Kornea epitel aşınma oküler Burr ile bir Model olarak kornea için yara iyileşme

Özet

Bu iletişim kuralı oküler yüzey için bir aşınma fare indirebilmek için ve yara iyileşme süreci bundan sonra izlenecek yöntemi açıklanır. Protokol kısmen göz yüzey epitel anaesthetized farelerde kaldırmak için oküler bir burr yararlanır.

Özet

Fare kornea yara iyileşmesi eğitim için mükemmel bir model sağlar. Kornea gözün en dış tabakası ve böylece ilk savunma sakatlığı. Aslında, klinikte buldum göz yaralanma en yaygın türü bir kornea aşınma var. Burada, biz bir oküler burr imzalat fareler üzerinde kornea epitel vivo kaldırılması sonuçlanan bir aşınma ikna etmek için kullanmaktadır. Bu yöntem diğer alanlarda dokunmadan hedeflenen ve tekrarlanabilir epitel bozulma için izin verir. Buna ek olarak, floresein boyama ile aşınır epitel görselleştirme açıklar ve nasıl aşınır kornea görselleştirmek için somut tavsiyeler sağlar. Sonra yara yara yeniden epithelialized kadar aşınma sonra 0, 18 ve 72 h şifa kronolojisi izleyin. Kornea yaralanma epitel aşınma modeli epitel hücre çoğalması, geçiş ve kornea katmanların yeniden epithelialization çalışmalar için idealdir. Oküler burr stromal hücre katmanlarına nüfuz etmez çünkü ancak, bu yöntem stromal etkinleştirme sırasında yara iyileşmesi, eğitim için en uygun değildir. Bu yöntem ayrıca örneğin, önceden klinik test ilaç etkinliğinin klinik uygulamalar için uygundur.

Giriş

Çok sayıda organları epitel tabakalarının yaralanmalara maruz kalır. Ancak, onlar da yara iyileşmesi ile doku kaybı telafi etmek için yeteneğini içerir. Kornea yara iyileşmesi eğitim için mükemmel bir model sunuyor. Gözün dış yüzey oluşturur ve hassas oküler makine için bir koruyucu tabaka sağlar. Böylece, kornea patojenler ve su kaybı için fiziksel bir bariyer görevi görür. Üç katmandan oluşur; epitel, stroma ve endotel. Kornea epitel kornea dıştaki katman yapar. Epitel hücreleri kesinlikle birbirine sıkı kavşak^1,2,3ile bağlı kalarak tarafından kornea bariyer fonksiyonunu korumak. Bir acellular kornea membran, Bowman'ın membran, ateşe dayanıklı keratocytes içeren kapsamlı stroma epitel ayırır. Stroma altında besin, su ve oksijen üst katmana endotel hücreleri kanal.

Kornea aşınmalar klinik⁴' te çok yaygındır. Kornea yaralanmaları çeşitlidir, ama büyük ölçüde toz veya kum, çizilme veya diğer yabancı nesneler gibi küçük parçacıklar tarafından kaynaklanır. Protokol tanımlamak burada kornea epitel aşınma klinik bir tür üreyen amaçlamaktadır. Bunu yaparken, bu iletişim kuralı klinisyenler ve kornea bilim adamları kendi çalışmaları uygulamak için bir kontrol edilebilir ve seminal yöntemi sağlar. Biz fare kornea üzerinde doku dulled oküler burr, Algerbrush II ile aşındırma tarafından bir vivo içinde hasar onarım tahlil gerçekleştirdiniz. Burada, biz sadece merkezi kornea epitel için aşınma hedef ve organ zarar vermeden diğer bölgelerinde bırakın. Böylece, iletişim kuralını yeniden epithelialization sırasında çalışma kornea epitel hücre dinamiği veya membran için idealdir geçiş, yayılmasını önleme ve farklılaşma vivo içinde⁵hücre. Son zamanlarda, bu model fare kornea de kapasite kornea kök hücre niş yaralanma^6,7' den sonra yeniden kurulmasında farklılaştırılmış kornea epitel hücresi açıklayacak olarak progenitör hücre dinamiklerini analiz etmek için kullanıldı. Aşınma, korneanın normal şeffaflık ve çekme dayanımı için döndürür. İlginçtir, bir vitro çalışma artan hücre proliferasyonu⁸yeniden o epithelialization oluşur göstermiştir. Bu iletişim kuralı kesintisiz fare kornea iyileşme zaman çizelgesi açıklar. Yöntem böylece şifa desenleri ve hız üzerindeki etkisi ilaç test etmek için geçerlidir.

Kornea kapsamlı çalışmalar şifa yara için kullanılmıştır. Ancak, birçok çalışma yaralanma diğer modellerde yararlanmıştır. Bir iyi kurulmuş kornea yaralanma sodyum hidroksit (NaOH) uygulayarak gerçekleştirilir alkalin yanık veya filtre kağıdı kornea yüzey⁹olmadan modeldir. Alkali pozlama sadece kornea epitel, aynı zamanda konjonktiva ve stroma^9,10etkiler büyük ve diffüz yaralanma içinde sonuçlanır. Güçlü alkalin çözümleri kornea ülseri, opaklaşmasına ve neovaskülarizasyon⁹ikna etmek için gösterilmiştir. İnflamatuar hücre genellikle içinde 6 h stroma istila ve 24 saat¹¹' e kadar orada kalır. Böylece, alkali yaralanması stromal harekete geçirmek ile ilgili çalışmalarda tavsiye bir yöntemdir. Başka bir tür kimyasal yaralanma dimetil sülfoksit (DMSO) uygulayarak üstünde kornea^9,10uyguluyor. Diğer sık kullanılan yaralanma modelleri stroma^14,15üst bölümü sınırlıdır stroma ve keratectomy yaralar üzerinden nüfuz umblikal yaralar içerir. Bu yöntemleri de stromal yara iyileşmesi ile ilgili soruları cevaplamak yararlıdır. Farklı yaralanma modelleri kendi avantaj ve dezavantajları vardır. Aşınma veya debridman, kornea epitel, ilk neşter dulled veya bıçaklar ex vivo kornealar¹⁶tarihinde kullanarak geliştirilmiştir. Bu yöntem daha sonra kullanılan vivo içinde fare, fare ve tavşan^{17,18,19,20,21,22}üzerinde olmuştur. Oküler burr (Şekil 1) kullanarak, epitel kalan etkilenmez bırakarak epitel, yalnızca seçili bir bölge kaldırın. Bu şekilde, tam olarak farklı bölgelerine kornea epitel kaldırma hedeflemek mümkündür. Buna ek olarak, aşınma boyutu floresein boyama ile tespit edilebilir. Ayrıca, burada aşınma kapatma sırasında iyileşme dönemi takip ediyoruz.

Bu yöntem birçok avantaj teşkil etmektedir, i) dahil olmak üzere tam yerini kimyasal yaralanma ile mümkün değildir, aşınma sitesinin II) aşınma gerçekleştirmek hızlı, ve III) Bu non-invaziv. Burada, bu fare genetik modellerini geniş dizi yanı sıra sıçan ve insan kornea bozulma eğitim için kullanılan ortak modellerdir tavşan uygulanan olabilir ancak bir model olarak outbred NMRI fareyi kullanarak yöntemi açıklanmaktadır.

Protokol

Tüm deneyler ulusal hayvan deney Kurulu tarafından onaylanır.

1. hazırlıkları

1. Tüm çözümler hazırlamak ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında tutmak. Atık bertaraf düzenlemelere dispose kullanılan malzemeler ve çözümler için.
2. Kullanım NMRI ve ICR outbred hisse senetleri, ya cinsiyet ve yaş 4-12 hafta arasında. C57BL/6 zorlanma kullanıyorsanız, adım 1.3.2 ketamin-medetomidine hazırlık yönteminde izleyin. Diğer adımlar için 1.3.3.-1.3.5 içinde açıklanan yönergeleri izleyin.
3. Veteriner ilaçları taze ve zamanında işlemi başlatmadan önce hazırlayın. Carprofen daha sonra kullanılacak olan, bu nedenle bu noktada hazırlamak gerekli değildir.
   1. Anestezi için ketamin-medetomidine çözeltisi hazırlamak için 0.375 mL karışımı (stok konsantrasyonu 50 mg/mL) ketamin bas (Ketaminol veteriner) ile 0.25 mL (stok konsantrasyonu 1 mg/mL) medetomidine (Cepetor veteriner) in ve steril %0,9 1,25 mL ekleyin NaCl. Fare ağırlık (7.5 mg/kg, ketamin ve 1 mg/kg, medetomidine) 0,15 mL/20 g yönetmek.
   2. Anestezi C57BL/6 fareler üzerinde ketamin-medetomidine daha sulu çözeltisi hazırlamak için 0.375 mL karışımı (stok konsantrasyon 50 mg/mL) ketamin bas 0.25 mL ile (stok konsantrasyonu 1 mg/mL), medetomidine ve steril %0,9 2.5 mL ekleyin NaCl. Fare ağırlık (3,75 mg/kg, ketamin ve 0.5 mg/kg, medetomidine) 0,15 mL/20 g yönetmek.
      Not: Bu sadece yetişkin C57BL/6 fareler için alternatif bir adım olduğunu.
   3. Buprenorfin analjezi için hazırlamak, 0.1 mL ekleyin (stok konsantrasyon 0.3 mg/mL), buprenorfin steril %0,9 1,9 ml NaCl. 0.2 mL/20 g fare ağırlık (0.15 mg/kg) yönetmek için.
   4. Atipamezole anestezi durdurulması için hazırlamak, 0.1 mL ekleyin (stok konsantrasyonu 5 mg/mL), atipamezole %0,9 4.9 ml NaCl. 0,15 mL/20 g fare ağırlık (0.75 mg/kg) yönetmek için.
   5. Sonrası anestezi sırasında analjezi için carprofen kullanın. 0.1 mL ekleyin (stok konsantrasyonu 50 mg/mL), carprofen %0,9 4.9 ml NaCl. Fare ağırlık (7.5 mg/kg) 0,15 mL/20 g yönetmek.
4. Floresan boyama çözüm hazırlamak
   1. Kobalt mavi ışık (Şekil 1) altında aşınma görüntülenmesi için floresan bir çözüm kullanın. İlk ölçüm 10 mg floresein tuz iyi ölçekli tarafından bir % 0,1 floresein çözüm hazırlamak ve çözümde fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL ekleyin.
   2. Fluoresein çözüm ışıktan korumak ve 5 dakika boyunca bir sallayıcı.
      Not: Işığa duyarlı floresein çözümdür; çözüm ışık kapalı tutun. Bu çözüm 4 ° C'de 2-3 gün süreyle saklanabilir. Kullanım için göz damlası için kullanılan bir damlalık şişe floresein çözüm yerleştirmek yararlıdır. Steril bir filtre çözümü için damlalık şişe taşırken kullanın.
5. Oküler burr ipucu önce ve sonra kullanım temizlik; ilk PBS ve daha sonra ile % 70 alkol. Bir aşınma birkaç fareler için aynı işlemi sırasında yapma, her fare arasında temizleme adımları yapın.
6. (37 derece ° C) ısıtmalı plaka koymak ve kağıt havlu üzerine yerleştirin.

2. kornea aşınma

Dikkat: koruyucu giyim (eldiven, önlük) kullandığınızda fare işleme. Yönetmek için ilaç hacmi tahmin etmek için fareyi tartın.

1. Fare²³işlemek için tek elle scruffing yöntemini kullanın. Ketamin-medetomidine karışımı intraperitoneally yönetmek (IP) sol alt karın için. Bireysel bir kafes için fareyi getirin ve uykuya dalmak bekleyin. Bu genellikle 5 dakikadan daha az sürer. O zaman, ilk buprenorfin ve sonra atipamezole ı.p. enjeksiyonları ile yönetirsiniz. Aynı işleme tekniği kullanın.
   Not: anestezi verildikten sonra protokol her an duraklatılmış değil.
2. Devam etmeden önce ateşli tabağı sıcak olup olmadığını kontrol edin. İmzalat fare ısıtmalı tabağa yerleştirin. Anestezi düzeyini iyi ise kuyruk refleks yoktur ama ayak refleks mevcuttur. Bu refleksleri kuyruk ve herhangi bir ayak parmakları veya forseps ile pinching tarafından kontrol edin. Aşırı güç kullanmayın. Anestezi son 20-25 dakika olacak.
3. Bir aşınma yapmak için temizlenmiş oküler burr kullanın. Aşınma yapmak esastır titreşim açmak için burr Bankası döndürün. Burr düzgün elinde, titreşim hissediyorum.
   1. Bir gözü bir anda göz kapakları parmak ile ayrı ayrı tutarak açın. Sonra sıkıca burr kornea için touch ve enstrüman de ileri geri hareket ettirmek gibi yan oküler yüzeyde. Burr titreşim çizik gerçekleştirir; tuşuna basın, sallamak veya kornea gözyaşı. Merkez kornea yüzeyi hareketleri aşındırma 20 yara ikna etmek yeterlidir. Burr kaldırın ve çizikler için kornea bölgede kalmaya çalışın. Standart boyutlu aşınma edinme uygulama birkaç tur gerektirir.
   
   Not: Betadin oftalmik çözüm kullanarak aşınma önce kornea asepsis elde edilebilir.

3. aşınma görüntüleme

1. Kobalt Mavisi kalem ışık (Şekil 1) ve floresein çözüm kullanarak aşınır bölgenin aydınlatmak. Oküler yüzeyi ortam ışığı renksiz görünür. Fluoresein uygulamadan sonra aşınır bölge yeşil göz kalemi ile ışık aydınlatıcı zaman fluoresces.
   1. Gerekirse, aşınır göz 2.3 olduğu gibi aynı şekilde açın ve bir damla floresein çözüm damlalık şişe yönetmek. PBS veya % 0,9 ile bir kez göz yıkama NaCl floresein arka plan azaltmak için. Bir damlalık şişe veya bir pipet yıkama için kullanın. Yumuşak bir bezle uzakta sıvı Aspire edin ve gerekirse kirpik, temiz. Aşırı sıvı genellikle göz gözyaşı kanalı'nın açılması yakın burun kenarlık için toplar.
      Dikkat: küçük sıyrıklar indüklenen gibi temizleme sırasında kornea dokunmaktan kaçının.
2. Kornea aşınma fotoğraf çekmek.
   1. Benzer görüntü görüntüleme her oturum sırasında elde etmek, kobalt mavisi kalem ışık ve SLR kamera (Şekil 2) için sabit ek araçları kullanın. Bu iletişim kuralı (Şekil 2) yinelemek kolay bir kurulum sağlar.
      1. Kalem ışık ve kamera takmak için bir masa lambası esnek bir kol ve kelepçe ve ayarlanabilir kamera kolunu bir kelepçe ile sırasıyla kullanın. Kablo bağı ışık masa lambası ve konum hemen üstünde fare göz kalemi. Işığı farklı konumlandırma aşınma görselleştirme değiştirebilir. Bu araçlar konumlandırma için bir öneri Şekil 2' de anlatılan.
   2. SLR fotoğraf makinesi göz fotoğraf çekmek için kullanın. İstenilen mesafe ve pozisyon ve odak fotoğraf makinesi (1:12) hayvan oda ışığında yerleştirin. Bundan sonra kobalt mavisi kalem ışık hariç diğer bütün ışıklar kapatın.
      Not: kalem ışık kolu aşağı bant veya görüntüleme sırasında her zaman ışık tutmak için bir lastik bant kullanın. Görüntü bulanık hale gelirse bu yardımcı olabilir. Bir meslektaşım ile görüntüleme adımı gerçekleştirmek en kolay yoldur.

4. sonra kornea aşınma uyanma

1. İlk buprenorfin ve sonra atipamezole ı.p. enjeksiyonları ile yönetirsiniz. 2.1 olduğu gibi aynı işleme tekniği kullanın.
2. Bir damla nemlendirmek ve oküler yüzey temiz bakterilerden anestezi sonra tutun aşınır ve sigara çizikler gözler için antibakteriyel, fucidin asit göz merhem (Isathal) koyun.
3. Fare ısıtmalı plaka üzerinde 5-20 dakika içinde uyanacak gibi fare sonrası anestezik uyandırma döneminde gözlemlemek. Mobil hale geldiğinde, bireysel bir kafese koyun.
   Not: uyanma daha uzun sürerse, ısıtmalı bir yastık ile kafeste fareyi getirin veya bütün kafesi ısıtmalı tabağa yerleştirin ve fare düzenli olarak izlemek. Anestezinin etkisi geçiyor, fare genellikle sallıyor ve yukarı doğru anterior vücut ile ulaşır. Bu davranış 3-4 saat içinde normale dönmesi gerekir ve sonra paylaşılan kafese fareyi getirin.
4. Carprofen ı.p. analjezi ve göz merhem için iki gün üst üste aynı şekilde olduğu gibi adımları 2.2 aşınma sonra bilgisayarları yönetmek. ve 4.2.

5. yara iyileşmesi sırasında görüntüleme

1. Bu protokol için 18 h ve 72 h aşınma sonra yara kapatma gözlemlemek için puan kullanım zaman.
   1. Ardışık görüntüleme için fareler 2.2 içinde açıklandığı gibi anestezi.
   2. 3'te açıklandığı gibi fotoğraf çekmek.
   3. Atipamezole ı.p. hayvanlarla uyan ve uyandırma döneminin 4,3 açıklandığı gibi izlemek.
      Not: Eğer değilse takip devam ediyor, şu 5.1.2 sonra fare ötenazi. Ötenazi 6.1 açıklanmıştır.

6. kornea koleksiyonu ve parafin katıştırma

1. Son zaman noktadan sonra hayvan kurban. Fare ile CO₂dolu bir odaya koyun. Oda hava CO ile doldurmak_2. Hayvan hareketsiz olduğunda, servikal vertebra kuyruk tabanından sıkıca çekerek ve boyun bölgesi aşağı aynı anda basarak yerinden çıkar.
   Dikkat: Her zaman yerel hayvan refahı vücut yönergeleri izleyin.
2. Tüm göz küresi deri bir açılış göz tarafına diseksiyon makasla keserek toplamak. Göz küresi altında makas yerleştirin ve göz küresi yörüngeden pop için oküler sinir kesti. Göz kolayca dışarı gelmez forseps kullanın.
   1. Ücretsiz penetrasyon çözümleri göz içinde izin vermek için 26 G iğne ile retina tarafında göz arkasında bir delik açın.
      Not: bunun yerine kuru, haline, iletişim kuralı ile devam kadar PBS içinde yer göz izin vermeyin.
3. Göz küresi PBS ile 2 mL tüp içinde toplamak. Deneme bu noktada durmaz.
4. PBS kaldırmak ve gözbebekleri %4 paraformaldehyde (PFA) içinde 4-5 saat 4 ° C'de düzeltin.
5. Sabit göz küresi doku işleme için bir doku kaset gider. İşleme makine ve aşağıdaki programı bir doku kullanın:
   1. Durulama PBS ile.
   2. % 70 etanol oda sıcaklığında 2 x 45 dk kuluçkaya.
   3. % 94'ü etanol oda sıcaklığında 2 x 1 h kuluçkaya.
   4. 3 x 45 dk içinde oda sıcaklığında mutlak etanol kuluçkaya.
   5. 3 x 1 h ksilen, oda sıcaklığında ve 37 ° C'de son ksilen içinde kuluçkaya
   6. 3 x 1 h Parafin balmumu 60 ° C'de kuluçkaya
6. İşleme doku sonra göz küresi Sıvı parafin (+ 60 ° C) bir doku gömme blok kullanarak gömün. Bloğun içine göz yana doğru bakıyor ve periferik kenarlığı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. 5-10 dakika için serin bir tabağa kuvvetlendirmek blok izin.

7. parafin kesitler kornea

1. Kurumun veya üreticinin yönergelerine göre kesit için microtome hazırlamak.
   Dikkat: keskin microtome bıçak ele alırken dikkatli olun.
2. Yer bir su banyosu oda sıcaklığında Ultrasaf Su microtome yanında ile ve başka Ultrasaf Su ile + 50 ° C'ye ısıtılmış
3. Göz küresi 5 µm kalınlığında bölümleri olun.
   Not: Lens kolayca kesit sırasında tatili. Bunu önlemek için her zaman yeni bir satır bölümlerinin başladı nemli mendil ile kesme yüzeyi silin. Musluk suyu doku nemlendirmek için kullanın.
4. Oda sıcaklığında su banyosu içinde birbirlerine yanında bölümleri yerleştirin ve ardından bir cam slayt yardımıyla sıcak su banyosu için taşıyın. Tüm kırışıklıkların rahatla kadar sıcak su banyosu ve bölümler haline mat bölümlerde germek.
5. 37 derece ° C. gecede bölümünde cam slaytlarla Kuru
6. 1 dakika + 60 ° c ısıtılmış bir plaka üzerinde slayt tutarak slaytlara bölümleri ekleyin Bundan sonra bölümler olabilir doğrudan boyama için immunohistological yöntemleri işlenen veya 4 ° c'depolanan

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı fare kornea bir aşınma yaralanma indirebilmek için bir modeli açıklar ve nasıl izleyin ve aşınma sonra iyileşme süreci görselleştirmek için önerir. Son zamanlarda, bu yöntem⁶şifa yara sırasında kornea epitel progenitör hücre rol çalışmaya çalıştırmaya başladık. Kurulan araçların kullanılması başarılı aşınma deneyi anahtarıdır. Biz ve diğerleri, Algerbrush II oküler burr (Şekil 1

Tartışmalar

Yaralama yöntemleri kornea homeostazı ve patolojileri farklı yönlerini incelemek için popüler araçlardır. Aşınma modeli Oftalmoloji ilgili sorunları çözmek için iyi kontrollü bir yöntem sunar. Ancak, bazı kritik noktaları iletişim kuralındaki vurgulayan değer vardır. Özellikle, belirlenen veteriner ilaçları, yara iyileşme zaman çizelgesi ve sonucu ile ilgili ayrıntıları outbred NMRI ve ICR stokları ile kullanım için optimize edilmiştir, ama fareler²⁶suşları aras...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA