Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per infliggere un'abrasione sulla superficie oculare del mouse e a seguire da allora in poi il processo di cicatrizzazione. Il protocollo si avvale di un oculare burr parzialmente rimuovere l'epitelio di superficie dell'occhio nei topi anestetizzati.

Abstract

La cornea murina fornisce un eccellente modello per studiare la guarigione della ferita. La cornea è lo strato più esterno dell'occhio e così è la prima difesa per infortunio. Infatti, il tipo più comune di lesioni oculari trovati nella clinica è un'abrasione cornea. Qui, utilizziamo un oculare burr per indurre un'abrasione conseguente rimozione dello epitelio corneale in vivo sui topi anestetizzati. Questo metodo consente per rottura epiteliale mirata e riproducibile, lasciando altre aree intatte. In più, descriviamo la visualizzazione dell'epitelio abrasa con la macchiatura della fluorescina e fornire consigli concreti su come visualizzare la cornea abrasa. Quindi, seguiamo la linea temporale di guarigione delle ferite 0, 18 e 72 h dopo abrasione, fino a quando la ferita è re-epithelialized. Il modello di abrasione epiteliale della lesione corneale è ideale per gli studi sulla riepitelizzazione degli strati corneali, la migrazione e la proliferazione delle cellule epiteliali. Tuttavia, questo metodo non è ottimo per studiare l'attivazione stromal durante la guarigione delle ferite, perché la bava oculare non penetrano negli strati di cellule stromali. Questo metodo è anche adatto per applicazioni cliniche, ad esempio, i test pre-clinici di efficacia del farmaco.

Introduzione

Strati epiteliali di numerosi organi sono esposti alle lesioni. Tuttavia, essi contengono anche la capacità di compensare la perdita di tessuto attraverso la guarigione della ferita. La cornea offre un eccellente modello per studiare la guarigione della ferita. Forma la superficie esterna dell'occhio e fornisce uno strato protettivo per il macchinario di oculare sensibile. In tal modo, cornea funziona come una barriera fisica per gli agenti patogeni e perdita di acqua. Si compone di tre strati; epitelio, stroma ed endotelio. L'epitelio della cornea costituisce lo strato più esterno della cornea. Cellule epiteliali mantengono la funzione di barriera della cornea aderendo strettamente tra loro attraverso giunzioni strette^1,2,3. Una acellular della membrana dello scantinato cornea, membrana di Bowman, separa l'epitelio dallo stroma esteso, che contiene keratocytes refrattario. Sotto lo stroma, cellule endoteliali canale nutrienti, acqua e ossigeno allo strato superiore.

Abrasioni corneali sono molto comuni in clinica⁴. Lesioni alla cornea sono diverse, ma in gran parte sono causate da particelle piccole come polvere o sabbia, graffi o altri corpi estranei. Il protocollo qui descritto mira a riprodurre un tipo clinicamente rilevante di abrasione corneale epiteliale. In tal modo, questo protocollo fornisce un metodo controllabile e seminale per i medici e gli scienziati corneali implementare i propri studi. Abbiamo eseguito un test di riparazione del pregiudizio in vivo sulla cornea Murina da abrasione del tessuto con una bava oculare offuscato, il Algerbrush II. Qui, ci rivolgiamo l'abrasione solo all'epitelio cornea centrale e lasciare le altre parti dell'organo senza danni. Così, il protocollo è ideale per studio delle cellule epiteliali corneali dynamics o la membrana dello scantinato durante riepitelizzazione, cell migrazione, proliferazione e differenziamento in vivo⁵. Recentemente, questo modello è stato utilizzato per analizzare le dinamiche di cellule progenitrici nella cornea murina pure quanto a svelare la capacità delle cellule epiteliali corneale differenziate nel ristabilire la nicchia delle cellule staminali corneali dopo lesioni^6,7. Dopo abrasione, la cornea torna alla sua normale trasparenza e resistenza alla trazione. Interessante, uno studio in vitro hanno indicato che riepitelizzazione avviene senza cellula aumentata proliferazione⁸. Questo protocollo descrive la sequenza temporale di guarigione senza interruzioni nella cornea murina. Il metodo è così applicabile per testare l'effetto delle droghe sulla guarigione modelli e velocità.

La cornea è stato ampiamente utilizzata per studi di cicatrizzazione. Tuttavia, molti studi hanno fatto affidamento su altri modelli della ferita. Un modello ben consolidato della lesione corneale è l'ustione alcalina che viene eseguita mediante l'applicazione di idrossido di sodio (NaOH) con o senza filtro di carta sulla superficie corneale⁹. L'esposizione alcalina provoca una ferita grande e diffusa che colpisce non solo l'epitelio corneale, ma anche la congiuntiva e lo stroma^9,10. Soluzioni fortemente alcaline hanno dimostrati di indurre ulcere corneali, opacification e neovascolarizzazione⁹. Cellule infiammatorie invadono lo stroma in genere entro 6 ore e vi rimangono fino a 24 h¹¹. Così, la ferita alcalina è un metodo consigliabile negli studi relazionati all'attivazione stromal. Un altro tipo di ferita chimica può essere inflitto applicando solfossido dimetilico (DMSO) sulla cornea^9,10. Altri modelli di lesione comunemente usati includono ferite incisionale che penetrano attraverso le ferite keratectomy e stroma, che sono limitate alla parte superiore del stroma^14,15. Questi metodi sono anche utili per rispondere a domande riguardanti la guarigione della ferita stromal. Modelli di diverse lesioni hanno i loro vantaggi e svantaggi. Abrasione o sbrigliamento, dell'epitelio corneale è stato sviluppato utilizzando offuscati bisturi o lame su ex vivo cornee¹⁶. Questo metodo è stato successivamente utilizzato in vivo sul topo, ratto e coniglio^{17,18,19,20,21,22}. Utilizzando la bava oculare (Figura 1), togliamo solo un'area selezionata dell'epitelio, lasciando inalterato il resto dell'epitelio. In questo modo, è possibile indirizzare con precisione la rimozione epiteliale in diverse parti della cornea. Inoltre, la dimensione di abrasione è valutabile con la macchiatura della fluorescina. Inoltre, qui seguiamo chiusura abrasione durante il periodo di guarigione.

Questo metodo presenta diversi vantaggi, i) tra cui precisa posizione del sito di abrasione, che non è possibile con ferita chimica, ii) l'abrasione è veloce da eseguire, e iii) è non invasivo. Qui, descriviamo il metodo utilizzando il mouse NMRI nazionali come un modello, tuttavia questo potrebbe essere applicato per la vasta gamma di modelli genetici murini, così come per il ratto e coniglio, che sono comuni modelli usati per studiare la rottura cornea umana.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono approvati dal Consiglio nazionale esperimento sugli animali.

1. preparati

1. Tutte le soluzioni di preparare e tenere a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. Seguire le normative sullo smaltimento dei rifiuti per dispose utilizzato materiali e soluzioni.
2. Uso NMRI e ICR esogami scorte, fra 4-12 settimane di età e di entrambi i sessi. Se si utilizza il ceppo C57BL/6, seguire il metodo di preparazione di ketamina-medetomidina nel passaggio 1.3.2. Per altre fasi, seguire le istruzioni descritte in 1.3.3.-1.3.5.
3. Preparare la medicina veterinaria fresco e in tempo prima di iniziare l'operazione. Carprofen verrà utilizzato in seguito, quindi non è necessario prepararlo a questo punto.
   1. Per preparare una soluzione di ketamina-medetomidina per anestesia, mescolare 0,375 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di ketamina (Ketaminol Vet) con 0,25 mL (concentrazione di riserva 1 mg/mL) di medetomidina (Cepetor Vet) e aggiungere 1,25 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).
   2. Per preparare una soluzione più diluita di ketamina-medetomidina per anestesia su topi C57BL/6, mescolare 0,375 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di ketamina con 0,25 mL (concentrazione di riserva 1 mg/mL) di medetomidina e aggiungere 2,5 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (3,75 mg/kg, ketamina e 0,5 mg/kg, medetomidina).
      Nota: Questo è un passo alternativo, solo per topi C57BL/6 adulti.
   3. Per preparare buprenorfin per analgesia, aggiungere 0,1 mL (stock concentrazione 0,3 mg/mL) di buprenorfin a 1,9 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare il peso del mouse di 0,2 mL/20 g (0,15 mg/kg).
   4. Per preparare atipamezolo interrompendo l'anestesia, aggiungere 0,1 mL (concentrazione di riserva 5 mg/mL) di atipamezolo a 4,9 mL dello 0,9% NaCl. Amministrare il peso del mouse 0,15 mL/20 g (0,75 mg/kg).
   5. Per analgesia durante la post-anestesia utilizzare carprofen. Aggiungere 0,1 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di carprofen a 4,9 mL dello 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (7,5 mg/kg).
4. Preparare soluzione colorante fluorescente
   1. Per visualizzare l'abrasione sotto la luce blu cobalto (Figura 1), utilizzare una soluzione fluorescente. Preparare una soluzione di fluorescina di 0,1% di prima misura 10 mg di sale della fluorescina con una scala fine e quindi aggiungerlo a 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS).
   2. Proteggere la soluzione di fluorescina da luce e agitare per 5 minuti su un agitatore.
      Nota: La soluzione di fluorescina è sensibile alla luce; mantenere la soluzione coperta dalla luce. Questa soluzione può essere conservata a + 4 ° C per 2-3 giorni. Per l'uso, è utile posizionare la soluzione della fluorescina in una bottiglia contagocce che viene utilizzata per collirio. Utilizzare un filtro sterile-quando si sposta la soluzione per il flacone con contagocce.
5. Pulire la punta di burr oculare prima e dopo l'uso; prima con PBS e poi con 70% EtOH. Se effettua un'abrasione ai topi diversi durante la stessa operazione, eseguire le fasi di pulizia tra ogni mouse.
6. Mettere la piastra riscaldata su (+ 37 ° C) e posizionare un asciugamano di carta su di esso.

2. corneale abrasione

Attenzione: Utilizzare abiti protettivi (guanti, camice da laboratorio) quando movimentazione topi. Pesare il mouse per stimare il volume di farmaco da somministrare.

1. Utilizzare il metodo scruffing con una sola mano per gestire il mouse²³. Somministrare la miscela di ketamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) all'addome inferiore sinistra. Posizionare il mouse a una gabbia individuale e aspettare che si addormenti. Questo richiede in genere meno di 5 minuti. Quindi, amministrare buprenorfin prima e poi atipamezolo via i.p. iniezioni. Utilizzare la stessa tecnica di movimentazione.
   Nota: Una volta che l'anestesia è dato, il protocollo non dovrebbe essere sospesa in qualsiasi momento.
2. Prima di continuare, verificare che la piastra sia calda. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piastra riscaldata. Il livello di anestesia è buono se il riflesso di coda è assente, ma il riflesso di punta è presente. Controllare questi riflessi pizzicando la coda e qualsiasi punta con le dita o pinze. Non applicare una forza eccessiva. L'anestesia sarà di 20-25 minuti.
3. Per rendere un'abrasione, utilizzare la bava oculare pulita. Ruotare la base della bava per attivare la vibrazione che è essenziale per rendere l'abrasione. Sentite la vibrazione in mano, quando la bava sta funzionando correttamente.
   1. Aprire un occhio alla volta tenendo le palpebre separatamente con le dita. Quindi saldamente toccare la bava alla cornea e muoversi avanti e indietro anche lo strumento come lateralmente sulla superficie oculare. La vibrazione della bava si esibirà il gratta e Vinci; non premere, scuotere o strappare la cornea. Nella cornea centrale, 20 movimenti sulla superficie di abrasione sono sufficienti per indurre la ferita. Non sollevare la bava e cercare di rimanere nella regione di cornea per essere abrasa. L'acquisizione di un'abrasione dimensioni standard richiederà diversi giri di pratica.
   
   Nota: Asepsi corneale possono essere ottenuto prima all'abrasione utilizzando betadine soluzione oftalmica.

3. l'abrasione di imaging

1. Illuminare l'area abrasa utilizzando blu cobalto penna luce (Figura 1) e soluzione di fluorescina. La superficie oculare appare incolore in luce ambiente. Dopo l'applicazione della fluorescina, regione abrasa reagisce in verde quando illuminando l'occhio con la penna luminosa.
   1. Se necessario, aprire l'occhio abrasa similmente come 2.3 e amministrare una goccia della soluzione di fluorescina dal flacone con contagocce. Lavare l'occhio una volta con PBS o 0,9% NaCl per ridurre di fondo della fluoresceina. Utilizzare un contagocce o una pipetta per il lavaggio. Aspirare il liquido via con un panno morbido e pulire le ciglia, se necessario. Il liquido in eccesso si raccoglie solitamente al bordo nasale dell'occhio, vicino all'apertura del canale lacrima.
      Attenzione: Evitare di toccare la cornea mentre cleaining abrasioni minori potrebbero essere indotti.
2. Scattare foto dell'abrasione cornea.
   1. Per ottenere immagini simili durante ogni sessione di imaging, è possibile utilizzare strumenti di attacco costante per la luce di penna blu cobalto e la fotocamera reflex (Figura 2). Questo protocollo fornisce un programma di installazione che è facile da ripetere (Figura 2).
      1. Per collegare la penna illuminante e la fotocamera, utilizzare una lampada da tavolo con un braccio flessibile e morsetto e braccio regolabile per una telecamera con un morsetto, rispettivamente. Fascetta di penna ottica per la lampada da tavolo e la posizione appena sopra l'occhio del mouse. Posizionamento la luce in modo diverso potrebbe alterare la visualizzazione dell'abrasione. Un suggerimento per il posizionamento di questi strumenti è descritto nella Figura 2.
   2. Utilizzare la fotocamera reflex per scattare foto dell'occhio. Metti l'animale in una distanza desiderata e la posizione e la messa a fuoco della fotocamera (01:12) in luce ambiente. Dopo di che, chiudere tutte le altre luci tranne la luce di penna blu cobalto.
      Nota: L'impugnatura della penna luce del nastro verso il basso o utilizzare un elastico per tenere la luce accesa tutto il tempo durante la formazione immagine. Questo potrebbe aiutare se l'immagine diventa sfocata. È più semplice di eseguire il passaggio di imaging con un collega.

4. svegliarsi dopo abrasione corneale

1. Amministrare buprenorfin prima e poi atipamezolo via i.p. iniezioni. Utilizzare la stessa tecnica di movimentazione come in 2.1.
2. Mettere una goccia di unguento acido occhio fucidin antibatterico, (Isathal) agli occhi sia abrasi e non-raspato per idratare e mantenere la superficie oculare pulito da batteri dopo l'anestesia.
3. Come il mouse si sveglierà in 5-20 minuti sulla piastra riscaldata, osservare il mouse durante il periodo di risveglio post-anestetico. Quando diventa mobile, posto in una gabbia individuale.
   Nota: Se svegliarsi richiede più tempo, posizionare il mouse nella gabbia con un pad riscaldato o collocare l'intera gabbia sulla piastra riscaldata e monitorare regolarmente il mouse. Mentre l'anestesia svanisce, il mouse in genere scuote e raggiunge verso l'alto con il corpo anteriore. Questo comportamento dovrebbe tornare alla normalità in 3-4 ore e quindi è possibile inserire il mouse indietro per una gabbia condivisa.
4. Amministrare il carprofen i.p. per analgesia e occhio unguento per due giorni consecutivi dopo l'abrasione, similmente come in passaggi 2.2. e 4.2.

5. imaging durante la guarigione della ferita

1. In questo protocollo, tempo di utilizzo punti 18 e 72 h dopo abrasione ad osservare la chiusura della ferita.
   1. Per l'imaging consecutivi, anestetizzare i topi come spiegato al punto 2.2.
   2. Scattare foto come spiegato in 3.
   3. Sveglia gli animali con atipamezolo i.p. e monitorare il periodo di risveglio, come spiegato al punto 4.3.
      Nota: se non continuando il follow-up, eutanasia il mouse subito dopo 5.1.2. L'eutanasia è descritto in 6.1.

6. cornea insieme e inclusione in paraffina

1. Dopo l'ultimo punto di tempo, il sacrificio dell'animale. Posizionare il mouse in una camera che può essere riempita con CO₂. Riempiono l'aria di camera di CO_2. Quando l'animale è immobile, slogare vertebre cervicali tirando con forza dalla base della coda e premendo la regione del collo verso il basso allo stesso tempo.
   Attenzione: Seguire sempre le linee guida del corpo locale benessere degli animali.
2. Raccogliere l'intero bulbo oculare dal taglio di un'apertura nella pelle al lato dell'occhio con le forbici di dissezione. Mettere le forbici sotto il bulbo oculare e tagliare il nervo oculare per far comparire il bulbo oculare fuori orbita. Utilizzare pinze se l'occhio non esce facilmente.
   1. Fare un foro sulla parte posteriore dell'occhio, sul lato della retina, con un ago da 26G per consentire la penetrazione gratuito delle soluzioni all'interno dell'occhio.
      Nota: Non lasciare che l'occhio diventa secca, invece, posto in PBS fino continuando con il protocollo.
3. Raccogliere il bulbo oculare in una provetta da 2 mL con PBS. Non mettere in pausa l'esperimento a questo punto.
4. Rimuovere PBS e difficoltà bulbi oculari in paraformaldeide al 4% (PFA) a + 4 ° C per 4-5 ore.
5. Spostare il bulbo oculare fisso su una videocassetta di tessuto per l'elaborazione del tessuto. Utilizzare un tessuto lavorazione macchina e il seguente programma:
   1. Risciacquare con PBS.
   2. Incubare 2 x 45 min in etanolo al 70% a temperatura ambiente.
   3. Incubare 2 x 1 h in etanolo al 94% a temperatura ambiente.
   4. Incubare 3 x 45 min in etanolo assoluto a temperatura ambiente.
   5. Incubare 3 x 1 h in xilene, a temperatura ambiente e ultimo xilene a 37 ° C.
   6. Incubare 3 x 1 h in cera di paraffina a 60 ° C.
6. Dopo la lavorazione del tessuto, incorporare il bulbo oculare in paraffina liquida (+ 60 ° C) utilizzando un blocco di incorporamento del tessuto. Posto l'occhio all'interno del blocco in modo che esso sta osservando obliquamente e il bordo periferico è rivolto verso l'alto. Lasciate che il blocco solidificare su una piastra fredda per 5-10 minuti.

7. paraffina sezioni della Cornea

1. Preparare il microtomo per il sezionamento secondo le istruzioni dell'istituzione o del produttore.
   Attenzione: Fare attenzione a maneggiare la lama tagliente del microtomo.
2. Posto un bagnomaria con acqua ultrapura a temperatura ambiente al lato del microtomo e l'altra con acqua ultrapura riscaldata a + 50 ° C.
3. Fare 5 µm spessore sezioni del bulbo oculare.
   Nota: La lente si rompe facilmente durante il sezionamento. Per evitare questo, pulire la superficie di taglio con un tessuto umido ogni volta che viene avviata una nuova fila di sezioni. Usare acqua di rubinetto per inumidire il tessuto.
4. Inserire le sezioni accanto a altro nel bagno d'acqua temperatura ambiente e quindi spostarli la vasca di acqua calda con l'aiuto di un vetrino. Allungare le sezioni nel bagno acqua calda fino a quando tutte le pieghe e rilassarsi e il mascherino sezioni diventano.
5. Asciugare i vetrini con le sezioni durante la notte a + 37 ° C.
6. Collegare le sezioni per le diapositive tenendo il vetrino per 1 minuto su un piatto riscaldato a + 60 ° C. Dopo questo, le sezioni possono essere direttamente trattate per immunohistological metodi di colorazione, o conservate a + 4 ° C.

Risultati

Questo protocollo descrive un modello per infliggere un danno all'abrasione alla cornea del mouse e suggerisce come seguire e visualizzare il processo di guarigione dopo abrasione. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo delle cellule progenitrici epiteliali corneali durante⁶di cicatrizzazione. L'uso di strumenti consolidati è la chiave per un esperimento di successo all'abrasione. Noi ed altri, abbiamo utilizzato la bava oculare di Algerbr...

Discussione

Metodi di ferimento sono popolari strumenti per studiare diversi aspetti dell'omeostasi cornea e patologie. Il modello di abrasione offre un metodo ben controllato per risolvere problemi rilevanti in Oftalmologia. Tuttavia, alcuni punti critici nel protocollo sono la pena sottolineare. In particolare, i dettagli descritti per quanto riguarda la medicina veterinaria, timeline di guarigione della ferita ed il risultato sono ottimizzati per l'uso con le scorte nazionali di NMRI e ICR, ma possono variare tra i ceppi di topi<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA