Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, einen Abrieb auf der Augenoberfläche der Maus zuzufügen und die Wundheilung danach zu folgen. Das Protokoll nutzt eine augenfällige Grat, teilweise das oberflächenepithel des Auges in narkotisierter Mäuse zu entfernen.

Zusammenfassung

Die murine Hornhaut bietet ein hervorragendes Modell um die Wundheilung zu studieren. Die Hornhaut ist die äußerste Schicht des Auges, und somit ist die erste Verteidigungslinie zu Verletzungen. In der Tat ist die häufigste Art von Verletzungen am Auge gefunden in Klinik ein korneaabnutzung. Hier nutzen wir eine augenfällige Grat um einen Abrieb was Entfernung des Hornhaut-Epithel in Vivo an narkotisierten Mäusen zu induzieren. Diese Methode ermöglicht gezielte und reproduzierbare epithelialen Störung, wobei andere Bereiche intakt bleiben. Darüber hinaus wir beschreiben die Visualisierung der abgeriebenen Epithel mit Fluorescein beflecken und liefern konkrete Ratschläge wie man die abgeriebenen Hornhaut zu visualisieren. Dann folgen wir die Zeitleiste der Wundheilung 0, 18 und 72 h nach Abrieb, bis die Wunde wieder epithelialized ist. Die epithelialen Abrieb Modell der Verletzung der Hornhaut ist ideal für Studien zur epithelialen Zell-Proliferation, Migration und Re Epithelisierung der Hornhaut Schichten. Diese Methode ist jedoch nicht optimal Stromazellen Aktivierung bei der Wundheilung, zu studieren, weil der okuläre Grat nicht um die Stromale Zellschichten eindringt. Diese Methode ist auch geeignet für klinische Anwendungen, z. B. der präklinischen Prüfung der Wirksamkeit der Droge.

Einleitung

Epitheliale Schichten zahlreiche Organe sind Verletzungen ausgesetzt. Sie enthalten jedoch auch die Möglichkeit zum Ausgleich Gewebeverlust durch Wundheilung. Die Hornhaut bietet ein hervorragendes Modell um die Wundheilung zu studieren. Es bildet die äußere Oberfläche des Auges und bietet eine Schutzschicht für die sensible okuläre Maschinen. So funktioniert Hornhaut als eine physikalische Barriere gegenüber Krankheitserregern und Wasserverlust. Es besteht aus drei Schichten; Epithel, Stroma und Endothel. Das Epithel der Hornhaut bildet die äußerste Schicht der Hornhaut. Epithelzellen pflegen die Barrierefunktion der Hornhaut durch die Einhaltung streng miteinander durch tight Junctions^1,2,3. Eine azelluläre Hornhaut Basalmembran, die Bowman-Membran trennt das Epithel aus der umfangreichen Stroma, das feuerfeste keratozyten enthält. Unter das Stroma Kanal endotheliale Zellen Nährstoffe, Wasser und Sauerstoff, die obere Schicht.

Hornhauterosionen sind sehr häufig in der Klinik⁴. Verletzungen der Hornhaut sind vielfältig, aber vor allem durch kleine Partikel wie Staub oder Sand, Kratzer oder andere Fremdkörper verursacht werden. Das Protokoll beschrieben hier zielt auf eine klinisch relevante Art von epithelialen korneaabnutzung zu reproduzieren. Dabei bietet dieses Protokoll eine kontrollierbare und bahnbrechende Methode für Kliniker und Wissenschaftler Hornhaut, in eigenen Studien zu implementieren. Wir haben eine in Vivo Verletzung Reparatur Assays auf der murinen Hornhaut durch Anrauen des Gewebes mit einer getrübten okuläre Burr, Algerbrush II durchgeführt. Unser Ziel hier, den Abrieb nur auf der zentralen Hornhaut-Epithel und lassen Sie die anderen Teile der Orgel ohne Schaden. So, das Protokoll ist ideal, um Studie Hornhaut Epithelzelle Dynamik oder der Basalmembran während Re Epithelisierung, Migration, Proliferation und Differenzierung in Vivo⁵Zelle. Vor kurzem wurde dieses Modell zum Analysieren der Stammvater Zelldynamik in der murinen Hornhaut als auch hinsichtlich der Kapazität der differenzierten Hornhaut epithelialen Zellen bei der Neugründung der Hornhaut Stammzellnische nach Verletzungen^6,7zu enthüllen. Nach Abrieb kehrt die Hornhaut zu seiner normalen Transparenz und Zugfestigkeit. Interessant ist, eine in-vitro- Studie angedeutet, dass re Epithelisierung ohne erhöhte Zelle Verbreitung⁸tritt. Dieses Protokoll beschreibt die Zeitachse der ununterbrochenen Heilung in der murinen Hornhaut. Die Methode ist somit anwendbar, die Wirkung von Medikamenten auf die Heilung von Mustern und Geschwindigkeit zu testen.

Die Hornhaut ist beträchtlich für Wundheilung Studien benutzt worden. Jedoch haben viele Studien auf andere Modelle der Verletzung verlassen. Ein gut etabliertes Modell der Verletzung der Hornhaut ist die alkalische brennen, die durchgeführt wird, durch die Anwendung von Natriumhydroxid (NaOH) mit oder ohne Filterpapier auf die Hornhaut-Oberfläche-⁹. Alkalische Exposition führt zu einer großen und diffuse Verletzung, die betrifft nicht nur das Hornhaut-Epithel, sondern auch die Bindehaut und Stroma^9,10. Starke alkalische Lösungen nachweislich hornhautgeschwüren, eintrübt und Neovaskularisation⁹induzieren. Entzündungszellen dringen in das Stroma in der Regel innerhalb von 6 h und bleiben dort bis zum 24 h-¹¹. Somit ist alkalisch Verletzungen eine ratsam Methode in Studien im Zusammenhang mit Stromazellen Aktivierung. Eine andere Art von chemischen Verletzungen kann durch die Anwendung von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) zugefügt werden, auf die Hornhaut^9,10. Andere häufig verwendete Verletzungen Modelle umfassen incisional Wunden, die durch die Stroma und Keratektomie Wunden eindringen, die auf den oberen Teil der Stroma^14,15beschränkt sind. Diese Methoden eignen sich auch zur Rede und Antwort bezüglich Stromazellen Wundheilung. Verschiedene Verletzungen Modelle haben ihre eigenen vor- und Nachteile. Abrieb oder Debridement, der das Hornhaut-Epithel wurde zuerst mit getrübten Skalpelle oder klingen auf ex Vivo Hornhaut¹⁶entwickelt. Diese Methode wurde später verwendet in Vivo auf Maus, Ratte und Kaninchen^{17,18,19,20,21,22}. Mit Hilfe des okulären Grates (Abbildung 1), entfernen wir nur einen ausgewählten Bereich des Epithels, ohne Auswirkung auf den Rest des Epithels. Auf diese Weise ist es möglich auf die epithelialen Entfernung zu den verschiedenen Teilen der Hornhaut. Darüber hinaus kann die Größe der Abrieb mit Fluorescein Beflecken beurteilt werden. Darüber hinaus folgen wir hier Abrieb Schließung während der Einheilphase.

Diese Methode birgt einige Vorteile, i) einschließlich der genauen Standort der Abrieb Website, die nicht mit chemischen Verletzungen möglich ist, (Ii) der Abrieb ist schnell durchzuführen, und (Iii) Es ist nicht-invasiv. Hier beschreiben wir die Methode mit der outbred NMRI Maus als Modell, aber dies angewendet werden könnte, die breite Palette von genetischer Mausmodelle sowie der Ratte und Kaninchen, die gängigen Modelle zur Untersuchung der menschlichen Hornhaut Störungen sind.

Protokoll

Alle Experimente werden von den nationalen Tierversuch Board genehmigt.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie alle Lösungen und halten bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben. Befolgen der Abfallentsorgung zu entsorgen verwendete Materialien und Lösungen.
2. Verwendung NMRI und ICR fremd-Bestände Alter zwischen 4 und 12 Wochen und beiderlei Geschlechts. Wenn den Stamm C57BL/6 verwenden, folgen Sie den Ketamin-Medetomidine Vorbereitung Methode im Schritt 1.3.2. Folgen Sie für weitere Schritte den Anweisungen in 1.3.3.-1.3.5 beschrieben.
3. Bereiten Sie die Veterinärmedizin, frisch und in der Zeit vor der Inbetriebnahme. Carprofen wird später verwendet werden, so ist es nicht notwendig, um es an dieser Stelle vorbereitet.
   1. Um eine Lösung von Ketamin-Medetomidine Anästhesie vorzubereiten, mischen 0,375 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Ketamin (Ketaminol Vet) mit 0,25 mL (Konzentration Lager 1 mg/mL) von Medetomidine (Cepetor Vet) und 1,25 mL steriler 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (7,5 mg/kg, Ketamin und 1 mg/kg, Medetomidine).
   2. Um eine mehr verdünnte Lösung von Ketamin-Medetomidine Vorbereitung der Anästhesie bei C57BL/6 Mäusen mischen 0,375 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Ketamin mit 0,25 mL (Konzentration Lager 1 mg/mL) von Medetomidine und 2,5 mL steriler 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (3,75 mg/kg, Ketamin und 0,5 mg/kg, Medetomidine).
      Hinweis: Dies ist eine alternative Schritt nur für Erwachsenen C57BL/6 Mäusen.
   3. Zur Analgesie Buprenorfin Vorbereitung, fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 0,3 mg/mL) des Buprenorfin auf 1,9 mL steriler 0,9 % NaCl. 0,2 mL/20 g Maus Gewicht (0,15 mg/kg) zu verwalten.
   4. Atipamezol Vorbereitung für die Anästhesie Einstellung, fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 5 mg/mL) von Atipamezol bis 4,9 mL 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (0,75 mg/kg).
   5. Verwenden Sie für Analgesie während der Post-Narkose Carprofen. Fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Carprofen bis 4,9 mL 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (7,5 mg/kg).
4. Fluoreszierende Färbelösung vorbereiten
   1. Zur Visualisierung des Abrieb unter dem Kobalt Blaulicht (Abbildung 1), verwenden Sie eine fluoreszierende Lösung. Bereiten Sie eine 0,1 % Fluorescein-Lösung durch die erste Messung 10 mg von Fluorescein Salz mit einer feinen Skala und fügen Sie ihn auf 10 mL in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   2. Die Fluorescein-Lösung vor Licht schützen und für 5 Minuten auf einem Shaker schütteln.
      Hinweis: Die Fluorescein-Lösung ist lichtempfindlich; halten Sie die Lösung von Licht bedeckt. Diese Lösung kann für 2-3 Tage bei + 4 ° C aufbewahrt werden. Für den Einsatz ist es hilfreich, die Fluorescein-Lösung in einer Tropfflasche zu legen, die für Augentropfen verwendet wird. Verwenden Sie ein Sterilfilter, beim Wechsel der Lösung auf die Tropfflasche.
5. Reinigen Sie die okuläre Burr-Tipp vor und nach Gebrauch; zuerst mit PBS und dann mit 70 % EtOH. Wenn einen Abrieb an mehrere Mäuse während der gleichen Operation vorgenommen werden, tun die Reinigungsschritte zwischen jeder Maus.
6. Die beheizte Platte auf (+ 37 ° C) und platzieren Sie ein Papiertuch auf ihn.

(2) Korneaabnutzung

Achtung: Verwenden Sie Schutzkleidung (Handschuhe, Kittel) beim Umgang mit Mäusen. Wiegen Sie die Maus, um das Volumen der Medikamente zu verabreichen zu schätzen.

1. Verwenden Sie die einhändige scruffen Methode um die Maus²³behandeln. Ketamin-Medetomidine Mischung intraperitoneal verwalten (i.p.) auf den linken Unterbauch. Platzieren Sie den Mauszeiger in einen einzelnen Käfig und warten Sie, bis es zum Einschlafen. Dies dauert in der Regel weniger als 5 Minuten. Verwalten Sie erste Buprenorfin und dann Atipamezol über i.p Injektionen dann. Verwenden Sie die gleichen Umgang mit Technik.
   Hinweis: Wenn Anästhesie gegeben ist, sollte das Protokoll nicht jederzeit angehalten werden.
2. Prüfen Sie bevor Sie fortfahren, ob die beheizte Platte warm ist. Platzieren Sie die narkotisierten Maus auf der beheizten Platte. Das Niveau der Anästhesie ist gut, wenn der Schweif Reflex fehlt, aber der Fuß-Reflex vorhanden ist. Überprüfen Sie diese Reflexe durch Kneifen das Heck und alle Zehen mit den Fingern oder einer Pinzette. Keine Gewalt anwenden. Anästhesie ist 20-25 Minuten.
3. Um einen Abrieb zu machen, verwenden Sie den gereinigten okulären Grat. Drehen Sie die Basis der Grat schalten Sie die Vibration, die unerlässlich ist, den Abrieb zu machen. Spüren Sie die Vibration in der hand, wenn der Grat einwandfrei funktioniert.
   1. Öffnen Sie ein Auge zu einer Zeit, indem Sie die Augenlider separat mit den Fingern halten. Dann fest berühren Sie den Grat an der Hornhaut und bewegen Sie das Gerät hin und her sowie auf der Augenoberfläche wie seitwärts. Die Grat Schwingung führt den Kratzer; nicht drücken, schütteln oder die Hornhaut zu reißen. In der zentralen Hornhaut sind 20 schleifende Bewegungen auf der Oberfläche ausreichen, um die Wunde zu induzieren. Heben Sie den Grat nicht und versuchen Sie, bleiben in der Region der Hornhaut abgeschliffen werden. Erwerb eines Standardgröße Abrieb werden mehrere Runden der Praxis erfordern.
   
   Hinweis: Hornhaut Asepsis vor Abrieb lässt sich mithilfe von ophthalmologischen Betadine Lösung.

(3) Bildgebung den Abrieb

1. Die abgeriebenen Region mit Kobaltblau Stift Licht (Abbildung 1) und Fluorescein Lösung zu beleuchten. Die Augenoberfläche wird farblos bei Umgebungslicht. Nach Fluorescein Anwendung fluoresziert abgeschürfte Region in grün, wenn das Auge mit dem Stift Licht beleuchtet.
   1. Bei Bedarf öffnen Sie das abgeschliffene Auge ähnlich wie bei 2.3 und verwalten Sie einen Tropfen von Fluorescein-Lösung aus der Tropfflasche. Waschen Sie das Auge einmal mit PBS oder 0,9 % NaCl, Hintergrund der Fluorescein zu reduzieren. Verwenden Sie eine Tropfflasche oder Pipette zum Waschen. Aspirieren Sie die Flüssigkeit mit einem weichen Tuch entfernt und reinigen Sie die Wimpern nach Bedarf. Die überschüssige Flüssigkeit sammelt sich in der Regel zur nasalen Grenze des Auges, in der Nähe von der Eröffnung des Kanals Träne.
      Achtung: Berühren Sie die Hornhaut während Ablaufrinnen da kleinere Abschürfungen induziert werden können.
2. Machen Sie Fotos von der korneaabnutzung.
   1. Um ähnliche Bilder bei allen bildgebenden Sitzungen zu erhalten, verwenden Sie stabile Befestigung Werkzeuge für das Kobaltblau Stift Licht und die SLR-Kamera (Abbildung 2). Dieses Protokoll bietet eine Setup, das einfach zu wiederholen (Abbildung 2).
      1. Um das Stift Licht und die Kamera zu befestigen, verwenden Sie eine Tischleuchte mit flexiblem Arm und Klemme und einen verstellbaren Kameraarm mit einer Klammer bzw.. Kabelbinder der Stift leicht um die Tischleuchte und Position genau über die Maus Auge. Positionieren das Licht anders könnte die Visualisierung der Abrieb verändern. Ein Vorschlag für die Positionierung dieser Werkzeuge ist in Abbildung 2beschrieben.
   2. Verwenden Sie die SLR-Kamera um zu fotografieren des Auges. Legen Sie das Tier in einen gewünschten Abstand, Position und Ausrichtung der Kamera (01:12) im Raumlicht. Danach schließen Sie alle anderen Lichter außer Kobaltblau Stift Licht.
      Hinweis: Den Stift leicht Griff nach unten mit Klebeband oder verwenden Sie ein Gummiband um das Licht auf die ganze Zeit während der Bildgebung zu halten. Dies könnte helfen, wenn das Bild unscharf wird. Es ist am einfachsten, die bildgebende Schritt mit einem Kollegen durchführen.

(4) aufwachen nach Korneaabnutzung

1. Verabreichen Sie erste Buprenorfin und dann Atipamezol über i.p Injektionen. Verwenden Sie die gleiche Handhabung Technik wie in 2.1.
2. Geben Sie einen Tropfen der antibakteriellen, Fucidin Säure Augensalbe (Isathal) abgeschliffen und nicht abgeschliffen Augen zu befeuchten der Augenoberfläche sauber von Bakterien nach der Narkose.
3. Wie die Maus in 5-20 Minuten auf der beheizten Platte aufwachen wird, beobachten Sie die Maus während der Post-Narkose aufwachen-Periode. Wenn es mobiler wird, legen Sie sie in einen einzelnen Käfig.
   Hinweis: Wenn Aufwachen länger dauert, platzieren Sie den Mauszeiger in den Käfig mit einem beheizten Pad oder legen Sie den gesamten Käfig auf der beheizten Platte und überwachen Sie die Maus regelmäßig zu. Während die Narkose nachlässt, wird die Maus in der Regel schüttelt und nach oben mit dem vorderen Körper erreicht. Dieses Verhalten sollte wieder normal in ca. 3-4 Stunden und dann platzieren Sie die Maus wieder zu einem gemeinsamen Käfig.
4. Carprofen i.p für Analgesie und Auge Salbe an zwei aufeinanderfolgenden Tagen nach der Abrieb, ähnlich wie in den Schritten 2.2 zu verwalten. und 4.2.

(5) Bildgebung bei der Wundheilung

1. In diesem Protokoll weist Nutzungszeit 18 h und 72 h nach Abrieb, der Wundverschluss zu beobachten.
   1. Betäuben Sie für aufeinander folgende Aufnahmen die Mäuse wie unter 2.2 erläutert.
   2. Nehmen Sie Bilder, wie in 3 erläutert.
   3. Die Tiere mit Atipamezol i.p wachen Sie auf und überwachen Sie den Wake-up Zeitraum zu, wie in 4.3 erläutert.
      Hinweis: Wenn nicht weiter das Follow-up, einschläfern der Maus direkt nach 5.1.2. Sterbehilfe ist in 6.1 beschrieben.

(6) Hornhaut Sammlung und Paraffin einbetten

1. Hinter dem letzten Zeitpunkt das Tier zu opfern. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine Kammer, die mit CO₂gefüllt werden kann. Füllen Sie die Kammer Luft mit CO_2. Wenn das Tier unbeweglich ist, verrücken der Halswirbel durch Ziehen fest von der Schwanzwurzel und Halsbereiches gleichzeitig nach unten drücken.
   Achtung: Befolgen Sie die Richtlinien des lokalen Tierschutz Körpers.
2. Sammeln Sie die ganze Augapfel durch eine Öffnung in der Haut an der Seite des Auges mit Dissektion Schere schneiden. Legen Sie die Schere unter den Augapfel und Schneiden des okulären Nervs um den Augapfel aus der Umlaufbahn pop. Verwenden Sie Pinzette, wenn das Auge nicht leicht herauskommen.
   1. Machen Sie ein Loch auf der Rückseite des Auges auf der Netzhaut Seite mit einer 26G-Nadel zu Lösungen im Inneren des Auges frei eindringen.
      Hinweis: Lassen Sie nicht das Auge trocken, stattdessen werden, legen Sie es in PBS bis fort mit dem Protokoll.
3. Sammeln Sie den Augapfel in der 2-mL-Tube mit PBS. Unterbrochen Sie das Experiment nicht an dieser Stelle.
4. PBS zu entfernen und Augäpfel in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei + 4 ° C für 4-5 Stunden zu beheben.
5. Bewegen Sie den festen Augapfel zu einer Gewebe-Kassette für Gewebe Verarbeitung. Benutzen Sie ein Tuch Verarbeitung Maschine und das folgende Programm:
   1. Spülen mit PBS.
   2. Inkubieren Sie 2 x 45 min in 70 % igem Ethanol bei Raumtemperatur.
   3. Inkubieren Sie 2 x 1 h in 94 % Ethanol bei Raumtemperatur.
   4. Inkubieren Sie 3 x 45 min. in absoluten Ethanol bei Raumtemperatur.
   5. Inkubieren Sie 3 x 1 h in Xylol, bei Raumtemperatur und letzten Xylol bei 37 ° c
   6. Inkubieren Sie 3 x 1 h in Paraffinwachs bei 60 ° c
6. Betten Sie nach Gewebe Verarbeitung den Augapfel in flüssiges Paraffin (+ 60 ° C) mit einem Gewebe einbetten Block ein. Legen Sie das Auge innerhalb des Blocks, so dass es zur Seite schaut und die peripheren Grenze nach oben zeigt. Lassen Sie den Block auf einem kühlen Teller für ca. 5-10 Minuten zu festigen.

(7) Paraffin Abschnitte der Hornhaut

1. Bereiten Sie das Mikrotom für Schnitt gemäß den Anweisungen des Instituts oder des Herstellers.
   Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit scharfen Mikrotom Klinge.
2. Ort ein Wasserbad mit Raumtemperatur Reinstwasser neben Mikrotom und ein weiteres mit Reinstwasser beheizt bis + 50 ° C.
3. Machen Sie 5 µm dicke Schichten des Augapfels.
   Hinweis: Die Linse leicht bricht beim Schneiden. Um dies zu vermeiden, wischen Sie die Schnittfläche mit einem feuchten Tuch jedes Mal eine neue Reihe von Abschnitten gestartet wird. Verwenden Sie Leitungswasser, das Gewebe zu befeuchten.
4. Legen Sie die Abschnitte nebeneinander im Wasserbad Raumtemperatur und verschieben Sie sie dann in dem heißen Wasserbad mit Hilfe von einem Objektträger. Dehnen Sie die Abschnitte in dem heißen Wasserbad, bis alle Falten entspannen und die Abschnitte werden Matte.
5. Trocknen Sie die Glas-Objektträger mit Abschnitten über Nacht bei 37 ° C.
6. Folien zuordnen Sie in den Abschnitten, indem man die Folie für 1 Minute auf einer beheizten Platte bei + 60 ° C. Danach können bei + 4 ° C. die Abschnitte direkt zum Beizen, immunohistologische Methoden verarbeitet oder gespeichert werden

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt ein Modell, um eine Verletzung der Maus Hornhaut Abrieb zufügen und Lösungsvorschläge zu folgen und den Heilungsprozess nach Abrieb zu visualisieren. Vor kurzem haben wir diese Methode zur Untersuchung der Rolle von Hornhaut epithelialen Progenitorzellen bei Wundheilung⁶beschäftigt. Der Einsatz von etablierten Werkzeugen ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Abrieb-Experiment. Wir und andere haben den Algerbrush II okulären Grat...

Diskussion

Verwundung Methoden sind populäre Werkzeuge, verschiedene Aspekte der Hornhaut Homöostase und Pathologien zu studieren. Der Abrieb-Modell bietet eine gut kontrollierte Methode zur relevanten Probleme in der Augenheilkunde. Allerdings sind einige kritische Punkte im Protokoll hervorzuheben. Insbesondere die Details bezüglich der Veterinärmedizin, heilende Wunde Timeline und Ergebnis skizziert sind optimiert für den Einsatz mit fremd-NMRI und ICR-Aktien, aber können unter Stämme von Mäusen²⁶...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA