АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для визуализации, обнаружения, анализа и отслеживания эндогенной торговли мРНК в живой дрозофилальной меланогастерской яичной камере с использованием молекулярных маяков, вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и анализа с открытым исходным кодом Программного обеспечения.

Аннотация

Методы визуализации на основе флуоресценции, в сочетании с разработками в области световой микроскопии, произвели революцию в том, как клеточные биологи проводят исследования живой визуализации клеток. Методы обнаружения РНК значительно расширились, так как семенные исследования связывали локализацию мРНК с регулированием экспрессии генов. Динамические процессы мРНК теперь могут быть визуализированы с помощью подходов, которые обнаруживают мРНК, в сочетании с микроскопией настройки, которые достаточно быстро, чтобы захватить динамический диапазон молекулярного поведения. Технология молекулярного маяка представляет собой подход, основанный на гибридизации, способный непосредственно обнаруживать эндогенные транскрипты в живых клетках. Молекулярные маяки - это шпильки, внутренне утопленные, однонуклеотидные дискриминирующих нуклеиновой кислоты зонды, которые флуоресцируют только при гибридизации в уникальную целевую последовательность. В сочетании с передовой флуоресценционной микроскопией и изображениями с высоким разрешением они позволяют выполнять пространственное и временное отслеживание внутриклеточного движения мРНК. Хотя эта технология является единственным методом, способным обнаруживать эндогенные транскрипты, клеточные биологи еще не полностью приняли эту технологию из-за трудностей в проектировании таких зондов для визуализации живых клеток. Новое программное приложение, PinMol, позволяет для расширения и быстрого проектирования зондов лучше всего подходит для эффективной гибридизации мРНК целевых регионов в живой клетке. Кроме того, высокое разрешение, приобретение изображений в реальном времени и текущее программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом позволяют проводить уточненные данные, что позволяет более точно оценить сложность динамических процессов, лежащих в жизненном цикле мРНК.

Здесь мы представляем всеобъемлющий протокол для проектирования и доставки молекулярных маяков в Дрозофила меланогастер яйцеклеток. Прямое и высокоспецифическое обнаружение и визуализация эндогенных материнских мРНК осуществляется с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Данные визуализации обрабатываются и анализируются с помощью обнаружения и отслеживания объектов в программном обеспечении Icy для получения подробной информации о динамическом движении мРНК, которые транспортируются и локализуются в специализированные регионы в пределах яйцеклетки.

Введение

Исследования клеточной биологии, которые визуализируют динамические события с пространственным и временным разрешением, стали возможными благодаря развитию методов визуализации живых клеток на основе флуоресценции. В настоящее время, in vivo мРНК визуализация достигается с помощью технологий, которые основаны на РНК aptamer-белковых взаимодействий, РНК аптамер индуцированной флуоресценции органических красителей и нуклеиновой кислоты зонд annealing1,2, 3. Все они предлагают высокую специфичность, чувствительность и соотношение сигнала к фону. Тем не менее, РНК aptamer-ориентированных подходов требуют обширных генетических манипуляций, где трансген инженерии, чтобы выразить РНК с искусственными структурными мотивами, которые необходимы для белка или органических связывания красителя. Например, система MS2/MCP требует совместного выражения трансгена, выражающего конструкцию РНК, содержащую несколько тандемных повторов связывающей последовательности для белка покрытия бактериофага MS2 (MCP), и другого трансгена, кодирующего флуоресцентный белок сливается с MCP4,5. Добавление таких вторичных структурных мотивов в РНК, наряду с громоздким флуоресцентно помечены белка, вызвало опасения, что родные процессы РНК могут быть затронуты6. Технология, которая решает эту проблему и предлагает дополнительные уникальные преимущества, это подход на основе нуклеиновой кислоты, молекулярные маяки (МБ). МБ позволяют мультиплексное обнаружение эндогенных мРНК, дискриминацию однонуклеотидных вариаций ибыструю кинетику гибридизации с целевой мРНК 7,8. МБ являются олигонуклеотидных зондов, которые остаются в утоленной шпильки раза до прохождения фторгенных конформационных изменений, как только они гибридизируются к своим целям (Рисунок 1C)9. Несколько групп имели успех в использовании МБ для обнаружения как некодирующих РНК (микроРНК и lncRNAs)10,11,12,13, РНК ретровирусов14 и динамических ДНК-белков взаимодействия15. Они были успешно использованы для визуализации в различных организмах и тканях, таких как эмбрионы зебры16, нейроны13, опухолевая ткань17, дифференциационирование кардиомиоцитов18, и сальмонеллы 19.

Здесь мы описываем дизайн, доставка и обнаружение подход для эндогенных мРНК в жизни D. melanogaster яичные камеры в сочетании с микроскопией настройки, которая достаточно быстро, чтобы захватить динамический диапазон активного молекулярного транспорта. D. melanogaster яичная камера служила в качестве идеальной многоклеточной модели системы для широкого спектра исследований в области развития, от раннего зародышевой деления стволовых клеток и выражение материнского гена к поколению сегментарного плана тела20, 21. Яичные камеры легко изолированы, большие и полупрозрачные, и способны выдерживать часы анализа ex vivo, что делает их высоко поддаются воображению экспериментов. До активного перевода была проработана большая работа по асимметричной локализации материнских стенограмм в отдельные субклеточные области. В частности, локализация Оскарм мРНК и его последующий перевод на задний полюс ооцита должны происходить в строго регламентированной манере, чтобы избежать смертельного бидаудального эмбриона фенотипа22. Оскар мРНК транскрибируется в 15 зародышевых клеток, называемых клетками медсестры, и активно транспортируется через цитоплазмамические мосты, называемые кольцевыми каналами, в яйцеклетку, зародышевую клетку, которая становится зрелой яйцеклеткой и в конечном счете оплодотворяется (Рисунок 1A ). Значительный объем информации, уже имеющейся в отношении динамичного набора и обмена белковыми факторами и из Oskar mRNP, наряду с его дальними внутриклеточными поездками, делает Оскара предпочтительным кандидатом на учебу многие процессы жизненного цикла мРНК. МБ сыграли важную роль в раскрытии деталей о процессе локализации мРНК и расшифровке регуляции и функции белковых факторов, контролирующих перенос мРНК во время дрозофилы oogenesis. В частности, путем микроинъекцииЯ МБ в клетки медсестры и выполнения экспериментовпо визуализации живых клеток, отслеживание эндогенных мРНК возможно 8,23.

Представленная здесь дорожная карта предлагает шаги полного процесса, от проведения эксперимента по визуализации живых клеток с использованием МБ, получения данных изображений, до проведения анализа данных для отслеживания эндогенной мРНК в своей родной клеточной среде. Шаги могут быть изменены и дополнительно оптимизированы для удовлетворения потребностей исследователей, работающих с другими типами тканей/клеток в их собственной лабораторной обстановке.

протокол

1. Дизайн МБ для визуализации живых клеток

  1. Сложите целевую последовательность РНК, чтобы предсказать вторичную структуру цели mRNA, используя "форму РНК" с сервера mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. Вставьте/загрузите целевую последовательность в формате FASTA, выберите 5 или 10% субоптимальность (структуры со свободной энергией складывания в пределах 5 или 10% от значения MFE, соответственно), и отрегулируйте максимальное количество вычисленных складных соответственно (например, больше на 10% субоптимальность).
      Примечание: Включение неоптимальных вторичных структур при проектировании МБ позволяет идентифицировать регионы в пределах целевой мРНК, которые могут быть более гибкими или более жесткими, чем прогнозировалось только для минимальной структуры свободной энергии (MFE), что улучшает общий дизайн МБ подходит для визуализации живых клеток.
    2. Выберите "немедленную работу" для целей mRNA в 800 нуклеотидов (nt), или "пакетную работу" для мРНК длиной от 801 до 8000 nt. Сохранить файл "ss-count" в виде простого текстового файла.
  2. Используйте файл "ss-count", полученный в шаге 1.1 в качестве ввода для программы PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) с желаемыми параметрами, для разработки нескольких МБ для цели mRNA (см. учебники, описывающие использование программы PinMol (см. 24 в https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
    1. Определить специфику выбранных МБ, выполнив анализ BLAST: используйте "blastn" с соответствующей базой данных (например, для Oskar mRNA-специфических МБ использовать "refseq-rna" базы данных и drosophila melanogaster организма).
    2. Определите любое тканево-специфическое выражение цели мРНК (например, для Oskar mRNA Flybase) gt; Данные высокой пропускной выражаемой экспрессии; FlyAtlas Анатомия Microarray или modENCODE Анатомия RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) и сравните с любые положительные удары BLAST. Устранить зонды, которые показывают, что кросс-гомология с другими мРНК, которые также выражаются в ткани / клетки интерес.
  3. Выберите флюорофор и уточённую пару, подходящую для настройки микроскопии, доступной для выполнения визуализации живых клеток (например, Cy5/BH-2)25.

2. МБ Синтез, Очищение и характеристика

  1. Используйте внутренний синтез и очистку, как уже описано ранее7, или услуги от коммерческих поставщиков, синтезировать и очищать от одного до пяти МБ (см. выше примечание), используя следующую схему маркировки: »5'(Флурофор)-(C3 или C6 linker)-(2'-O -метил МБ последовательность)-(Квенчер)3'. Очистите МБ с помощью HPLC обратной фазы, в доме или с помощью услуг коммерческого поставщика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфорамидиты, используемые для автоматического синтезазонда, должны иметь модификацию 2'- O-метил рибонуклеотида. Можно также использовать химеры чередующейся заблокированно-нуклеиновой кислоты(LNA) и 2'- O-метил модификации для повышения стабильности гибрида между более коротким МБ и его целевой мРНК26.
  2. Синтезировать днк олигонуклеотиды, которые соответствуют последовательности целевой области РНК и, таким образом, дополняют область зонда МБ, для использования в характеристике in vitro (см. шаги 2,3 до 2,5; выше примечание). Увеличьте гибридизацию МБ с мимикой ДНК-олигонуклеотид, включив на каждый конец ДНК четыре дополнительных нуклеотида, как это было найдено в последовательности мРНК.
    Примечание: Более строгая характеристика эффективности МБ для обнаружения целевой последовательности может быть выполнена с помощью in vitro синтезированных целей РНК вместо дополнительных олигонуклеотидов ДНК8.
  3. Выполните термическую денатурацию МБ в одиночку, измерить его температуру плавления (Tm), и подтвердить, что МБ принимает желаемую форму шпильки при физиологической температуре. Мы наблюдали значения Tm между 60 и 90 градусами По Цельсию.
  4. Выполните термическую денатурацию МБ в присутствии цели олигонуклеотида ДНК и измерьте TM-гибрид мишени MB:DNA, как ранее описано7. Для гибрида MB:DNA желательно тм от 55 до 60 градусов по Цельсию.
  5. Выполните реакции гибридизации в пробирке с соответствующей целью олигонуклеотида ДНК и определите эффективность формирования гибрида МБ:ДНК при физиологической температуре, как ранее описано7. Быстрая кинетика гибридизации с мимикой мимики МИМит мимики ДНА желательно, однако МБ, которые не показывают высокую эффективность гибридизации с целями ДНК, могут иметь лучшую производительность с целевой мРНК in vitro и/или in vivo.

3. Рассечение и подготовка отдельных яичных камер для микроинъекции

  1. Кормите недавно вылупившихся, спаренных самок в течение 2-3 дней свежей дрожжевой пастой.
  2. Анестезия мух на КО2 площадку и, используя штраф пинцет (Dumont #5), передача 1-2 женщин в каплю галоуглеродного масла 700 на стеклянной крышке скольжения.
  3. Используя пару пинцетов, ориентируйте муху с помощью псовой стороны вверх под стереомикроскоп. Вскрыть женский живот, сделав небольшой разрез на задней части и осторожно сжать пару яичников в масло.
  4. Выдяните яичники на масляную каплю на новом облике. Аккуратно держите один яичников с одним пинцетом, щипать самые молодые этапы овариола с другим пинцетом. Оскар мРНК активно локализуется при и после середины oogenesis (этапы no gt; 7), и молодые яичные камеры (этапы злт; 7) труднее вводить и не выжить до тех пор. Медленно перетащите крышку скольжения (с нисходящим движением) до тех пор, пока отдельные овариолы или яичные камеры не будут изолированы и выровнены вертикально. Далее отдельные камеры одного яйца, вытесняя нежелательные этапы из цепи яйцеклеток овариола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что индивидуально дразнили яичные камеры не плавают в масле, и что они придерживаются крышки скольжения. Это важно как для успешной микроинъекции, так и для приобретения изображения.

4. Микроинъекция МБ в клетки медсестры яичных камер

  1. Подготовьте раствор MB, используя один молекулярный маяк (например, osk2216Cy5), или смесь из двух МБ, которые нацелены на различные мРНК и которые помечены спектрально различными флюорофорами (например, osk2216Cy5 и drongo1111Cy3). Используйте концентрацию 200-300 нг/Л каждый МБ в HybBuffer (50 мм Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 мМ MgCl2 и 100 мм NaCl). Для коктейля из четырех МБ с маркировкой с тем же флюорофором, которые ориентированы на тот же мРНК на 200 нг / Л каждый в HybBuffer (например, osk82, osk1236, osk2216). Спин вниз раствор МБ непосредственно перед загрузкой иглы для микроинъекции.
  2. Выберите цель. 40x цель масла рекомендуется для поиска соответствующей яичной камеры и для выполнения микроинъекций.
  3. Установите coverslip с расчлененной яичной камерой на сцену микроскопа. Доведите цель в фокус-позиции и определить яичную камеру на стадии развития в середине-поздней стадии развития, которая правильно ориентирована на микроинъекцию (т.е., с оси АЗП перпендикулярно кончику иглы, чтобы обеспечить легкое впрыск в медсестре клеток проксимальным к яйцеклетке).
  4. Загрузите иглу (коммерческую или подготовленную в доме 27)раствором No1 ЛМ (см. шаг 4.1) и подключите ее к микроинжектору. Для микроинъекций в яичных камерах D. melanogaster сориентируйте иглу (см. Таблицу Материалов) под углом (lt;45) на стадию микроскопа (например, 30 градусов), чтобы избежать прокалывания нескольких клеток медсестры.
  5. Настройка инжектора с давлением инъекций 500-1000 hPa и компенсационное давление 100-250 hPa (см. Таблицаматериалов).
  6. Медленно двигайте этап для того чтобы принести в поле взгляда зону падения масла пустоты камер яичка.
  7. Используя джойстик микроманипулятора, аккуратно опустите иглу в падение масла и довести его кончик в фокусе к периферии поля зрения.
  8. Выполните "чистую" функцию, чтобы удалить воздух с кончика иглы и обеспечить, чтобы есть поток от иглы.
  9. Принесите иглу в домашнем положении и сосредоточиться на яичной камере, чтобы быть микровводили, а затем принести иглу обратно в фокус и положение его вблизи края яичной камеры.
  10. Выполните тонкую регулировку положения цели так, что мембрана, отделяющая клетки фолликула от клеток медсестры находится в фокусе.
  11. Вставьте иглу в камеру медсестры и выполните инъекцию в течение 2-5 с.
  12. Аккуратно снимите иглу и вретите ее в домашнюю позицию.
  13. Измените цель на желаемое увеличение для приобретения изображения (60-63x или 100x), сосредоточьтесь на яичной камере и начните приобретение.

5. Приобретение данных с помощью вращающегося диска Конфокальный микроскоп настройки

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу материалов для нашей конкретной настройки.

  1. Настройка протокола приобретения для записи стекx XY-Ct 8-16-битных изображений (XY) объем, C q канал, т время).
  2. Выберите лазерные линии для нужных каналов (например, 641 нм лазер для Cy5 и 491 нм для GFP) и приобретите каналы последовательно: сначала сигнал флуоресценции в каждом канале, а затем измените положение в диапазоне, чтобы обеспечить надлежащий анализ колокализации.
  3. Выберите шаг «Я» (например, 0,3 мкм), а также верхние и нижние пределы (например, от -2 мкм до 2 мкм).
  4. Ввод времени приобретения и частоты выборки (например, каждые 15-30 с до 1 ч).
  5. Инициировать приобретение.

6. Обработка, анализ данных для получения информации о отслеживании и локализации и подготовка видеофайлов

  1. Обработка изображений
    1. Скачать, распаковать и открыть Icy, открытая платформа сообщества для биоизображений информатики (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Откройте стек XY'Ct, приобретенный в шаге 5: Изображение/Последовательность
    3. Преобразуйте стек в ImageJ: ImageJ'gt; Инструменты и преобразование в IJ, имеют отдельный режим ON.
    4. Сделать подстек (выбор ряда шагов и временных точек для дальнейшего анализа): ImageJ 'gt;Image'gt;Stacks'gt;Tools'gt;Make Substack...; выберите нужные каналы, шаги и временные точки.
    5. Сохранить подстек, как файл TIFF: ImageJ 'gt;File использовать этот файл для последующих шагов.
    6. Сплит-каналы: ImageJ-gt;Image.gt;Color
    7. Вычесть фон либо с помощью фонового стека: ImageJ 'gt;Process'gt;Image Калькулятор ..., или с помощью опции Rolling ball: ImageJ'gt;Process;gt;Вычтите фон ..., выберите радиус Rolling ball. Предварительный просмотр изображения для выбранного радиуса перед выбором "Accept".
      Примечание: Фоновый сигнал будет в основном возникать из-за неправильного закалки флорофора. Сигнал:фоновое соотношение (S:B) часто используется в качестве индикатора для "яркости" МБ, и он измеряется из экспериментов гибридизации in vitro олигонуклеотида цели. Например, MBs osk1236 и osk2216 имеют S:B 81 и 120 евро соответственно.
    8. Отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала: ImageJ'gt;Image.gt;Отрегулируйте gt;Яркость/Контраст, выберите Применить.
    9. Сохранить каждый канал в качестве отдельного файла TIFF: ImageJ йgt;File
    10. Слияние двух каналов: ImageJ 'gt;Image выберите каналы. Сохранить новый стек в качестве нового файла TIFF (см. шаг 6.1.8).
  2. Обнаружение и отслеживание точек
    1. Конвертировать обратно в Ледяной: ImageJ 'gt;Tools'gt;Преобразование в Icy.
    2. Шкала бар автоматически накладывается на стек при преобразовании в Icy, если плагин бар масштаба установлен "Поиск с помощью Плагинов";Setup .gt;Online плагин". При необходимости, отодвите панель масштаба через окно Инспектора (правая сторона экрана);Layer tab'gt;Name'gt;Scale bar.
    3. Deselect/inactivate значок «глаз» для панели шкалы от вкладки слоя»gt;Name для того чтобы извлечь адвокатуру маштаба от первоначально стека. Он может быть активирован в окончательном стеке.
    4. Сохранить недавно обработанный стек, взяв скриншот с помощью "камера" значок из меню панели изображения окна, "Возьмите скриншот текущего зрения" и файла и gt;Сохранить как
    5. Определите чувствительность к пятнам, если параметры чувствительности пятна уже определены движение на шаг 6.2.7.
    6. Обнаружение пятен: выберите окно с изображением или стеком для анализа, Обнаружение и отслеживание и отслеживание и детектор обнаружения, и заполнить параметры параметров настройки:
      1. Для ввода выберите "текущийпоследовательностьОбнаружения ввода" (по умолчанию).
      2. Для предварительной обработки выберите "Канал 0" (по умолчанию) или нужный канал, перекрестно ездя в окне инспектора, - это секвенирование.
      3. Для детектора выберите "Обнаружить яркое пятно на темном фоне;" использовать "Принудительное использование 2D Wavelets для 3D" только в том случае, если в стеках недостаточно срезов для выполнения анализа. Выберите "Масштаб(ы)" и "Чувствительность" для каждой шкалы (добавить больше весов для больших пятен). Шкала и чувствительность (чем больше число более чувствительным является обнаружение, максимум 140 предлагается Icy) являются проб и ошибок переменных, которые должны быть визуально проверены после и решил.
      4. Для региона интересов используйте "ROIfromSequence" (по умолчанию).
      5. Для фильтрации используйте "NoFiltering" (по умолчанию) или выберите "SizeFiltering" для определения "Диапазон принятых объектов (в пикселях)".
      6. Выход: выберите настройку выхода XLS или XML (выберите формат XML при использовании 2007 MS Excel или раньше, и есть 65 000 пятен). Если результаты точечного детектора используются для анализа слежения, также выберите "Экспорт в SwimmingPool".
      7. Повторяйте обнаружение пятен с использованием различных значений масштаба/чувствительности до тех пор, пока не будут обнаружены все или большинство пятен. Запись всех окончательных параметров.
      8. Для анализа колокализации повторное обнаружение точек для другого канала.
    7. Чтобы отслеживать пятна, выберите Обнаружение и отслеживание и отслеживание и отслеживание и слежение»;Spot Tracking»gt;Run The Spot Detector с параметрами от шага 6.2.6., или используйте меню «Выберите результаты обнаружения здесь», чтобы выбрать существующий набор данных (для этого держите окно Spot Detector открыть с шага 6.2.5). Нажмите кнопку "Оценка параметров" и выберите желаемое целевое движение в всплывающем окне оценки параметров (например, "является как диффузионным, так и направленным"). Нажмите кнопку "Бег отслеживания".
    8. Повторите обнаружение и отслеживание пятен для других каналов при отслеживании пятен многоканальных стеков, следующие шаги 6.2.6 и 6.2.7, начиная со стека, генерируемого с шага 6.2.7.
    9. Чтобы визуализировать треки, выберите Обнаружение и отслеживание и отслеживание и отслеживания и менеджера трека - это окно открывается автоматически после завершения отслеживания перспективе. Для "Color Track Processor" выберите "Включить" и выберите желаемое представление цвета для треков. Соответствующие процессоры трека могут быть доступны через "добавить трек процессор ..." выдвижное меню (например, выберите "Track Processor Time Clip", включите окно "Track Clipper" и выберите нужное количество обнаружений, которые будут отображаться до и после текущего момента).
    10. Сохранить треки информации, как XML трек файл: Обнаружение и отслеживания и отслеживания и отслеживания и отслеживания и менеджера по слежению и г.ит;Файл
    11. Сохранить результаты, сняв скриншот с помощью значка "камера" из панели меню Image Window, "Возьмите скриншот текущего представления". Скриншоты могут быть сделаны с обнаруженными пятнами и / или треки просто активировать / деактивации соответствующего значка глаз (ы) найти в окно инспектора »gt;Layer tab'gt;Name
    12. Установите плагин TimeStamp Overlay: Плагины и плагин;Setup'gt;Онлайн плагин »gt;TimeStamp Наложение;gt;Install.
    13. Добавить метку времени: Плагины и gt;TimeStamp Наложение (Новый). Следуйте инструкциям на всплывающем окне (нижний правый угол экрана) для направления по размещению и форматированию отметки времени. Интервал времени может быть добавлен/изменен в окне инспектора,gt;Последовательность вкладке »gt;Последовательность Свойства »gt;Edit.
    14. Сохранить результаты, сняв еще один скриншот. Сохранить изображение как 1) формат Tiff и 2) как формат AVI; для формата AVI сначала преобразовать в Рендеринг RGB (Изображение/Последовательность»gt;Rendering»gt;RGB изображение).
    15. Поверните изображение к желаемой ориентации: Окно инспектора»gt;Последовательность табу»gt;Canvas»gt;Rotation.
    16. Сохранить вращаеемый образ с помощью "Возьмите скриншот текущего представления". Убедитесь, что значок "глаз" для панели масштаба будет отбираться, так как он также будет вращаться вместе с изображением.
    17. Выберите и обрезать рентабельность: выберите Регион Интереса»;2D ROI-gt;Выбрать форму рентабельности инвестиций, а затем создать / нарисовать рентабельность на изображении; Изображение/Последовательность»-gt;Plane (XY)gt;Быстрый урожай.
  3. Анализ колокализации
    1. Подготовка протокола колокализации; несколько примеров приведены на веб-сайте Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (см. Дополнительные материалы).
    2. Протокол колокализации нагрузки: Инструменты»gt;Scripting-gt;Протоколы и регулировка параметров в взаимодействующих блоках (например, в параметрах использования блока «Wavelet Spot Detecting», определяемых в шаге 6.2.6.).
    3. Измерьте размер частицы в пикселях, определите расстояние колокализации и введите ее в блок "Colocalizer" как "Макс расстояние".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер частицы в пикселях зависит от системы обнаружения. Чтобы измерить размер, увеличьте масштаб одной частицы и вручную подсчитайте пиксели, которые охватывают ширину сигнала поперек. Среднее измерение по крайней мере трех частиц. Максимальное расстояние, которое необходимо установить для колокализации, это размер частицы в пикселях (это представляет собой максимальную сумму радиуса двух трогательных частиц).
    4. При желании выберите один или несколько ROIs для анализа колокализации: Регион интересов»gt;2D ROI-gt;Выберите форму рентабельности инвестиций»gt;Нарисуйте roI на изображении.
    5. Урожай рентабельности (ы): Изображение / Последовательность »gt;Plane (XY)gt;Быстрый урожай.
    6. Выполните колокализацию: Окно редактора протоколов,gt;Выбранный вкладка протокола.gt;Run. Окончательный блок в окне редактора Протоколов будет содержать общий процент колокализации, основанный на обнаружении точек, в то время как информация в каждый момент времени может быть найдена во окне Инспектора.
    7. Отслеживайте колокализованные и одиночные частицы, следуя шагу 6.2.7 (пятна).
    8. Сохранить, как описано в шаге 6.2.16.

Результаты

Используя PinMol,несколько МБ могут быть разработаны для одной цели мРНК (рисунок1B-C). После синтеза и очистки, выбранные МБ характеризуются и сравниваются с помощью анализа in vitro.

Обсуждение

Восновенизация эндогенной мРНК в яичных камерах Drosophila опирается на использование специфических, эффективных и устойчивых к нуклеаде МБ, которые теперь могут быть легко разработаны с помощью программного обеспечения PinMol. МБ представляют собой специфические зонды, предназна?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Сальваторе А.Е. Маррас (Центр Научно-исследовательского института общественного здравоохранения, Ратгерский университет) за синтез, маркировку и очищение молекулярных маяков, а Даниэля Сент-Джонстона (Гурдонский институт, Кембриджский университет) за оскар-MS2/ McP-GFP трансгенных мухи запасов. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом CAREER Award 1149738 и премией Конгресса профессионального персонала-CUNY Для DPB.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
SpectrofluorometerFluoromax-4 Horiba-Jobin Yvonn/aPhoton counting spectrofluorometer
Quartz cuvetteFireflysci (former Precision Cells Inc.)701MFL
Dumont #5 tweezerWorld Precision Instruments501985Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898
Cover slip No.1 22 x 40mmVWR48393-048
Dissecting microscopeLeica MZ6 Leica Microsystems Inc.n/a
CO2 fruit fly anesthesia padGenesee Scienific59-114
Tris-HCL pH7.5Sigma-Aldrich1185-53-1
Magnesium chlorideSigma-Aldrich7791-18-6
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Spinning disc confocal microscopeLeica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD cameraHamamatsun/a
PatchMan NP 2 MicromanipulatorEppendorf Inc.920000037
FemtoJet MicroinjectorEppendorf Inc.920010504
Injection needle: Femtotips IIEppendorf Inc.930000043
Loading tip: 20ul MicroloaderEppendorf Inc.930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mmVWR48393-026; 48393-172
Dry yeastAny grocery storen/a
Computer, > 20 GB RAMAlthough processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

Ссылки

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

148Drosophila melanogaster

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены