使用される材料およびソリューション廃棄物規則に従ってください。
2. 使用当所と ICR ザイモグラム株、どちらかの性別と年齢 4-12 週の間。C57BL/6 株を使用している場合手順 1.3.2 でケタミン-メデトミジン調製法に従ってください。その他の手順については、1.3.3.-1.3.5 に記載されている指示に従います。
3. 新鮮で時間操作を開始する前に、獣医学を準備します。カルプロフェンは後で使用される、従ってこの時点でそれを準備する必要はありません。
   1. 麻酔のケタミン-メデトミジンのソリューションを準備をするミックス 0.375 mL (濃度をストック 50 mg/mL) 0.25 ml (Ketaminol 獣医) ケタミンの (ストック濃度 1 mg/mL) メデトミジン (Cepetor 獣医) の滅菌 0.9 %1.25 mL を加えると塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (7.5 mg/kg、ケタミン、メデトミジン 1 mg/kg) を管理します。
   2. C57bl/6 マウスの麻酔のケタミン-メデトミジンのより希薄溶液を準備をするミックス 0.375 mL (濃度をストック 50 mg/mL) 0.25 mL とケタミンの (ストック濃度 1 mg/mL) メデトミジンの滅菌の 0.9% の 2.5 mL を加えると塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (3.75 mg/kg、ケタミン、メデトミジン 0.5 mg/kg) を管理します。
      注: これは大人 c57bl/6 マウスの唯一の代替手順です。
   3. 鎮痛のため buprenorfin を準備するには、0.1 mL を追加 (ストック濃度 0.3 mg/mL) 1.9 mL 滅菌の 0.9% に buprenorfin の塩化ナトリウム。0.2 mL/20 g のマウスの重量 (0.15 mg/kg) を管理します。
   4. 麻酔を中止のアチパメゾールを準備するには、0.1 mL を追加 (ストック濃度 5 mg/mL) の 0.9 %4.9 mL に対するアチパメゾールの塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウスの重量 (0.75 mg/kg) を管理します。
   5. 鎮痛後麻酔中カルプロフェンを使用します。0.1 mL を追加 (ストック濃度 50 mg/mL) カルプロフェン 0.9 %4.9 ml の塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (7.5 mg/kg) を管理します。
4. 蛍光染色液を準備します。
   1. コバルト ブルーの光 (図 1) の下で耐摩耗性を可視化する蛍光ソリューションを使用します。微細なスケールとフルオレセイン塩の最初の測定 10 mg 0.1% フルオレセイン液を準備し、リン酸緩衝生理食塩水液 (PBS) で 10 mL に追加します。
   2. フルオレセイン溶液の光から保護、シェーカーで 5 分間振る。
      注: フルオレセイン ソリューションは、光に敏感な;光からカバー ソリューションをしてください。このソリューションは、2 ~ 3 日は +4 ° C に格納できます。用では、点眼薬に使用されるスポイト ボトルにフルオレセイン ソリューションを配置することをお勧めします。ドロッパー ボトルにソリューションを移動するときは、滅菌フィルターを使用します。
5. 前に、と使用後に眼のバリのヒントをきれいまず PBS とし、70 %etoh。場合同じ操作中にいくつかのマウスにキズを作って、各マウスのクリーニングの手順を行います。
6. (37 ° C) の温水プレートを入れて、ペーパー タオルを置きます。

2. 角膜上皮剥離

注意: とき防護服 (白衣、手袋) を使用してマウスを処理します。管理する薬の量を見積もるには、マウスの重量を量る。

1. 片手スクラッフィング メソッドを使用して、マウス²³を処理します。ケタミン-メデトミジン混合物を腹腔内管理 (i. p.) 左下腹部に。個々 のケージにマウスを置くし、眠りに落ちるを待ちます。これは通常 5 分未満がかかります。その後、最初の buprenorfin をクリックし、i. p. 注射を介してアチパメゾールを管理します。同じ処理テクニックを使用します。
   注: 麻酔を指定すると、プロトコル必要があります一時停止できません任意の時点で。
2. 前に、加熱面が暖かいことを確認します。加熱平板上麻酔下のマウスを置きます。尾反射はつま先反射が存在が不在の場合は、麻酔のレベルをお勧めします。尾と、つま先の指または鉗子でつまんでこれらの反射を確認します。過度の力を使用しないでください。麻酔は、最後の 20-25 分です。
3. キズをするためには、洗浄の眼のはりを使用します。摩耗させる振動をオンにするバリのベースを回転させます。バリが正しく機能しているとき、手に振動を感じる。
   1. 別に指でまぶたを保持することによって一度に 1 つ目を開いています。その後しっかりとギザギザが角膜に触れるし、眼表面の楽器同様、前後の移動は横に限り。バリ振動はゼロ; を実行します。押して、振るか角膜を引き裂きます。角膜中央部 20 研磨表面の動きが傷を誘導するために十分です。バリを持ち上げ、磨耗する角膜の領域に滞在してください。標準サイズの摩耗を取得いくつかのラウンド練習が必要になります。
   
   注: 角膜無菌は、betadine 点眼液を使用して摩耗する前に達成することができます。

3. 摩耗のイメージング

1. コバルト ブルーのペンライト (図 1) とフルオレセインのソリューションを使用して研磨領域を照らします。眼の表面は周囲の光で無色の表示されます。フルオレセイン アプリケーション後研磨領域蛍光を発する緑色の光ペンで目を照らすとき。
   1. 必要な場合、2.3 同様に研磨目を開き、ドロッパー ボトルからフルオレセイン液の一滴を管理します。PBS または 0.9% 回、目を洗う、フルオレセインの背景を減らすために、NaCl。洗浄用スポイト ボトルやピペットを使用します。ソフトのワイプで液体を離れて吸い出しなさいし、に応じて、まつげの汚れを落としてください。余分な液体は通常涙運河の開口部の近くに、目の鼻側の境界に収集します。
      注意: は、マイナーな擦り傷が誘発されるかもしれないと cleaining、角膜に触れることを避けます。
2. 角膜上皮剥離の写真を撮る。
   1. 各撮像セッション中に類似画像を取得するには、コバルト ブルーのペンライトと一眼レフ カメラ (図 2) の安定した添付ファイルのツールを使用します。このプロトコルは、(図 2) を繰り返しやすいセットアップを提供します。
      1. ペン ライトとカメラを添付するには、テーブル ランプ フレキシブル アームとクランプ調整可能なカメラの腕と、クランプでそれぞれ使用します。ケーブルタイ テーブル ランプとマウスの目のすぐ上の位置に光のペン。光を異なる位置決め、耐摩耗性の可視化を変更可能性があります。これらのツールを位置決めのための提案は、図 2で説明します。
   2. 目の写真を撮るための一眼レフ カメラを使用します。部屋の光に必要な距離と位置とフォーカス カメラ (1:12) に動物を配置します。その後、コバルト ブルーのペンライトを除く他のすべてのライトを閉じます。
      注: をペン ライト ハンドルをテープまたはイメージ投射の間のすべての時間にライトを保つためにゴムバンドを使用します。これは、画像が不鮮明になる場合に役立つかもしれない。同僚とイメージング手順を実行する簡単です。

4. 角膜上皮剥離後に目覚める

1. 最初 buprenorfin し、i. p. 注射を介してアチパメゾールを管理します。2.1 と同じ処理方法を使用します。
2. 抗菌、フシジン酸酸眼軟膏 (Isathal) に潤いと麻酔後細菌からきれいな眼の表面を保つすりむいたと非摩耗の目に一滴を配置します。
3. マウスは 5 ~ 20 分加熱平板上で美味しいが、麻酔後のウェイク アップ期間中にマウスを観察します。モバイルになれば、個々 のケージに配置します。
   注: 目を覚ます時間がかかります、加熱パッドで檻の中にマウスを置くをクリックするか、または加熱平板上全体のケージに配置、マウスを定期的に監視します。麻酔が身に着けている間、マウスは通常振るし、体前葉と上向きに達する。この現象は、3-4 時間で正常に返す必要があります、共有ケージに戻るマウスをいただくことができます。
4. 手順 2.2 同様、摩耗後 2 日連続で鎮痛・眼軟膏のカルプロフェン i. p. を管理します。4.2 と。

5. 創傷治癒過程におけるイメージング

1. このプロトコルで使用時間は、傷の閉鎖を観察する摩耗後の 18 h、72 h を指します。
   1. 連続イメージング 2.2 で説明したように、マウスを麻酔します。
   2. 3 で説明したように、写真を撮る。
   3. アチパメゾール i. p. を持つ動物を覚ます、4.3 で説明したように、ウェイク アップ期間を監視します。
      注: いない場合はフォロー アップを継続、5.1.2 の直後にマウスを安楽死させます。安楽死は、6.1 で説明されます。

6. 角膜コレクションとパラフィン包埋

1. 最後の時間以降は、動物を犠牲に。CO₂を満たすことができるチャンバーにマウスを配置します。CO でチャンバー内の空気を埋める_2.動物、モバイル、尾の根元からしっかりと引っ張ってくると同時に頸部を押し、頸椎を脱臼します。
   注意: 常に動物愛護の体のガイドラインに従ってください。
2. 目の側に解剖はさみで皮膚の開口部を切断することによって全体の眼球を収集します。眼球の下ではさみを置き、軌道から目玉をポップに眼神経をカットします。目は簡単に出ない場合は、鉗子を使用します。
   1. 眼の中のソリューションの無料浸透を許可する 26 G 針で網膜側で、目の後ろの穴を作る。
      注: は、乾燥の代わりになる、プロトコルを続行まで PBS に目をさせてください。
3. PBS で 2 mL チューブに眼球を収集します。この時点で実験を一時停止しません。
4. PBS を削除し、4 ~ 5 時間 +4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で眼球を修正します。
5. 組織カセット ティッシュの処理のために固定の眼球を移動します。組織の加工機械と次のプログラムを使用します。
   1. PBS で洗い。
   2. 2 x 45 分 70% エタノール室温で孵化させなさい。
   3. 2 x 1 h 94% エタノール室温で孵化させなさい。
   4. 室温での無水エタノールで 3 x 45 分を孵化させなさい。
   5. 常温、37 ° C で最後キシレン キシレンの 3 x 1 h を孵化させなさい
   6. 60 ° C でパラフィン ワックスで 3 × 1 h を孵化させなさい
6. 処理組織後、眼球に埋め込む組織埋め込みブロックを使用した流動パラフィン (+ 60 の ° C)。ブロック内目を置き、それが横にいると周辺の境界線上を向いています。クール プレートに 5-10 分を固めるブロックができます。

7. 角膜のパラフィン切片

1. 機関のまたは製造元の指示に従って断面のミクロトームを準備します。
   注意: は、シャープのミクロトーム刃を処理するとき注意してください。
2. ミクロトームの横にある室内温純水と場所 1 浴と別超純水 +50 ° C に加熱
3. 眼球の 5 μ m 厚いセクションを確認します。
   注: 断面中に簡単にレンズ改。これを避けるためには、セクションの新しい行を起動するたびに湿った組織切削の表面を拭いてください。ティッシュを湿らせて、水道水を使用します。
4. 室温水お風呂で互いに横にセクションを配置し、スライド グラスの助けを借りてお湯のお風呂に移動します。湯浴まですべてしわリラックスおよびセクションになるマット内のセクションをストレッチします。
5. 37 ° C で一晩のセクションのスライド ガラスを乾燥します。
6. +60 ° C で加熱平板上 1 分スライドを維持することでセクションをスライドに添付します。この後、セクションことができます直接処理染色、免疫組織学的手法や +4 ° C で保存

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結果

このプロトコルは、マウス角膜への摩耗損傷を負わせるモデルについて説明し、従うし、摩耗後の癒しのプロセスを視覚化する方法を示唆しています。最近では、創傷治癒の⁶中に角膜上皮幹細胞の役割を研究するこのメソッドを採用しました。確立されたツールの使用は正常な摩耗実験への鍵です。我々 などは、擦り傷^6,<...

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ディスカッション

負傷メソッドは、角膜の恒常性と病態のさまざまな側面を研究するための人気のあるツールです。耐摩耗性モデルでは、眼科に関連する問題に対処するため、よく制御された方法を提供しています。ただし、プロトコルの特定の重要なポイントは強調する価値が。特に、獣医、創傷治癒のタイムライン、および結果について説明詳細はザイモグラム技研や ICR 株式での使用に最適化されたが?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA