Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

Resumo

Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

Resumo

A córnea murino fornece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. A córnea é a camada mais externa do olho e, portanto, é a primeira defesa de lesão. Na verdade, o tipo mais comum de lesão ocular encontrado na clínica é uma abrasão da córnea. Aqui, nós utilizamos uma rebarba ocular para induzir uma abrasão, resultando na remoção do epitélio corneano na vivo em ratos anestesiados. Este método permite a interrupção epitelial visada e reprodutível, deixando outras áreas intactas. Além disso, descrevemos a visualização do epitélio com fluoresceína mancha abradado e fornecer aconselhamento concreto sobre como visualizar a abrasão da córnea. Então, seguimos a linha do tempo da ferida cura 0, 18 e 72 h após a abrasão, até que a ferida é re-epithelialized. O modelo de abrasão epitelial de lesão corneana é ideal para estudos sobre a proliferação de células epiteliais, migração e re-epitelização das camadas da córnea. No entanto, esse método não é ideal para estudar a ativação do estroma durante a cicatrização de feridas, porque a rebarba ocular não penetra nas camadas de células do estroma. Esse método também é apropriado para aplicações clínicas, por exemplo, pré-clínicos teste de eficácia de drogas.

Introdução

Epitelial de inúmeros órgãos está expostos a lesões. No entanto, eles também contêm a capacidade de compensar a perda de tecido através da cicatrização da ferida. A córnea oferece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. Forma a superfície externa do olho e fornece uma camada protetora para a maquinaria ocular sensível. Assim, a córnea funciona como uma barreira física para patógenos e perda de água. É composto de três camadas; epitélio, estroma e endotélio. O epitélio da córnea torna-se a camada mais externa da córnea. Células epiteliais mantêm a função de barreira da córnea aderindo estritamente ao outro através de junções apertadas^1,2,3. Uma membrana basal acelular da córnea, membrana de Bowman, separa o epitélio do estroma extensivo, que contém keratocytes refratário. Sob o estroma, células endoteliais canal nutrientes, água e oxigênio para a camada superior.

Abrasões da córnea são muito comuns na clínica⁴. Lesões de córnea são diversos, mas em grande parte são causados por pequenas partículas, como poeira ou areia, arranhões ou outros objectos estranhos. O protocolo descrito aqui visa reproduzir um tipo clinicamente relevante de abrasão epitelial da córnea. Ao fazê-lo, este protocolo fornece um método controlável e seminal para clínicos e cientistas da córnea implementar em seus próprios estudos. Efetuamos um ensaio de reparo de lesões no vivo na córnea murino por abrasão o tecido com uma rebarba ocular entorpecida, o II Algerbrush. Aqui, temos como alvo a abrasão para o epitélio corneano central e deixar as outras partes do órgão sem danos. Assim, o protocolo é ideal para estudo célula epitelial da córnea dinâmica ou a membrana basal durante a re-epitelização, célula de migração, proliferação e diferenciação em vivo⁵. Recentemente, este modelo foi usado para analisar a dinâmica de células progenitoras na córnea murino, bem como para desvendar a capacidade das células epiteliais da córnea diferenciadas em re-estabelecer o nicho de células-tronco da córnea após lesão^6,7. Após abrasão, a córnea retorna ao seu normal transparência e resistência à tração. Curiosamente, um estudo em vitro indicou que re-epitelização ocorre sem célula maior proliferação⁸. Este protocolo descreve a linha do tempo de cicatrização ininterrupta na córnea murino. O método é, portanto, aplicável para testar o efeito das drogas sobre a cura de padrões e velocidade.

A córnea tem sido extensivamente usada para estudos de cicatrização de feridas. No entanto, muitos estudos têm contado com outros modelos de lesão. Um modelo bem estabelecido de lesão da córnea é a queimadura alcalina é executada através da aplicação de hidróxido de sódio (NaOH) com ou sem papel de filtro sobre a superfície da córnea⁹. Alcalina exposição resulta em uma lesão grande e difusa que afeta não só o epitélio corneano, mas também a conjuntiva e estroma^9,10. Soluções alcalinas fortes foram mostradas para induzir úlceras da córnea, opacificação e neovascularização⁹. Células inflamatórias invadem o estroma geralmente dentro de 6 h e permanecem lá até 24 h¹¹. Assim, a lesão alcalina é um método aconselhável em estudos relacionados à ativação do estroma. Um outro tipo de lesão química pode ser infligido aplicando dimetilsulfóxido (DMSO) na córnea^9,10. Outros modelos de lesões comumente usados incluem feridas incisional que penetram através do estroma e fotorrefrativa feridas, que são limitadas a porção superior do estroma^14,15. Esses métodos também são úteis para responder perguntas sobre a cicatrização de feridas do estroma. Lesão de diferentes modelos têm suas próprias vantagens e desvantagens. Abrasão, ou desbridamento, do epitélio corneano foi desenvolvida usando bisturis entorpecidas ou lâminas em ex vivo córneas¹⁶. Este método foi mais tarde usado na vivo no rato, rato e coelho^{17,18,19,20,21,22}. Usando a rebarba ocular (Figura 1), removemos apenas uma região selecionada do epitélio, deixando o resto do epitélio afetado. Desta forma, é possível segmentar com precisão a remoção epitelial para diferentes partes do cornea. Além disso, o tamanho de abrasão pode ser avaliado com coloração de fluoresceína. Além disso, aqui seguimos encerramento abrasão durante o período de cicatrização.

Esse método apresenta diversas vantagens, i) incluindo a localização precisa do local de abrasão, que não é possível com lesão química, ii) a abrasão é rápida a executar e iii) é não-invasivo. Aqui, descrevemos o método usando o mouse NMRI outbred como modelo, no entanto, isso poderia ser aplicado para a vasta gama de modelos genéticos de rato, bem como para o rato e o coelho, que são modelos comuns usados para estudar a ruptura da córnea humana.

Protocolo

Todas as experiências são aprovadas pelo Conselho Nacional de experimento animal.

1. preparações

1. Preparar todas as soluções e manter em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Siga os regulamentos de eliminação de resíduos para dispose utilizado materiais e soluções.
2. Uso NMRI e ICR consanguíneo ações, entre as idades de 4 a 12 semanas e ambos os sexos. Se usando a linhagem C57BL/6, siga o método de preparação de cetamina-medetomidina na etapa 1.3.2. Para outras etapas, siga as instruções descritas em 1.3.3.-1.3.5.
3. Prepare o medicamento veterinário fresco e no tempo, antes de iniciar a operação. Carprofeno será usado mais tarde, assim não é necessário para prepará-lo neste momento.
   1. Para preparar uma solução de cetamina-medetomidina para anestesia, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina (Ketaminol Vet) com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina (Cepetor Vet) e adicione 1,25 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).
   2. Para preparar uma solução mais diluída de cetamina-medetomidina anestesia em camundongos C57BL/6, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina e adicionar 2,5 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (3,75 mg/kg, cetamina e 0,5 mg/kg, medetomidina).
      Nota: Este é um passo alternativo, apenas para adultos camundongos C57BL/6.
   3. Para preparar o buprenorfin para analgesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 0,3 mg/mL) de buprenorfin a 1,9 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,2 mL/20 g de massa de rato (0,15 mg/kg).
   4. Para preparar o atipamezole para interromper a anestesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 5 mg/mL) de atipamezole para 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de massa de rato (0,75 mg/kg).
   5. Para analgesia durante pós-anestesia use carprofeno. Adicionar 0,1 mL (concentração de ações 50mg/mL) de carprofeno a 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg).
4. Preparar a solução de coloração fluorescente
   1. Para visualizar a abrasão sob a luz azul cobalto (Figura 1), use uma solução fluorescente. Preparar uma solução de fluoresceína 0,1% primeira medição 10 mg de sal de fluoresceína com uma escala bem e em seguida, adicioná-lo a 10 mL de solução salina tampão fosfato (PBS).
   2. Proteger a solução de fluoresceína de luz e agitar durante 5 minutos em uma coqueteleira.
      Nota: A solução de fluoresceína é sensível à luz; manter a solução coberta de luz. Esta solução pode ser armazenada em + 4 ° C durante 2-3 dias. Para uso, é útil colocar a solução de fluoresceína em um frasco conta-gotas que é usado para colírio. Use um filtro estéril quando se deslocam a solução para o frasco conta-gotas.
5. Limpe a ponta da rebarba ocular antes e após o uso; primeiro com PBS e, em seguida, com 70% EtOH. Se tornando uma abrasão para vários ratos durante a mesma operação, fazer as limpeza etapas entre cada rato.
6. Ponha a placa aquecida (37 ° C) e coloque uma toalha de papel nele.

2. corneal abrasão

Atenção: Utilize protectores (luvas, jaleco) quando lidar com ratos. Pese o mouse para estimar o volume de medicação a administrar.

1. Use o método agarrando com uma mão para manipular o rato²³. Administrar a mistura de cetamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) no abdômen inferior esquerdo. Coloque o mouse para uma gaiola individual e esperar que caia no sono. Isso geralmente leva menos de 5 minutos. Em seguida, administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação.
   Nota: Uma vez que a anestesia é dada, o protocolo deve não ser pausado a qualquer momento.
2. Antes de continuar, verifique se a placa aquecida é quente. Coloque o mouse anestesiado na chapa aquecida. O nível da anestesia é bom se o reflexo de cauda está ausente, mas o reflexo do dedo do pé está presente. Estes reflexos por beliscar a cauda e qualquer dedo do pé com os dedos ou uma pinça. Não use força excessiva. Anestesia vai durar 20-25 minutos.
3. Para tornar uma abrasão, use a rebarba ocular limpa. Gire a base das rebarbas para ativar a vibração que é essencial para fazer a abrasão. Senti a vibração na mão, quando a rebarba está funcionando corretamente.
   1. Abra um olho de cada vez, mantendo as pálpebras separadamente com os dedos. Então firmemente tocar as rebarbas para a córnea e deslocar o instrumento e para trás, bem como para os lados da superfície ocular. A vibração de rebarba executará o zero; Não pressione, agitar ou rasgar a córnea. A córnea central, 20 movimentos na superfície de abrasão são suficientes para induzir a ferida. Não levante a rebarba e tentar ficar na região da córnea para ser desgastados. Adquirir uma abrasão tamanho padrão exigirá várias rodadas de prática.
   
   Nota: Assepsia da córnea pode ser conseguida antes de abrasão usando betadine solução oftálmica.

3. imagem latente a abrasão

1. Ilumine a região abradada usando solução de fluoresceína e luz de caneta azul cobalto (Figura 1). A superfície ocular parece incolor em luz ambiente. Após a aplicação de fluoresceína, região abradada fluoresce a verde quando iluminando o olho com a caneta de luz.
   1. Se necessário, abra o olho abradado da mesma forma como no 2.3 e administrar uma gota de solução de fluoresceína do frasco conta-gotas. Lavar o olho uma vez com PBS ou 0,9% NaCl para reduzir fundo da fluoresceína. Use um frasco conta-gotas ou uma pipeta para lavagem. Aspirar o líquido fora com uma limpeza suave e limpar os cílios, se necessário. O excesso de líquido geralmente coleta à fronteira nasal do olho, perto da abertura do canal lacrimal.
      Atenção: Evite tocar a córnea enquanto cleaining como escoriações menores podem ser induzidas.
2. Fotografa a abrasão da córnea.
   1. Para obter imagens semelhantes durante cada sessão de imagens, use ferramentas de fixação constante para a luz de caneta azul cobalto e a câmera de SLR (Figura 2). Este protocolo fornece uma configuração fácil de repetir (Figura 2).
      1. Para anexar a luz caneta e a câmera, use um candeeiro de mesa com um braço flexível e braçadeira e um braço de câmera ajustável com uma pinça, respectivamente. Cabo-tie a caneta de luz ao candeeiro de mesa e posição logo acima do olho do rato. A luz de posicionamento diferente pode alterar a visualização da abrasão. Uma sugestão para o posicionamento dessas ferramentas é descrita na Figura 2.
   2. Use a câmera SLR para tirar fotos do olho. Coloque o animal em uma distância desejada e a posição e o foco da câmera (01:12) na luz do quarto. Depois disso, feche todas as outras luzes, exceto a luz de caneta azul cobalto.
      Nota: O manípulo de luz caneta de fita para baixo ou use um elástico para manter a luz acesa o tempo todo durante a imagem latente. Isto pode ajudar se a imagem se torna embaçada. É mais fácil de executar a etapa de imagem com um colega.

4. acordar após abrasão Corneal

1. Administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação, como em 2.1.
2. Coloque uma gota de antibacteriano, fucidin ácido pomada (Isathal) para olhos desgastados e não-desgastada para hidratar e manter a superfície ocular limpo de bactérias após a anestesia.
3. Como o mouse vai acordar em 5-20 minutos na placa aquecida, observe o mouse durante o período pós-anestésico do despertar. Quando torna-se móvel, coloque-o em uma gaiola individual.
   Nota: Se acordar leva mais tempo, coloque o rato na gaiola com uma almofada aquecida ou coloque a gaiola inteira sobre a chapa aquecida e monitorar o mouse regularmente. Enquanto o efeito da anestesia, o mouse normalmente sacode e atinge para cima com o corpo anterior. Esse comportamento deve retornar ao normal em 3-4 horas e então você pode colocar o mouse volta para uma jaula compartilhada.
4. Administre o carprofeno i.p. para analgesia e olho pomada em dois dias consecutivos após a abrasão, da mesma forma como em passos 2.2. e 4.2.

5. imagem latente durante a cicatrização de feridas

1. Neste protocolo, tempo de uso aponta 18 h e 72 h após a abrasão para observar o fechamento da ferida.
   1. Para tratamento de imagens consecutivo, anestesia os ratos como explicado no ponto 2.2.
   2. Tire fotos como explicado em 3.
   3. Acorde os animais com atipamezole i.p. e monitorar o período de despertar, conforme explicado no ponto 4.3.
      Nota: se não continuar o acompanhamento, eutanásia o mouse logo após 5.1.2. Eutanásia é descrita em 6.1.

6. córnea coleção e incorporação de parafina

1. Após o último ponto de tempo, sacrifica o animal. Coloque o mouse em uma câmara que pode ser preenchida com CO₂. Encher o ar da câmara com CO_2. Quando o animal fica imóvel, deslocar as vértebras cervicais puxando firmemente da base da cauda e pressionando a região do pescoço para baixo, ao mesmo tempo.
   Cuidado: Siga sempre as orientações do órgão local de bem-estar animal.
2. Recolha o globo ocular inteiro cortando uma abertura na pele para o lado do olho com uma tesoura de dissecação. Coloque a tesoura sob o globo ocular e cortar o nervo ocular para estalar o globo ocular fora da órbita. Use a pinça se o olho não sai facilmente.
   1. Faça um buraco na parte de trás do olho, do lado da retina, com uma agulha 26G para permitir a livre penetração das soluções dentro do olho.
      Nota: Não deixe o olho tornar-se seca, em vez disso, colocá-lo em PBS até continuando com o protocolo.
3. Recolha o globo ocular em um tubo de 2 mL com PBS. Não pausa o experimento neste ponto.
4. Remover o PBS e corrigir olhos em paraformaldeído 4% (PFA) em + 4 ° C por 4-5 horas.
5. Mova o olho fixo para uma fita de tecido para processamento do tecido. Use um tecido de processamento da máquina e o programa a seguir:
   1. Enxaguar com PBS.
   2. Incube 2 x 45 min em etanol a 70% à temperatura ambiente.
   3. Incube 2 x 1 h em 94% de etanol na temperatura de quarto.
   4. Incube 3 x 45 min em etanol absoluto à temperatura ambiente.
   5. Incubar 3 x 1 h em xilol, a temperatura e a último xileno a 37 ° C.
   6. Incubar 3 x 1 h em cera de parafina a 60 ° C.
6. Após processamento de tecido, incorpore o globo ocular em parafina líquida (+ 60 ° C), usando um bloco de incorporação de tecido. Coloque o olho dentro do bloco é olhar para os lados e a borda periférica é virada para cima. Deixe o bloco solidificar em um prato legal por 5-10 minutos.

7. parafina seções da córnea

1. Prepare o micrótomo para corte de acordo com as instruções da instituição ou do fabricante.
   Cuidado: Tenha cuidado ao manusear a lâmina afiada do micrótomo.
2. Banho de água de um lugar com temperatura de água ultrapura ao lado do micrótomo e outro com água ultrapura aquecido a + 50 ° C.
3. Fazer 5 µm de espessura seções do globo ocular.
   Nota: A lente rompe facilmente durante o corte. Para evitar isso, limpe a superfície do corte com um tecido úmido, cada vez que uma nova linha de seções é iniciada. Use água da torneira para umedecer o tecido.
4. Colocar as seções ao lado do outro em banho de água a temperatura ambiente e em seguida, movê-los para o banho de água quente com a ajuda de uma lâmina de vidro. Estica o banho de água quente, até que todas as rugas relaxar e o fosco seções tornam-se as seções.
5. Secar as lâminas de vidro com seções pernoite em 37 ° C.
6. Anexar as seções para os slides, mantendo o slide por 1 minuto em uma placa aquecida em + 60 ° C. Depois disso, as seções podem ser diretamente processadas para coloração, métodos reagidos ou armazenadas em + 4 ° C.

Resultados

Este protocolo descreve um modelo para infligir um dano de abrasão ao cornea de rato e sugere como seguir e visualizar o processo de cicatrização após a abrasão. Recentemente, utilizamos este método para estudar o papel das células progenitoras epiteliais da córnea durante⁶de cicatrização de feridas. O uso de ferramentas estabelecidas é a chave para uma experiência bem sucedida de abrasão. Nós e outros, têm usado as rebarbas ocular Algerbrush II (

Discussão

Ferindo métodos são ferramentas populares para estudar diferentes aspectos da homeostase da córnea e patologias. O modelo de abrasão oferece um método bem controlado para resolver problemas relevantes em oftalmologia. No entanto, determinados pontos críticos no protocolo são vale a pena enfatizar. Notavelmente, os detalhes descritos em matéria de medicina veterinária, ferida cura cronograma e resultado são otimizados para uso com estoques NMRI e ICR outbreds, mas podem variar entre cepas de ratos

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA