각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

요약

이 프로토콜, 마우스의 눈 표면에 마모를 및 상처 치유 과정 그 후에 따라 메서드를 설명 합니다. 프로토콜은 부분적으로 anaesthetized 쥐에서 눈의 표면 상피를 제거 하는 눈 버 합니다.

초록

Murine 각 막 상처 치유를 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 각 막, 눈의 가장 바깥쪽 레이어 이며 따라서 부상으로 첫 번째 방어 이다. 사실, 눈 부상 클리닉에서 발견의 가장 일반적인 유형은 각 막 마포 이다. 여기, 우리는 인 제거는 각 막 상피에 vivo에서 쥐를 마 취에 한 마모를 유발 하는 눈 버를 활용 합니다. 이 메서드는 타겟과 재현 상피 중단, 그대로 다른 지역에 대 한 수 있습니다. 또한, 우리 fluorescein 얼룩과 침식된 상피의 시각화를 설명 하 고 각 막이 침식된을 시각화 하는 방법에 구체적인 조언을 제공. 다음, 우리는 상처는 상처는 다시 epithelialized 때까지 0, 18, 및 72 h 마모, 후 치유의 타임 라인을 따른다. 상해 각 막의 상피 마모 모델 상피 세포 증식, 마이그레이션 및 각 막 층의 재 epithelialization에 대 한 연구에 이상적입니다. 그러나,이 방법은 아니다 상처 치유, 동안 stromal 활성화 연구 최적의 눈 버 stromal 세포 층에 침투 하지 않습니다 때문에. 이 메서드는 또한 임상 응용, 약물 효과의 예, 전 임상 시험에 적합.

서문

수많은 기관의 상피 층 부상에 노출 됩니다. 그러나, 그들은 또한 상처 치유를 통해 조직의 손실을 보상 하는 기능을 포함. 각 막 상처 치유를 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 그것은 눈의 외부 표면에 형성 하 고 민감한 눈 기계에 대 한 보호 계층을 제공 합니다. 따라서, 각 막 병원 균과 감수를 물리적 장벽 역할을 합니다. 그것은 3 개의 층;으로 구성 상피, 기질 및 피입니다. 각 막의 상피 각 막의 가장 바깥쪽 레이어 최대 수 있습니다. 상피 세포는 단단한 접속점^1,2,3통해 서로 엄격 하 게 준수 하 여 각 막의 장벽 기능을 유지 합니다. acellular 막 지하실 막, 보 먼의 막 내 화 keratocytes를 포함 하는 광범위 한 기질에서 상피를 분리 합니다. 기질에서 내 피 세포 영양분, 물, 그리고 산소는 상위 레이어를 채널.

각 막 찰과상은 병원⁴에서 아주 일반적 이다. 각 막에 상해 다양 하지만 크게 다른 이물질, 스크래치, 또는 모래, 먼지와 같은 작은 입자에 의해 발생. 프로토콜 설명 여기 임상 관련 유형의 각 막 상피 마모를 재현 하는 겨냥 했다. 이렇게,이 프로토콜에는 임상 및 각 막 과학자 들은 자신의 연구에서 구현 하는 제어 및 정액 방법을 제공 한다. 우리 murine 각 막에 무디게 눈 버, Algerbrush II와 조직 abrading 하 여 비보에 부상 수리 분석을 수행 했습니다. 여기, 우리가 대상 중앙 각 막 상피에만 마모 손상 없이 장기의 다른 부분을 떠나. 따라서, 마이그레이션, 확산 및 감 별 법 vivo에서⁵세포 프로토콜은 다시 epithelialization 동안 연구 각 막 상피 세포 역학 또는 지하실 멤브레인에 이상적 이다. 최근,이 모델 murine 각 막에도 다시 부상^6,7후 각 막 줄기 세포 틈새에서 차별화 된 각 막 상피 세포의 용량을 공개로 조상 세포 역학 분석에 사용 되었다. 마모, 다음 각 막의 정상적인 투명성과 인장 강도를 반환합니다. 흥미롭게도, 생체 외에서 연구 표시는 다시 epithelialization 증가 세포 확산⁸없이 발생 합니다. 이 프로토콜 murine 각 막에 치료 중단의 타임 라인을 설명 합니다. 방법은 따라서 치료 패턴 및 속도에 약물의 효과 테스트에 적용 됩니다.

각 막 상처 치유 연구에 대 한 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 많은 연구는 상해의 다른 모델에 의존 했습니다. ⁹각 막 표면 필터 종이 없이 각 막 상해의 잘 설립 모델 수산화 나트륨 (NaOH)을 적용 하 여 수행 되는 알칼리 화상 이다. 알칼리 성 노출 영향을 각 막 상피, 뿐만 아니라 뿐만 아니라 결 막 및 기질^9,10크고 확산 부상에서 결과입니다. 강한 알칼리 솔루션 각 막 궤 양, opacification, 및⁹neovascularization 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 염증 세포 6 h 이내 일반적으로 기질을 침략 하 고 24 h¹¹까지 거기 남아 있다. 따라서, 알칼리 성 부상 stromal 활성화에 관련 된 연구에서 권장 방법입니다. 또 다른 유형의 화학 상해 각 막^9,10에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 적용 하 여 쏜 수 있습니다. 다른 일반적으로 사용 되 부상 모델 기질^14,15의 상단 부분에 제한 되는 기질 및 keratectomy 상처를 통해 침투 incisional 상처 포함 됩니다. 이 메서드는 또한 stromal 상처 치유에 관한 질문에 대답 하는 데 유용. 다른 부상 모형에는 그들의 자신의 장점과 단점 있다. 마모, 또는 각 막 상피의 debridement는 비보 전 각¹⁶에 무디게 scalpels 또는 블레이드를 사용 하 여 처음 개발 되었다. 이 방법은 사용 vivo에서 마우스, 쥐, 토끼^{17,18,19,20,,2122}에 나중에 되었습니다. 우리는 상피의 나머지 영향을 받지 떠나는, 상피의 선택된 된 영역만 제거 눈 버 (그림 1)를 사용 하 여. 이러한 방법으로, 그것이 정확 하 게 각 막의 다른 부분에 상피 제거 대상으로 가능 합니다. 또한, 마모 크기 fluorescein 얼룩과 평가 될 수 있다. 또한, 여기에 우리가 치료 기간 동안 마모 폐쇄를 따르십시오.

이 메서드는 몇 가지 장점이 포즈, i)를 포함 하 여 화학 부상으로 불가능 하다, 마모 사이트의 정확한 위치 ii) 마모 수행, 빠른 이며 iii) 그것은 비 침략 적. 그러나 여기, 우리는이 마우스 유전자 모델의 광대 한 배열 뿐만 아니라 쥐와 토끼, 인간의 각 막 장애를 연구 하는 데 사용 하는 일반적인 모델에 적용 될 수 있었다 모델로, outbred NMRI 마우스를 사용 하 여 메서드를 설명 합니다.

프로토콜

모든 실험 국가 동물 실험 보드에 의해 승인 됩니다.

1입니다. 준비

1. 모든 솔루션을 준비 하 고 실내 온도에서 달리 명시 하지 않는 한 계속. Dispose 사용 재료 및 솔루션 폐기물 처리 규정을 따릅니다.
2. 사용 NMRI와 ICR outbred 주식, 4-12 주 세 중 성별 사이의. C57BL/6 긴장을 사용 하 여 단계 1.3.2에서에서 케 타 민-medetomidine 준비 방법을 따르십시오. 다른 단계에 대 한 1.3.3.-1.3.5에 설명 된 지침을 따릅니다.
3. 신선 하 고 작업을 시작 하기 전에 시간에 수의학을 준비 합니다. Carprofen 나중에 사용 될 것입니다, 그리고 따라서 그것은 시점에서 그것을 준비 하는 데 필요한.
   1. 혼합 0.375 mL 마 취에 대 한 마 취 제-medetomidine의 솔루션을 준비, (재고 농도 50 mg/mL) 0.25 mL와 케 타 민 (Ketaminol 수 의사)의 (농도 재고 1 mg/mL) medetomidine (Cepetor 수 의사)의 살 균 0.9%의 1.25 mL을 추가 하 고 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (7.5 mg/kg, 케 타 민 1 mg/kg, medetomidine)의 관리.
   2. 0.375 mL를 혼합 C57BL/6 마우스에 마 취에 대 한 마 취 제-medetomidine의 더 묽 게 한 해결책을 준비, (농도 재고 50 mg/mL)의 0.25 mL와 케 타 민 (농도 재고 1 mg/mL) medetomidine의 살 균 0.9%의 2.5 mL을 추가 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (3.75 mg/kg, 마 취 제 및 0.5 mg/kg, medetomidine)의 관리.
      참고: 이것은 성인 C57BL/6 쥐에 대해서만 대체 단계입니다.
   3. 진통에 대 한 buprenorfin을 준비 하려면 추가 0.1 mL (재고 농도 0.3 mg/mL) 살 균 0.9%의 1.9 ml buprenorfin의 NaCl. 0.2 mL/20 g 마우스 무게 (0.15 mg/kg)를 관리 합니다.
   4. 마 취를 중단에 대 한 atipamezole를 준비 하려면 0.1 mL을 추가 (농도 재고 5 mg/mL) atipamezole 4.9 ml의 0.9%의 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (0.75 mg/kg)를 관리 합니다.
   5. 후 마 취 동안 진통 carprofen을 사용 합니다. 0.1 mL를 추가 (재고 농도 50 mg/mL) carprofen 4.9 ml의 0.9%의 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (7.5 mg/kg)의 관리.
4. 형광 성 얼룩 솔루션 준비
   1. 코발트 블루 빛 (그림 1) 아래 마모를 시각화에 대 한 형광 솔루션을 사용 합니다. 벌금 규모와 fluorescein 소금의 첫 번째 측정 10 밀리 그램으로 0.1 %fluorescein 솔루션을 준비 하 고 인산 염 버퍼 염 (PBS) 10 mL를 추가.
   2. 빛에서 fluorescein 솔루션을 보호 하 고 통에 5 분 동안 흔들어.
      참고: fluorescein 솔루션은 빛에 민감한; 빛에서 포함 하는 솔루션을 유지. 이 솔루션은 2-3 일 동안 + 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 사용을 위해 안 약에 사용 되는 스 포 이트 병 fluorescein 솔루션 에서도 도움이 됩니다. 살 균 필터를 사용 하 여 솔루션 스포이드 병에 이동할 때.
5. 사용; 전후 눈 버 팁 청소 먼저 PBS 그리고 70 %EtOH. 동일한 작업 중 여러 마우스 한 마모를 만드는 경우 각 마우스 사이 청소 단계를 수행.
6. (+37 ° C)에 온수 접시를 놓고 그것에 종이 타월 장소.

2. 각 막 마포

주의: 사용 보호 의류 (장갑, 랩 코트) 때 쥐를 처리. 체중 관리 하는 약물의 양을 견적 하는 마우스.

1. 한 손으로 scruffing 메서드를 사용 하 여 마우스²³처리 하. 케 타 민-medetomidine 혼합물을 intraperitoneally 관리 (i.p.) 왼쪽 낮은 복 부. 마우스를 개별 케이지를 놓고 잠들 때까지 기다립니다. 이 일반적으로 5 분 미만 걸립니다. 그런 다음, 첫 번째 buprenorfin 그리고 atipamezole i.p. 주사를 통해 관리 합니다. 동일한 처리 기술을 사용 합니다.
   참고: 일단 마 취를 부여 프로토콜 해야 하지 일시 정지 됩니다 언제 든 지.
2. 계속 하기 전에 온수 접시 따뜻한 인지 확인 합니다. 온수에 마 취 마우스를 놓습니다. 마 취의 레벨은 꼬리 반사 이다 결 석, 하지만 발가락 반사는 존재 하는 경우에 좋다. 꼬리와 손가락 또는 집게와 모든 발가락을 곤란 하 게 하 여 이러한 반사를 확인 합니다. 과도 한 무력을 사용 하지 마십시오. 마 취는 지난 20-25 분을 것입니다.
3. 한 마모 청소 눈 버를 사용 합니다. 회전 하는 마모를 확인 하는 것이 필수적입니다 진동 설정에 버의 베이스. 버 제대로 작동 하는 때, 손에 진동 느낌.
   1. 별도로 손가락으로 눈 꺼 풀을 눌러 한 번에 한쪽 눈을 엽니다. 단단히 각 막에 버 터치 그리고 눈 표면에 악기 뿐만 아니라 뒤로 및 앞으로 옆으로 이동 합니다. 버 진동 수행 처음; 누르면, 동요 하거나 마십시오 눈물 각 막. 중앙 각 막에서 표면에 움직임 abrading 20는 상처를 유발 하기에 충분. 에 버를 들어올린 침식 될 각 막의 영역에 체류 하려고 하지 마십시오. 표준 크기의 마모를 취득 실천의 여러 라운드를 요구할 것 이다.
   
   참고: 각 막 무 균 상태 얻을 수 있습니다 전에 마모 betadine 안과 솔루션을 사용 하 여.

3. 이미지는 마모

1. 코발트 블루 펜 빛 (그림 1)과 fluorescein 솔루션을 사용 하 여 침식된 영역을 밝게. 안구 표면 주변광에 무색 나타납니다. Fluorescein 신청 후 침식된 지역 fluoresces 녹색에서 빛 펜으로 눈을 조명 하는 때.
   1. 필요한 경우, 2.3에서 마찬가지로 침식된 눈 열고 fluorescein 솔루션의 한 방울 스포이드 병에서 관리 합니다. PBS와 0.9%에 한 번 눈을 씻고 NaCl을 줄이기 위해는 fluorescein의 배경. 점 적기 병 또는 한 피 펫을 사용 하 여 세탁. 소프트 삭제 기능으로 멀리 액체를 발음 하 고 필요한 경우는 속눈썹을 청소. 과잉 액체는 일반적으로 눈물 운하의 개통에 가까운 눈, 비 강 국경에 수집합니다.
      주의: 약간의 찰과상이 유도 될 수 있습니다으로 cleaining 동안 각 막을 만지지 마십시오.
2. 각 막 찰과상의 사진을 찍을.
   1. 각 이미지 세션 동안 비슷한 이미지를 얻으려면 코발트 블루 펜 빛과 SLR 카메라 (그림 2)에 대 한 꾸준한 첨부 파일 도구를 사용 합니다. 이 프로토콜은 (그림 2)를 반복 하기 쉬운 설치를 제공 합니다.
      1. 펜 라이트와 카메라 연결할 테이블 램프 유연한 팔과 클램프 및 조정 가능한 카메라 팔은 클램프와 함께 각각 사용 합니다. 케이블 넥타이 펜 마우스 눈 바로 위에 위치 하 고 테이블 램프에 빛. 빛을 다르게 위치는 마포의 시각화를 변경 될 수 있습니다. 이러한 도구를 위치에 대 한 제안 그림 2에 설명 되어 있습니다.
   2. SLR 카메라를 사용 하 여 눈의 사진을 찍을. 방 조명에 원하는 거리와 위치와 초점 카메라 (1:12)에 동물을 놓습니다. 그 후, 코발트 블루 펜 라이트를 제외 하 고 다른 모든 빛을 닫습니다.
      참고: 아래 펜 라이트 핸들을 테이프 또는 이미징 동안 모든 시간에 빛을 유지 하는 고무 밴드를 사용. 이 이미지가 흐릿한 경우 도움이 될. 동료와 함께 이미징 단계를 수행 하는 것이 쉽습니다.

4. 각 막 마포 후 깨어난

1. 첫 번째 buprenorfin 그리고 atipamezole i.p. 주사를 통해 관리 합니다. 2.1에서 동일한 처리 기술을 사용 합니다.
2. 항균, fucidin 산 눈 연 고 (Isathal) 수 분 마 취 후 눈 표면 박테리아에서 청결 한 유지 하 침식 및 침식 비 눈 방울을 놓습니다.
3. 마우스는 온수에 5 ~ 20 분에 일어나 것 이다, 마 취 후 웨이크 업 기간 동안 마우스를 관찰 합니다. 때 모바일, 개별 감 금 소에.
   참고: 깨어 오래 걸리면, 온수 패드 장에 마우스를 배치 또는 전체 케이지 온수 접시에 놓고 마우스를 정기적으로 모니터링 합니다. 마 취 기운이 떨어지기, 마우스 일반적으로 착취 하 고 앞쪽 시체와 함께 위쪽으로 도달. 이 문제는 3-4 시간에 정상으로 반환 해야 하 고 공유 감 금 소에 다시 마우스를 배치할 수 있습니다.
4. 2.2 단계에서 마찬가지로 마모 후 이틀 연속에 carprofen i.p. 진통와 눈 연 고에 대 한 관리. 그리고 4.2입니다.

5. 상처 치유 하는 동안 이미징

1. 이 프로토콜에서 사용 시간 상처 폐쇄를 관찰 하는 마모 후 18 h 및 72 h 포인트.
   1. 연속 영상에 대 한 2.2에 설명 된 대로 쥐를 anesthetize.
   2. 3에 설명 된 대로 사진을 찍을.
   3. Atipamezole i.p.와 동물 그리고 4.3에 설명 된 대로 시동 기간을 모니터링.
      참고: 그렇지 않으면 계속 속 행, 5.1.2 후 바로 마우스를 안락사. 안락사는 6.1에 설명 되어 있습니다.

6. 각 막 컬렉션 및 파라핀 포함

1. 마지막 시간 이후에, 동물을 희생. CO₂로 채울 수 있는 챔버에 마우스를 놓습니다. CO 챔버 공기를 채워_2. 동물 모바일 이면 꼬리의 기지에서 단단히 당기 및 동시에 누르고 목 지역 경관 척추를 탈 구.
   주의: 항상 로컬 동물 복지 본문의 지침을 따르십시오.
2. 눈의 해 부가 위 피부에 개방을 절단 하 여 안구 전체를 수집 합니다. 안구에서가 위를 배치 하 고 궤도에서 안구 팝업 눈 신경 절단. 집게를 사용 하 여 눈 오지 않는 경우 밖으로 쉽게.
   1. 눈 안에 솔루션의 무료 침투 수 있도록 26 G 바늘, 망막에 눈의 뒷면에 구멍을 확인 합니다.
      참고: 눈 건조, 대신, PBS에 장소는 프로토콜 계속까지 못하게 합니다.
3. PBS 2 mL 튜브에 눈알을 수집 합니다. 실험을 일시이 시점에서 하지 않습니다.
4. PBS를 제거 하 고 4-5 시간 + 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 눈알을 수정.
5. 고정된 안구 조직 카세트 조직 처리에 대 한 이동 합니다. 조직 처리 기계 및 다음 프로그램을 사용:
   1. PBS와 린스.
   2. 실 온에서 70% 에탄올에 2 x 45 분을 품 어.
   3. 실 온에서 94% 에탄올에 2 x 1 h를 품 어.
   4. 실 온에서 절대 에타 놀에서 3 x 45 분을 품 어.
   5. 크 실 렌, 실내 온도 37 ° c.에 마지막 자일 렌에서 3 x 1 h을 품 어
   6. 파라핀 왁 스 60 ° c.에 있는 3 x 1 h을 품 어
6. 조직 처리, 후 박을 안구 조직 포함 블록을 사용 하 여 액체 파라핀 (+ 60 ° C). 그것은 옆으로 보고와 주변 테두리를 위쪽으로 향하게 되도록 블록 내 눈을 놓습니다. 5-10 분 동안 차가운 접시에 응고 블록을 보자.

7. 각 막의 파라핀 섹션

1. 기관의 또는 제조업체의 지침에 따라 단면에 대 한 톰을 준비 합니다.
   주의: 날카로운 톰 블레이드를 처리할 때는 주의 해야 합니다.
2. 실내 온도 톰 옆에 초순 장소 한 물 탕 다른 초순 + 50 ° c 온수
3. 안구의 5 µ m 두꺼운 섹션을 확인 합니다.
   참고: 렌즈 쉽게 구분 하는 동안 휴식. 이 방지 하려면 절단 표면을 각 시간 섹션의 새로운 행이 시작 촉촉한 티슈로 닦아냅니다. 수돗물을 사용 하 여 조직 축.
4. 실내 온도 물 목욕에 서로 옆에 섹션을 놓고 뜨거운 물 목욕 유리 슬라이드의 도움으로 이동 합니다. 모든 주름이 이완 될 때까지 뜨거운 물 목욕 및 섹션 될 매트에 섹션을 스트레칭.
5. +37 ° C에 하룻밤 단면도 유리 슬라이드를 건조
6. 슬라이드 + 60 ° C에 온수 접시에 1 분간 유지 하 여 슬라이드에 연결할 섹션 이 후, 섹션 수 수 직접 얼룩, immunohistological 방법에 대 한 처리 또는 + 4 ° C에 저장

결과

이 프로토콜 마우스 각 막에 마포 상해를 입힐 수 있는 모델을 설명 하 고 따라 하 고 마모 후 치유 과정을 시각화 방법을 제시. 최근에, 우리는 상처 치유⁶동안 각 막 상피 조상 세포의 역할을 연구 하기 위해이 메서드를 고용. 설정된 도구를 사용 하 여 성공적인 마모 실험에 열쇠 이다. 우리는, 그리고 다른 찰과상^6,,

토론

부상 메서드는 각 막 항상성 및 병 리의 다양 한 측면을 공부 인기 있는 도구입니다. 마모 모델 안과에 관련 문제를 해결 하기 위해 잘 제어 방법을 제공 합니다. 그러나, 특정 중요 한 포인트는 프로토콜에서 강조 가치가 있다. 특히, 수의학, 상처 치유 타임 라인, 그리고 결과 관한 설명 내용을 outbred NMRI와 ICR 주식와 함께 사용 하기 위해 최적화 된 하지만 쥐²⁶의 변종 마다 다를 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA