Роговицы эпителиальных истиранию с глазной заусенцев, как модель для роговицы заживление ран

Резюме

Этот протокол описывает метод нанести истирания поверхности глаза мыши и следовать за процесс заживления ран после этого. Протокол использует глазной Берр частично удалить поверхности эпителия глаза анестезированные мышей.

Аннотация

Мышиных роговицы обеспечивает отличную модель для изучения заживление ран. Роговицы верхний слой глаза и таким образом первой обороны, травмы. В самом деле наиболее распространенный тип травмы глаз, в клинике является роговицы ссадины. Здесь мы используем глазной Берр побудить износа, что приводит к удалению эпителия роговицы в естественных условиях на наркотизированных мышей. Этот метод позволяет для целевых и воспроизводимые эпителиальных потрясений, оставляя нетронутыми других областях. Кроме того мы описывают визуализации прошлифовать эпителия с окрашивание флюоресцеином и представить конкретные рекомендации о том, как визуализировать прошлифовать роговицы. Затем мы следуем сроки заживления 0, 18 и 72 ч после истирания, пока рана является повторное грануломах. Эпителиальный истиранию модель повреждение роговицы идеально подходит для исследования пролиферации эпителиальных клеток, миграции и эпителизация слоев роговицы. Однако этот метод не является оптимальным для изучения стромальные активации во время заживления ран, потому что глазной заусенцев не проникают в слои стромальных клеток. Этот метод также подходит для клинического применения, например, Доклинические испытания эффективности препарата.

Введение

Эпителиального слоя многочисленных органов подвержены травм. Однако они также содержат способность компенсировать потери ткани через заживление ран. Роговицы предлагает отличную модель для изучения заживление ран. Он образует внешней поверхности глаза и обеспечивает защитный слой для чувствительных глазной техники. Таким образом роговица функционирует как физический барьер патогенов и потери воды. Он состоит из трех слоев; эпителий, строма и эндотелия. Эпителий роговицы делает верхний слой роговицы. Эпителиальные клетки поддерживают функцию барьера роговицы, строго придерживаясь друг друга через плотные соединения^1,2,3. Бесклеточной роговицы в базальной мембраны, Боумена, отделяет эпителия от обширной стромы, которая содержит тугоплавкие кератиноцитах. В строме эндотелиальные клетки канал питательных веществ, воды и кислорода в верхний слой.

Роговицы ссадины являются очень распространенными в клинике⁴. Травмы роговицы разнообразны, но во многом вызваны мелких частиц, таких как пыль или песок, царапин или других посторонних предметов. Протокол описано здесь направлена на воспроизведение клинически значимых тип эпителия роговицы ссадины. Поступая таким образом, этот протокол обеспечивает контролируемый и семенных метод для клиницистов и роговицы ученых для реализации своих собственных исследований. Мы выступали в vivo пробирного ремонт повреждений на мышиных роговицы абразивной ткани с притупилась глазной Берр, Algerbrush II. Здесь, мы нацелены на истирание только к центральной эпителия роговицы и оставить другие части органа без повреждений. Таким образом протокол является идеальным для изучения динамики роговицы эпителиальных клеток или базальной мембраны во время эпителизация, ячейка миграции, пролиферации и дифференцировки в vivo⁵. Недавно эта модель была использована для анализа прогениторных клеток динамика в мышиных роговицы, а также раскрыть потенциал дифференцированной роговицы эпителиальных клеток в восстановлении ниши стволовых клеток роговицы после травмы^6,7. После истирания роговицы возвращается в его нормальное прозрачности и прочности. Интересно, что в vitro исследование показало, что эпителизация происходит без увеличения клеток распространения⁸. Этот протокол описывает шкале времени непрерывного исцеления в мышиных роговицы. Таким образом, метод применим проверить влияние наркотиков на исцеление шаблоны и скорость.

Роговицы был широко используется для заживления ран исследований. Однако многие исследования опирались на других моделях травмы. Устоявшиеся модели повреждение роговицы является щелочной ожога, который производится путем применения гидроокиси натрия (NaOH) с или без фильтровальной бумаги на поверхности роговицы⁹. Щелочные воздействия результатов в больших и рассеянных травмы, которая затрагивает не только эпителия роговицы, но и конъюнктивы и стромы^9,10. Было показано, что сильное щелочных растворов вызывают язвы роговицы, помутнение и неоваскуляризации⁹. Воспалительные клетки вторгнуться стромы обычно в течение 6 ч и остаются там до 24 h¹¹. Таким образом щелочные травмы является целесообразным методом в исследованиях, связанных с стромальные активации. Другой тип химической травмы может быть нанесен, применяя диметилсульфоксида (ДМСО) на роговице^9,10. Другие часто используемые травмы модели включают инцизионная раны, которые проникают через стромы и кератэктомия раны, которые ограничены к верхней части стромы^14,15. Эти методы полезны также ответить на вопросы относительно стромальных заживление ран. Различные травмы модели имеют свои преимущества и недостатки. Ссадина или хирургическая, эпителия роговицы был впервые разработан с использованием притупилась скальпели или лопастей ex vivo роговицы¹⁶. Этот метод был позднее используется в естественных условиях на мыши, крысы и кролик^{17,18,19,20,21,22}. Используя глазной Бёрр (рис. 1), мы удаляем только выбранной области эпителия, затрагивая остальной эпителия. Таким образом, это возможно для более точного эпителиальных удаления в различные части роговицы. Кроме того можно оценить размер износа с окрашивание флюоресцеином. Кроме того здесь мы следуем истиранию закрытия во время периода заживления.

Этот метод создает ряд преимуществ, i) включая точное местоположение сайта истиранию, который не возможен с химической травмы, ii истирания быстро выполнять, и iii) это неинвазивные. Здесь мы описываем метод, с помощью беспородных ВММНИИ мыши как модель, однако это может применяться широкий спектр генетической модели мыши, а также крыс и кроликов, которые являются общей модели, используемые для изучения антропогенного роговицы.

протокол

Все эксперименты утверждаются Советом Национального животных эксперимент.

1. Подготовка

1. Подготовить все решения и держать при комнатной температуре, если не указано иное. Соблюдайте правила утилизации отходов dispose используемых материалов и решений.
2. Использование ВММНИИ и МГП Беспородные запасов, в возрасте 4-12 недель и обоих полов. При использовании штамм C57BL/6, выполните метод подготовки кетамин medetomidine на шаге 1.3.2. Для других шагов следуйте инструкциям, описанным в 1.3.3.-1.3.5.
3. Подготовьте ветеринарной медицины, свежими и в время перед началом операции. Carprofen будет использоваться позднее, таким образом нет необходимости на данном этапе его подготовки.
   1. Подготовить раствор кетамин medetomidine для анестезии, микс 0,375 мл (фондовый концентрации 50 мг/мл) кетамина (Ketaminol Vet) с 0,25 мл (stock концентрации 1 мг/мл) из medetomidine (Cepetor Vet) и добавить 1,25 мл стерильного 0,9% NaCl. Администрировать 0,15 мл/20 g вес мыши (7,5 мг/кг, кетамином и 1 мг/кг, medetomidine).
   2. Подготовить более разбавленного раствора кетамина medetomidine для анестезии на мышей C57BL/6, микс 0,375 мл (stock концентрации 50 мг/мл) кетамина с 0,25 мл (stock концентрации 1 мг/мл) из medetomidine и добавить 2,5 мл стерильного 0,9% NaCl. Администрировать 0,15 мл/20 g вес мыши (3,75 мг/кг, кетамином и 0,5 мг/кг, medetomidine).
      Примечание: Это альтернативный шаг, только для взрослых мышей C57BL/6.
   3. Для подготовки buprenorfin анальгезию, добавить 0,1 мл (stock концентрации 0,3 мг/мл) от buprenorfin до 1,9 мл стерильного 0,9% NaCl. Управление мышью вес 0,2 мл/20 g (0,15 мг/кг).
   4. Подготовить Атипамезола для прекращения анестезии, добавить 0,1 мл (фондовый концентрацией 5 мг/мл) из Атипамезола до 4,9 мл 0,9% NaCl. Администрировать 0,15 мл/20 g вес мыши (0,75 мг/кг).
   5. Для обезболивания во время после анестезии используют carprofen. Добавить 0,1 мл (stock концентрации 50 мг/мл) от carprofen до 4,9 мл 0,9% NaCl. Администрировать 0,15 мл/20 g вес мыши (7,5 мг/кг).
4. Приготовления флуоресцентных окрашивание раствора
   1. Для визуализации истирания под Кобальт синий свет (рис. 1), используйте флуоресцентный решение. Приготовляют раствор 0,1% флуоресцеин первого измерения 10 мг флуоресцеин соли с тонкой масштаба и затем добавить его в 10 мл в фосфат буфер солевой раствор (PBS).
   2. Защищать от света флуоресцеин решение и трясти за 5 минут на шейкер.
      Примечание: Решение флуоресцеин светочувствительные; Держите решение охватывает от света. Это решение может храниться в + 4 ° C на 2-3 дней. Для использования это полезно на место флуоресцеин решение в капельницы, который используется для глазных капель. Используйте стерильные фильтр-при перемещении решение для капельницы.
5. Прочистите наконечник глазной Берр, до и после использования; сначала с PBS и затем с 70% EtOH. Если сделать несколько мышей истирания в ходе той же операции, сделайте очистки шагов между каждой мыши.
6. Наденьте пластину с подогревом (+ 37 ° C) и место бумажным полотенцем на нем.

2. роговицы ссадины

Предупреждение: Используйте защитная одежда (перчатки, лабораторный халат) при обработке мышей. Вес мыши, чтобы оценить объем лекарств для администрирования.

1. Используйте метод Одноручные scruffing справляться с мыши²³. Администрировать кетамин medetomidine смесь внутрибрюшинно (и.п.) в левой нижней части живота. Поместите курсор мыши на отдельные клетки и ждать его заснуть. Обычно это занимает менее 5 минут. Затем Администрирование, первый buprenorfin, а затем Атипамезола инъекционным и.п. Используйте тот же метод обработки.
   Примечание: После анестезии, протокол должен не быть приостановлена в любой момент.
2. Прежде чем продолжить, проверьте, что пластину с подогревом теплой. Место наркотизированных мыши на пластину с подогревом. Уровень анестезии это хорошо, если хвост рефлекс отсутствует, но присутствует мыс рефлекс. Проверьте эти рефлексы, щипать хвост и любой палец с пальцами или щипцами. Не прилагайте излишних усилий. Анестезия будет последние 20-25 минут.
3. Чтобы сделать истиранию, используйте уборка глазной заусенцев. Поверните основание Берр включите вибрации, что необходимо сделать к истиранию. Почувствовать вибрации в руке, когда зауец функционирует правильно.
   1. Откройте один глаз одновременно держа веки отдельно с пальцами. Затем прочно сенсорных Берр роговицы и двигаться взад и вперед а инструмент как боком на поверхности глаза. Вибрации зауец будет выполнять нуля; не нажимайте, встряхнуть или разрыв роговицы. В центре роговицы 20, абразивные движения на поверхности достаточно, чтобы вызвать раны. Не поднять заусенцев и попытаться остаться в регионе роговицы быть скрепляемые. Несколько раундов практике потребует приобретения стандартного размера истиранию.
   
   Примечание: Роговицы Асептика может быть достиган до истиранию используя Бетадин офтальмологический раствор.

3. изображений к истиранию

1. Осветить прошлифовать региона с помощью Кобальт синий перо света (рис. 1) и решение флюоресцеином. Глазной поверхности появляется бесцветный в освещенности. После применения флуоресцеин прошлифовать региона флуоресцирует зеленым, когда светящиеся глаза с перо света.
   1. При необходимости, откройте прошлифовать глаз точно так же как и 2.3 и администрировать одну каплю раствора флуоресцеин от капельницы. Мыть глаз один раз с PBS или 0,9% NaCl для уменьшения фона флюоресцеином. Для мытья используйте капельницы или пипетки. Аспирационная жидкости мягкой салфеткой и Почистите ресницы, при необходимости. Избыток жидкости обычно собирает носовой границы глаза, недалеко от открытия канала слезоточивый.
      Предостережение: Не прикасайтесь роговицы при энзимный, как незначительные ссадины могут быть наведено.
2. Возьмите фотографии роговицы ссадины.
   1. Для получения похожих изображений в ходе каждой сессии изображений, используйте инструменты устойчивый вложение Кобальт синий свет перо и Зеркальные камеры (рис. 2). Этот протокол обеспечивает установку, который легко повторить (рис. 2).
      1. Чтобы прикрепить света пера и камеры, используйте настольную лампу с гибкие руки и зажим и регулируемый камеры руку с зажимом, соответственно. Кабель галстук перо света лампа и позицию чуть выше глаз мыши. Позиционирование свет по-разному может изменить визуализацию истиранию. Предложение для позиционирования этих инструментов описана на рисунке 2.
   2. Используйте SLR камеру для фотографирования глаза. Поместите животное в нужном расстоянии и позиции и фокус камеры (1:12) в свете комната. После этого закройте все другие огни, за исключением Кобальт синий свет перо.
      Примечание: Ленты перо света ручку вниз или использовать резинкой, чтобы держать свет на все время во время визуализации. Это может помочь, если изображение становится размытым. Это простой для выполнения визуализации шаг с коллегой.

4. проснувшись после роговицы ссадины

1. Администрирование, первый buprenorfin, а затем Атипамезола инъекционным и.п. Используйте тот же метод обработки как 2.1.
2. Поместите каплю антибактериальные, fucidin кислоты глазную мазь (Isathal) и прошлифовать-скрепляемые глаза увлажняют и держать глазной поверхности очистить от бактерий после анестезии.
3. Как мыши будут просыпаться в 5-20 минут на пластину с подогревом, наблюдать мыши в период пробуждения после анестезии. Когда она становится мобильным, поместите его в индивидуальной клетке.
   Примечание: Если просыпаться занимает больше времени, поместите указатель мыши в клетке с подогревом pad или разместить всю клетку на пластину с подогревом и регулярно контролировать мышь. В то время как анестезия носит off, мыши обычно качает и достигает вверх с передней телом. Это поведение должно вернуться к нормальной жизни в 3-4 часа и затем поместите курсор мыши обратно в общий каркас.
4. Администрирование carprofen и.п. для обезболивания и глаз мазь на два дня подряд после истирания, подобно как шаги 2.2. и 4.2.

5. изображения во время заживления ран

1. В этом протоколе использовать время очка 18 h и 72 ч после истирания наблюдать закрытие раны.
   1. Для последовательных изображений, анестезировать мышей, как описано в 2.2.
   2. Сфотографируйте, как описано в 3.
   3. Wake up животных с Атипамезола и.п. и следить за период пробуждения, как описано в разделе 4.3.
      Примечание: если не продолжения последующей деятельности, усыпить мыши сразу после 5.1.2. Эвтаназия описан в 6.1.

6. роговица коллекции и встраивание парафина

1. После точки последнего времени приносят в жертву животное. Поместите курсор мыши в камере, которые могут быть заполнены с CO₂. Заполнить воздуха камеры с CO_2. Когда животное неподвижной, вывихнуть шейных позвонков, твердо потянув от основания хвоста и нажав области шеи вниз в то же время.
   Предупреждение: Всегда следуйте рекомендациям органа местных животных.
2. Собирайте весь глазного яблока, резка проема в коже в сторону глаза Рассечение ножницами. Поместите ножницы под глазного яблока и вырезать глазной нерв поп глазного яблока из орбиты. Используйте щипцы, если глаз легко не вышли.
   1. Сделайте отверстие на задней части глаза, на стороне сетчатки, с иглой 26G разрешить свободный проникновения решений внутри глаза.
      Примечание: Не позволяйте глаза становятся сухими, вместо этого, поместите его в PBS до продолжения с протоколом.
3. Соберите глазного яблока в 2-мл пробирку с PBS. На данный момент не прерывалось эксперимент.
4. Удаление PBS и исправить глазного яблока в параформальдегида 4% (PFA) в + 4 ° C для 4-5 часов.
5. Переместите фиксированный глазного яблока в ткани кассету для обработки тканей. Используйте ткани, обработка машины и следующую программу:
   1. Промойте с PBS.
   2. Проинкубируйте 2 x 45 минут в 70% этанола при комнатной температуре.
   3. Проинкубируйте 2 x 1 h в 94% этанола при комнатной температуре.
   4. Инкубируйте 3 x 45 минут в абсолютного этанола при комнатной температуре.
   5. Инкубируйте 3 x 1 h в ксилоле, при комнатной температуре и последний ксилола при 37 ° C.
   6. Инкубируйте 3 x 1 h в парафин при температуре 60 ° C.
6. После обработки ткани встройте в парафин жидкий (+ 60 ° C), используя блок внедрения тканей глазного яблока. Место глаз внутри блока, так что он смотрит в сторону и периферийных пограничных вверх. Пусть блок затвердеть на прохладный пластину для 5-10 минут.

7. парафиновых срезах роговицы

1. Подготовьте микротом для разрезания согласно инструкциям учреждения или производителя.
   Предупреждение: Будьте внимательны при обработке лезвия острыми микротома.
2. Место один водяной бане с сверхчистого водой комнатной температуры около микротома и другой с ультрачистая вода нагревается до + 50 ° C.
3. Сделайте 5 мкм толщиной секций глазного яблока.
   Примечание: Объектив легко перерывы при резании. Чтобы избежать этого, протирают режущие поверхности влажной салфеткой, каждый раз, когда запускается новый ряд разделов. Использование водопроводной воды для увлажнения ткани.
4. Место разделы рядом друг с другом в ванну водой комнатной температуры, а затем переместите их в ванну с горячей водой с помощью на стеклянное скольжение. Растяните разделы в ванну с горячей водой до тех пор, пока все морщин расслабиться и секции становится матовой.
5. Сухие стекла слайды с разделами на ночь в котором + 37 ° C.
6. Прикрепить разделы к слайдам, сохраняя слайд за 1 минуту на подогревом тарелку в + 60 ° C. После этого секции может быть непосредственно обработаны для окрашивания, иммуногистохимического методы или хранящиеся в + 4 ° C.

Результаты

Этот протокол описывает модель причинять ущерб истиранию к мыши роговицы и предлагает как следовать и визуализировать процесс заживления после истирания. Недавно мы использовали этот метод для изучения роли эпителия роговицы прогениторных клеток во время заживлени...

Обсуждение

Ранение методы являются популярные инструменты для изучения различных аспектов роговицы гомеостаза и патологий. Истиранию модель предлагает хорошо контролируемых метод для решения соответствующих проблем в офтальмологии. Однако некоторые критические точки в протоколе, следует под?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA