A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.
שיטות הדמיה מבוססות-פלואורסצנטית, בשילוב עם התפתחויות במיקרוסקופיה קלה, יש מהפכה כיצד ביולוגים תא לנהל לימודי הדמיה של תאים חיים. שיטות זיהוי RNAs התרחבו מאוד מאז לימודי הזרע מקושרים לוקליזציה mRNA ספציפי לאתר לתקנות ביטוי גנים. תהליכי mRNA דינאמי יכול כעת להיות מדמיין באמצעות גישות המאתרות Mrna, בשילוב עם set-ups מיקרוסקופ כי הם מהירים מספיק כדי ללכוד את טווח דינמי של התנהגות מולקולרית. מסוגל לגילוי ישיר של תעתיקים. של התאים החיים משואות מולקולריות הן בצורת ראש, מנותת פנימי, יחיד-נוקלאוטיד להפלות בדיקה חומצות גרעין, אשר זרוח, רק על הכלאה לרצף יעד ייחודי. כאשר מצמידים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית מתקדם הדמיה ברזולוציה גבוהה, הם מאפשרים אחד לבצע מעקב מרחבי וזמני של תנועה תאיים של mRNAs. למרות טכנולוגיה זו היא השיטה היחידה המסוגלת לזהות תעתיקים אנדוגניים, ביולוגים תא עדיין לא חיבק באופן מלא בטכנולוגיה זו בשל קשיים בעיצוב בדיקות כאלה עבור הדמיה תא חי. יישום תוכנה חדש, Pinmol, מאפשר עיצוב משופר ומהיר של הגששים המתאימים ביותר לhybridize ביעילות אזורים היעד mrna בתוך תא חי. בנוסף, ברזולוציה גבוהה, רכישת תמונה בזמן אמת, הנוכחי, ניתוח תמונה קוד פתוח תוכנה לאפשר פלט נתונים מעודן, המוביל הערכה עדינה יותר של המורכבות הבסיסית של תהליכים דינמיים המעורבים במחזור החיים של mRNA.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף לעיצוב ושליחת משואות מולקולריות לתוך מלאנוזופרסטר תאי ביצה. הזיהוי וההדמיה הישירה והייחודית ביותר של מיקרו-האמדוגני מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ מסתובב הדיסק. נתוני הדמיה מעובדים ומנותח באמצעות זיהוי אובייקטים ומעקב בתוכנה קרח כדי לקבל פרטים על התנועה הדינמית של mRNAs, אשר מועברים ומקומי לאזורים מיוחדים בתוך oocyte.
ביולוגיה של התא מחקרים להמחיש אירועים דינמיים עם רזולוציה מרחבית וזמני התאפשרה על ידי פיתוח של טכניקות הדמיה של תאים בעלי מבוססי-זריחה חי. כיום, ב vivo mrna הדמיה מושגת באמצעות טכנולוגיות המבוססות על rna aptamer-חלבון אינטראקציות, רנ א aptamer אלף המושרה של צבעים אורגניים וחומצה גרעין בדיקה ריפוי1,2, 3. כולם מציעים שיעור גבוה, רגישות ויחס אות לרקע. עם זאת, הגישות במרכז RNA aptamer-ממורכז דורשות מניפולציה גנטית נרחבת, שם מתוכנן לבטא רנ א עם מוטיבים מבניים מלאכותיים הדרושים עבור חלבון או מחייב צבע אורגני. לדוגמה, מערכת MS2/MCP מחייבת את הביטוי המשותף של הרשת המביעה מבנה RNA המכיל מספר חזרות דו-מושביים של רצף הכריכה עבור החלבון בקטביאג MS2 מעיל (MCP), והצפנה נוספת של חלבון פלורסנט . התמזגו ל-MCP4,5 התוספת של מוטיבים מבניים כגון ל-RNA, יחד עם חלבון מתויג מגושם, העלה חששות כי תהליכי RNA הילידים עשויים להיות מושפעים6. טכנולוגיה המטפלת בדאגה זו ומציעה יתרונות ייחודיים נוספים היא הגישה המבוססת על חומצות גרעין, משואות מולקולריות (MBs). MBs לאפשר זיהוי מולטידוגני של החומרים האנדוגניים, אפליה של נוקלאוטיד יחיד וריאציות, ו קינטיקה מהירה של הכלאה עם mrnas המטרה7,8. ב-MBs משתנים בדיקה שנותרו בקיפול מכופף לפני שעברו שינוי של fluorogenic ברגע שהם hybridize ליעדים שלהם (איור 1C)9. מספר קבוצות הצליחו להשתמש ב-MBs כדי לזהות שניהם rnas שאינם קידוד (מיקרורונאס ו-lncrnas)10,11,12,13, RNA רטרווירוסים14 ו-DNA דינאמי-חלבון אינטראקציות15. הם כבר מועסק בהצלחה עבור הדמיה באורגניזמים שונים ורקמות, כגון עוברי דג העוברים16, נוירונים13, רקמות הגידול17, ההבחנה הקרדיוציטים18, סלמונלה . בן 19
כאן אנו מתארים את העיצוב, המסירה ואת הגישה לגילוי עבור mRNAs האנדוגניים בחיים D. מלאנוגסטר חדרי ביצה בשילוב עם הגדרת מיקרוסקופ מספיק מהר כדי ללכוד את טווח דינמי של הובלה מולקולרית פעיל. תא ביצת D. melanogaster שימש מערכת המודל האידיאלי מרובת תאים עבור מגוון רחב של מחקרים התפתחותיים, מ-germline מוקדם גזע התא וביטוי גנים אימהית לדור של הגוף מגזרי20, . עשריםואחד תאי ביצה מבודדים בקלות, גדול שקוף, ומסוגל לעמוד שעות של ניתוח vivo ex , מה שהופך אותם קל מאוד ניסויים הדמיה. עבודה רבה התמקדה לוקליזציה אסימטרית של תעתיקים אימהי לאזורים בדידים משנה דיסקרטית לפני שהוא מתורגם באופן פעיל. במיוחד, לוקליזציה של אוסקר mrna ואת התרגום העוקב שלה בקוטב האחורי של oocyte חייב להתרחש בצורה מוסדר היטב כדי למנוע העובר הקטלני בלאודל היום22. אוסקר mrna משועתק בתאים 15 germline, שנקרא תאים האחות, ומועברים באופן פעיל דרך גשרים cytoplasmic, קרא תעלות הטבעת, לתוך oocyte, התא germline הופך ביצה בוגרת מופרית בסופו של דבר (איור 1a ). כמות ניכרת של מידע זמין כבר לגבי גיוס דינמי וחילופי חלבונים של גורמי חלבון מ- אוסקר mrnp, יחד עם נסיעות הארוך שלה תאיים שלה, להפוך את אוסקר למועמד המועדף ללמוד תהליכים רבים של מחזור החיים mRNA. MBs כבר אינסטרומנטלי לחשוף פרטים על תהליך הלוקליזציה של mRNA ופענוח הרגולציה והתפקוד של גורמי חלבון השולטים בתחבורה mRNA במהלך Drosophila ילה oogenesis. במיוחד, על ידי מיקרו הזרקת MBs לתוך התאים האחות וביצוע ניסויים הדמיה תא חי, המעקב אחר mrnas מעקב אפשרי8,23.
מפת הדרכים המוצגת כאן מציעה את השלבים של תהליך שלם, החל בביצוע ניסוי הדמיה של תא חי באמצעות MBs, רכישת נתוני הדמיה, כדי לבצע ניתוח נתונים כדי לעקוב אחר mRNA אנדוגניים בסביבה הסלולרית הטבעית שלה. השלבים יכולים להיות שונה וממוטב נוסף כדי לענות על הצרכים של חוקרים לעבוד עם רקמות אחרות/סוגי תאים בתוך הגדרת המעבדה שלהם.
1. עיצוב של MBs לדימות תאים חיים
2. סינתזה של MB, טיהור ואפיון
3. חיתוך והכנת תאי ביצה בודדים עבור מיקרוהזרקה
4. הזרקה של MBs לתאי האחות של צ'יימברס ביצים
5. רכישת נתונים באמצעות דיסק מסתובב ההתקנה מיקרוסקופ מיקוד
הערה: ראה טבלת חומרים עבור הכיוונון הספציפי שלנו.
6. עיבוד, ניתוח נתונים לקבלת מידע מעקב ולוקליזציה, והכנת קבצי וידאו
באמצעות Pinmol, ניתן לתכנן מספר MBs עבור יעד mrna אחד (איור 1b-C). לאחר הסינתזה והטיהור, השימוש ב-MBs הנבחר מאופיין בניתוח חוץ-גופית.
איור 1: טכניקה ותיאור הרקמה עבור הדמ?...
ויזואליזציה בשידור חי של סחר הנשים האנסוגני ב- Drosophila ילה תאי ביצה מסתמך על שימוש ספציפי, יעיל, ו nuclease עמידים לשימוש, אשר כעת ניתן לתכנן בקלות עם תוכנת pinmol . MBs הם רגשים ספציפיים שנועדו לזהות רצפים ייחודיים בתוך mRNA היעד (רצוי אזורים ללא מבנה משני), מה שמאפשר זיהוי מאוד מוחלט של תעתיק. ?...
למחברים אין ניגוד אינטרסים לגלות.
אנו מודים סלווטורה A.E. Marras (מרכז מחקר בריאות הציבור, באוניברסיטת רטגרס) לסינתזה, תיוג וטיהור של משואות מולקולרית, דניאל St ג'ונסטון (מכון גורדון, אוניברסיטת קיימברידג ') עבור אוסקר-MS2/ מניות לטיסה. עבודה זו היתה נתמכת על ידי פרס לאומי של קרן המדע בשנת 1149738 ופרס צוות מקצועי לקונגרס-CUNY ל DPB.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved