הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה לטהר מהכלורופלסט ללא פגע מן העלים תודרנית שלהם שלוש הראשי תת התאים (מעטפה, משתית, thylakoids), באמצעות שילוב של centrifugations דיפרנציאלית, מעברי צבע, Percoll רציף, מעברי צבע סוכרוז מקוטע. השיטה היא יקר עבור subplastidial ולוקליזציה subcellular של חלבונים על-ידי immunoblotting פרוטאומיקס.

Abstract

מהכלורופלסט הם המרכיבים העיקריים של תאי צמחים. Plastids כזה למלא פונקציות מכריע רבות כגון הטמעת פחמן, גופרית, חנקן, כמו גם סינתזה של מטבוליטים חיוני. Organelles אלה מורכבות של הבאים שלושה מפתחות המשנה התאים. המעטפה, המאופיינת על ידי שתי ממברנות המקיף את אברון ושולט על התקשורת של פלסטידה עם תאים תאים אחרים. Stroma הוא השלב מסיסים של כלורופלסט, האתר המרכזי שבו פחמן דו-חמצני מומר פחמימות. קרום תילקואיד היא הרשת קרום פנימי המורכב grana (שקי דחוס שטוח) ומניחים lamellae (מבנים צפופים פחות), בו פוטוסינתזה oxygenic לוקח. בפרוטוקול הנוכחי מתאר צעד אחר צעד הליכים הדרושים עבור הטיהור, באמצעות centrifugations דיפרנציאלית ומעברי Percoll, של מהכלורופלסט שלם מתוך תודרניתולאחר fractionation שלהם, באמצעות מעברי צבע סוכרוז, ב-3 תאים תת (קרי, מעטפה, משתית ו thylakoids). פרוטוקול זה גם מתן הוראות כיצד להעריך את הטוהר של השברים האלה באמצעות סמנים משויך התאים כלורופלסט תת השונים. השיטה המתוארת כאן יקר, עבור subplastidial לוקליזציה של חלבונים באמצעות immunoblotting, אלא גם עבור subcellular ו- subplastidial פרוטאומיקס, מחקרים אחרים.

Introduction

מהכלורופלסט הם המרכיבים העיקריים של תאי צמחים. הם שואבים אב קדמון cyanobacterial יש מיתוג של endosymbiosis, בסופו של דבר התפתח כמו אברון במהלך האבולוציה^1,2. Organelles כאלה מכילים שלושה ראשי מדורים (איור 1). מערכת מעטפה עשויה הפנימית של וממברנות החיצוני המקיף את אברון. מערכת זו קרום כפול מכיל אנזימים שונים המעורבים במטבוליזם של שומנים, פיגמנטים, והוא בעיקר המוקדש השליטה של התקשורת בין plastids את ציטוזול. הוא מכיל מערכות תחבורה שונים המאפשרים היבוא של חלבונים גרעיניים מקודד ולאחר החלפת יונים ו מטבוליטים בין את ציטוזול של כלורופלסט במטרה לווסת פונקציות מטבוליות חיוניות של הצמח תא^3,4 . Stroma, השלב מסיסים כלורופלסט, מכיל אנזימים של מחזור קלווין (CO₂ התבוללות), הסינתזה של מטבוליטים שונים כולל חומצות אמינו, ויטמינים של machineries תמלול ותרגום של פלסטידה. קרום תילקואיד היא רשת קרום פנימי נרחב מאורגנות שם מתקיים שלב אור של פוטוסינתזה. ובכך, מהכלורופלסט הם המקום שבו מסלולים מטבוליים חיוניים להתרחש⁵.

כדי לפענח את מנגנוני הרגולציה חדשים הקובעות את הדינמיקה כלורופלסט, פיזיולוגיה, הגדרת לוקליזציה תת-plastidial של כלורופלסט חלבונים ולכן קריטי כדי לתמוך יישוב מחקרים במטרה להבין טוב יותר את פונקציות חלבונים מודל אורגניזמים⁶. על מנת לקבל גישה לוקליזציה subplastidial מקורית של חלבונים אלה, ולכן חיוני כדי להתחיל שברים subplastidial מאוד טהור (מעטפה ממברנות stroma, thylakoids). בהקשר זה, מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לטהר מהכלורופלסט ללא פגע מן העלים תודרנית שימוש דיפרנציאלי centrifugations ומעברי Percoll רציף, וכדי fractionate אותם באמצעות מעברי צבע סוכרוז מקוטע, ב-3 תאים תת (קרי, מעטפה, משתית ו thylakoids). השיטה המתוארת כאן גם מספק הוראות כדי להעריך את טוהר מטוהרים שברים תת-אבחון באמצעות סמנים משויך התאים כלורופלסט תת השונים. פרוטוקול זה יקר, עבור subplastidial לוקליזציה של חלבונים באמצעות immunoblotting ועבור ניתוח נוסף של שברים מטוהרים באמצעות ספקטרומטר מסה (MS)-המבוסס על מחקרים פרוטיאומיה מבנית.

Protocol

1. הכנת מאגרי, פתרונות מניות ומילויים הדרגתיים

1. להכין הפתרונות המניות הבא ניתן לאחסן 6 חודשים ב 4 º C.
   1. להכין 1 ליטר של מאגר Tricine (1 מ', pH 8.4) ומאגר Tricine (1 מ', pH 7.6). להתאים את ה-pH על-ידי הוספת קו כדורי.
   2. להכין 1 ליטר של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA, 0.5 M, pH 8) 3-(N-morpholino) פרופן sulfonic חומצה (MOPS) מאגר (1 מ', pH 7.8). להתאים את ה-pH על-ידי הוספת כדורי NaOH.
   3. להכין 50 מ של MgCl₂ (1 מ').
   4. הכנת 50 מ של פרוטאז מעכבי פתרונות: phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF להגדיר באלכוהול איזופרופיל, 100 מ מ), benzamidine הידרוכלוריד הידרוקסיד (100 מ מ), ו- caproic חדוה אמינו חומצה (50 מ מ).
      הערה: בעוד PMSF וחומצה caproic אמינו הם יציבים בתמיסה למשך חודשים 4 ° C, benzamidine פתרון צריך להיות מאוחסן ב-20 ° C.
2. להכין את הפתרונות הבאים יום לפני הניסוי ולאחסן את כל הפתרונות ב 4 º C.
   1. להכין 4 ליטרים של שיוף בינונית pH 8.4 המכיל Tricine-קו (20 מ מ, pH 8.4), בסורביטול (0.4 מ'), EDTA (10 מ מ, pH 8) ו- NaHCO₃ (10 מ מ). להתאים את ה-pH על-ידי הוספת כדורי NaOH. להוסיף שור אלבומין (BSA) ב- 0.1% (w/v) רק לפני השימוש ומערבבים היטב.
   2. הכנת 500 מ"ל של כביסה בינוני (2x) pH 7.6 המכיל Tricine-קו (20 מ מ, pH 7.6), בסורביטול (0.8 מ'), MgCl₂ (5 מ מ) ו- EDTA (2.5 מ מ). להתאים את ה-pH על-ידי הוספת כדורי NaOH. לדלל את פתרון כזה לאחר הכנה של פתרון הדרגתי Percoll כדי לקבל כביסה בינוני (1 x).
   3. להכין 200 מ של פתרון הדרגתי Percoll לטיהור כלורופלסט על ידי ערבוב Percoll כביסה בינונית (2x) אמצעי שווה לקבל פתרון סופי ב-50% (v/v) Percoll / 0.4 M בסורביטול.
   4. היכונו 50 מ של סוכרוז פתרונות כלורופלסט fractionation על ידי ערבוב מגבים (10 מ מ, pH 7.8), MgCl₂ (4 מ מ) וריכוזים שונים של סוכרוז (0.3 M, 0.6 מטר ו- 0.93 M).
3. הכינו את מעברי צבע הבאות ואת מאגרי לפני הפעלת הניסוי.
   1. הכן טורפדו 6 של מעברי צבע Percoll (אחד המכיל 30 מ של 50% Percoll / 0.4 M בסורביטול) על ידי צנטריפוגה ב g x 38,700 במשך 55 דקות ב 4 º C. להוריד את הבלם כדי למנוע מיזוג של מעברי הצבע. לאחר צנטריפוגה, לאחסן הצינורות המכילים את מעברי צבע preformed בחדר קר עד השימוש.
   2. להכין 4 שפופרות של סוכרוז מעברי צבע, עם כל מעבר צבע יצרו של שלוש שכבות סוכרוז הבאים: 3 מ"ל של 0.93 מ', 2.5 מ של 0.6 מטר, 2 מ של 0.3 M סוכרוז. בזהירות כשכבת-על כל שכבה, באמצעות משאבה סחרור שמתחילות באות 0.93 M בתחתית וגימור עם 0.3 M בחלק העליון.
   3. היכונו 50 מ של מדיום היפוטוניק כלורופלסט פירוק המכיל מגבים (10 מ מ, pH 7.8), MgCl₂ (4 מ מ), PMSF (1 מ מ, להגדיר באלכוהול איזופרופיל), benzamidine הידרוכלוריד הידרוקסיד (1 מ מ) ו- caproic חדוה אמינו חומצה (0.5 מ מ). לאחסן את המאגר על הקרח עד השימוש.
   4. להכין 50 מ של הממברנה שטיפה מאגר המכיל מגבים (10 מ מ, pH 7.8), PMSF (1 מ מ), benzamidine הידרוכלוריד הידרוקסיד (1 מ מ) ו- caproic חדוה אמינו חומצה (0.5 מ מ). לאחסן את המאגר על הקרח עד השימוש.

2. צמיחה קצירת תודרנית עלים

1. לצמיחה של תודרנית צמחים, להכין 4 מחבתות פלסטיק גדולים (משטח הכולל של 0.5 עד 1 מ'²) של תודרנית צמחים על ידי זריעה 30 מ"ג של הזרעים במחבת בכל. לגדל צמחים תודרנית למשך 5 שבועות ב 12-h מחזור אור-23 ° C (יום) / 18 ° C (לילה) עם עוצמת האור של 150 μM m s^{-2 -1}.
2. דגירה צמחים בחדר חשוך וקר (4 מעלות צלזיוס) למשך הלילה לפני הניסוי (כדי להפחית את כמות עמילן בגרגרים מהכלורופלסט).
3. לשקול מראש את גביע 1 ליטר, ואז למקם אותו על הקרח לפני תחילת קציר עלה חומר.
4. קציר תודרנית עלים על ידי הימנעות אדמה (קומפוסט). לשקול מחדש את. הספל, רושמות את משקל הרקמה.
   הערה: 400 עד 500 גרם של חומר עלה צפויים מ 4 מחבתות.
5. Homogenize עלים בחדר קר עם 2 ל' של שחיקה מאגר (להוסיף BSA לפני השימוש) שלוש פעמים / 2 s בכל פעם, בבלנדר במהירות גבוהה.
6. לסנן את homogenate בחדר קר באמצעות 4 שכבות של המוסלין שכבה אחת של blutex ניילון. סחוט בעדינות את העלים homogenate פנימה blutex המוסלין/ניילון כדי לחלץ את כל הנוזל.
7. לשחזר הרקמה הנותרת בגביע בלנדר לחילוץ השני. חזור על שלבים 2.5 ו- 2.6 באמצעות 2 ל' של שחיקה בינוני וחדשים 4-5 שכבות של המוסלין (בחדר קר).

3. טיהור של מהכלורופלסט גולמי באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית

1. באותה מידה להפיץ את תמצית תא גסה לתוך שישה בקבוקי 500 מ"ל ולמקם את הבקבוקים על הקרח לפני צנטריפוגה. צנטריפוגה למשך 2 דקות, ברגע המהירות המרבית (2,070 x g) הינו נגיש (האצה מקסימלית, בלם ב, 4 ° C).
2. להתעלם בעדינות את תגובת שיקוע.
3. וארוקן את תגובת שיקוע הנותר באמצעות משאבה המים ולשמור את כדורי המכיל מהכלורופלסט גולמי מרוכז על קרח.
4. בעדינות resuspend כדורי על-ידי הוספת נפח מינימלי של כביסה בינוני (1 x) (נפח סופי המתלים כלורופלסט משולב = 36 מ"ל) בעזרת מברשת או מרית פלסטיק מעוגל. השתמש pipet 10 מ"ל כדי להוסיף 3 מ"ל של כביסה במדיום כל בקבוק.
   הערה: אין להשתמש pipet עם טיפים יפה מאוד כדי למנוע שבירה של מהכלורופלסט. לחלופין, חותכים את קצה כחול pipet עם סכין גילוח כדי ליצור חור גדול יותר.
5. לאסוף בתורה מהכלורופלסט resuspended בצינור אחד באמצעות pipet של 10 מ"ל. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך צינור כדי לקבל השעיה הומוגני לפני העמסה על מעברי צבע Percoll.

4. טיהור של מהכלורופלסט שלם על רציף הדרגתי Percoll

1. לאט לאט לטעון 6 מ של המתלה כלורופלסט על גבי כל אחת Percoll שישה מעברי צבע באמצעות pipet 10 מ"ל כדי למנוע שבירה של מהכלורופלסט.
2. Centrifuge מעברי הצבע 10 דקות ב ומכרה כ-13,300 x g, 4 ° C באמצעות רוטור מתנדנד-דלי.
   הערה: ההאצה צריך להיות איטי, צריך לנתק את הבלם (בלם את או ההאטה איטי) כדי למנוע מיזוג של מעברי הצבע Percoll.
3. תשאף השלב העליון המכילה מהכלורופלסט שבור של המיטוכונדריה שלם באמצעות משאבה מים ולאחר מכן מאחזרים נוכח התחתון ללא פגע מהכלורופלסט תלת פאזי (פס ירוק כהה רחבה) עם pipet 10 מ"ל. יש להיזהר לא תשאף גרעינים ופסולת תאים (נמצא בחלק התחתון של הצינור) עם בתורה מהכלורופלסט שלם (איור 2 א).
4. לדלל 3-4-מקפלים המתלים כלורופלסט שלם עם מאגר כביסה (1 x). צנטריפוגה למשך 2 דקות, ברגע המהירות המרבית (2,070 x g, 4 ° C) הינו נגיש (האצה מקסימלית, בלם ב).
5. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע.
6. לגמרי מחוק לגמרי את תגובת שיקוע הנותרים עם משאבה מים ולשמור את גלולה מרוכזת מהכלורופלסט שלם על קרח.
7. לפני פירוק כלורופלסט, לשמור על aliquot של כלורופלסט שלם שבר כ 1 מ"ל של כביסה בינוני (1 x) עבור ניתוחים נוספים באמצעות סודיום dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) סופג המערבי. שמור קטן aliquot של אלה מהכלורופלסט שלם עבור קביעת ריכוז חלבון. אחסן את השבר כלורופלסט שלם חנקן נוזלי לניסויים נוספים.

5. פירוק של מהכלורופלסט שלם באמצעות מאגר היפוטוניק טיהור של תאים תת כלורופלסט על מעברי צבע סוכרוז מקוטע

1. Lyse בתורה מהכלורופלסט מטוהרים ללא פגע על ידי resuspending בגדר בינוני היפוטוניק המכיל מעכבי פרוטאז (האחסון הסופי לא יעלה על 12 מ ל).
   הערה: של שלב זה, השימוש pipet עם טיפים בסדר (טיפים כחול) אפשרי מאז intactness של מהכלורופלסט חיונית יותר (pipetting מהכלורופלסט למעלה ולמטה כל עוד גלולה לא resuspended לגמרי). תודרנית מהכלורופלסט הם מאוד שבירים (בהשוואה מהכלורופלסט אפונה, לדוגמה), והוא פירוק שלהם כמעט מיידית לאחר דגירה בינוני היפוטוניק.
2. לאט לאט לטעון 3 מ"ל של בתורה מהכלורופלסט lysed בראש כל מעברי צבע preformed סוכרוז באמצעות משאבה סחרור.
3. Ultracentrifuge מעברי הצבע עבור h 1 (g 70,000 x, 4 ° C). לאזן זוגות של צינורות באמצעות מאגר בינוני היפוטוניק לפני צנטריפוגה.
4. בזהירות לשחזר את החלבונים סטרומה מסיסים על-ידי pipetting השלב העליון של מעבר הצבע (3 מ"ל של מעבר הצבע) (איור 2B). קח את aliquot עבור קביעת ריכוז חלבון⁷. לאחסן stroma חנקן נוזלי לניסויים נוספים.
5. האחות השלב העליון הנותרים של מעבר הצבע עד הלהקה צהוב באמצעות משאבה מים.
6. אחזר את הלהקה צהוב (המעטפה) עם pipet (כ 1 מ"ל של מעבר הצבע). בריכת המעטפות שפופרת אחת.
7. הסר את השלב הנותרים של מעבר הצבע עד בגדר תילקואיד באמצעות משאבה מים.

6. כביסה וריכוז תילקואיד ומערכות ממברנות מעטפה

1. Resuspend את תילקואיד פתיתים ירוק באמצעי אחסון מינימלי (2 מ ל) של קרום שטיפה מאגר (1 x) (עם מעכבי פרוטאז).
2. לדלל את המתלים המעטפה ואת תילקואיד 3-4-קיפול במדיום כביסה ממברנה (להתאים את עוצמת הקול כדי 10 מ ל) ו- ultracentrifuge עבור 1 h (110,000 x g, 4 ° C). לאזן זוגות של צינורות באמצעות ממברנה שטיפה מאגר לפני צנטריפוגה.
3. בזהירות וארוקן את supernatants באמצעות משאבה מים.
4. להוסיף כ- 100 µL של הממברנה שטיפה מאגר (עם מעכבי פרוטאז) כדי בגדר מעטפה. קח את aliquot עבור קביעת ריכוז חלבון⁷. לאחסן ההכנה ממברנה המעטפה מטוהרים חנקן נוזלי.
5. Resuspend thylakoids צנפה ב- 3 מ"ל של הממברנה שטיפה מאגר (עם מעכבי פרוטאז). קח את aliquot עבור קביעת ריכוז חלבון⁷. לאחסן תילקואיד ממברנה שבר חנקן נוזלי.

תוצאות

שלבים רצופים של ההליך וכתוצאה מכך כלורופלסט מטוהרים תאי המשנה שלהם הם חידש באיור2. מעבר הצבע Percoll (איור 2 א) מאפשר הבחנה מהכלורופלסט שלם של כלורופלסט שבור והמיטוכונדריה (למעלה של המילוי ההדרגתי) או גרעינים שאריות תאים (בחלק התחתון של מעבר הצבע). לאחר שבר organelles Percoll-טיהור הודות מכת אוסמוטי, שברים וכתוצאה מכך מופרדים על מעבר הדרגתי סוכרוז (איור 2B). Stroma (מסיס חלק כלורופלסט) צף על פני השטח של מעבר הצבע סוכרוז. מעטפה אור קרום שלפוחית התאוששו כלהקה צהוב דיסקרטית-הממשק 0.6/0.93 M סוכרוז. השלפוחיות המוגלתיות ממברנות תילקואיד הכבד מרוכזים בחלק התחתון של הצינור. לאחר השחזור, כביסה, ריכוז של קרום שני השברים, חלבונים הם לכמת ומנותח ההרכב של כל ארבעה שברים בעמוד מרחביות-(איור 2C). המסלולים נטענים על בסיס חלבון שווה (20 µg של כל שבר מטוהרים). בידיעה כי מהכלורופלסט מכילים רק 1% של המעטפה חלבונים ו- 50% של חלבונים stroma, או את thylakoids, זה נוטה בהערכת יכולתו של זיהום צולב של המעטפה מטוהרים ההכנות עם תאים משנה אחרים כלורופלסט. עם זאת, שיטה זו מאפשרת לזהות כמויות זעירות של חלבונים קרוס-מזהם השבר מעטפה. סמנים של כל תא (קרי, שופע חלבונים) הם מאוד מועיל בהערכת זיהום צולב של השברים. אכן, שברים ממברנה תילקואיד ומעטפה צפויים מכילים כמויות נמוכות מאוד של יחידת משנה גדולה של RuBisCO (RBCL), החלבון הנפוץ ביותר מ stroma (50 kDa). מהכלורופלסט שבור יכול בקלות להבחין בין כלורופלסט שלם בשל האובדן של זה חלבון סטרומה⁸. האור קציר חלבונים מורכבים (LHCP) הם רכיבים תילקואיד שופע 25-kDa צריך בקושי (פחות מ- 3%) לזהם את המעטפה ממברנות⁹. לבסוף, translocator פוספט-triose-פוספט (TPT) הוא חלבון 30-kDa מוצגת רק בהשבר המעטפה מטוהרים בשל את העשרת חזקה (קרי, 50 ל- 100 x) בהשבר המעטפה בהשוואה כלורופלסט כל תמציות. באמצעות השיטה המתוארת כאן, תאים תת כלורופלסט בדרך כלל גרוע הצלב-מזוהמים כמו אושרו תוך שימוש מערבי-כתם ניתוחים (איור דו-ממדי) בהסתמך על נוגדנים נגד סמנים הידוע של כל שלושת התאים תת: מסיסים ketol בחומצה reductoisomerase (קארי) מ stroma, המעטפה כלורופלסט נחושת ATPase (HMA1), ואת אור קציר חלבונים מורכבים (LHCP) של הממברנות תילקואיד. זיהום צולב של התאים משנה 3 ניתן לכמת באמצעות immunoblotting והן מסה ספקטרומטר ניתוחים⁹. בעוד stroma בדרך כלל לא מזוהם על ידי שברים מעטפה או תילקואיד, שברים המעטפה מטוהרים מכילים 3% של חלבונים תילקואיד ו עד 10% של חלבונים מן stroma. מהחלבונים stroma לקוי לזהם את הקרומים תילקואיד (פחות מ 1%) אבל thylakoids להכיל עד 3% של המעטפה קרום חלבונים. יותר ממה שיש תפקיד מכריע בזיהוי המיקום subplastidial מקורית של כלורופלסט חלבונים, השיטה הנוכחית ובכך מגביל גם מסקנות שגויות לגבי subplastidial לוקליזציה של חלבונים הנובע לחצות מציג.

איור 1: ערכת נציג של תאים תת כלורופלסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: טיהור של מהכלורופלסט ללא פגע, המרכזית שלוש תת compartments באמצעות מעברי צבע Percoll וסוכרוז. א Percoll הדרגתי המאפשר הפרדת מהכלורופלסט שבור ללא פגע. B. סוכרוז הדרגתי המאפשר הפרדת stroma, מעטפה, תילקואיד שברים. ג. נציג מרחביות-דף של חלבונים מהכלורופלסט ללא פגע, את התאים שלושה תת העיקרי המאפשר להמחיש סמני בשפע של כל תא משנה. כל ליין מכיל 10 µg של חלבונים. משקל מולקולרי סמנים: RBCL, יחידת משנה גדולה של RuBisCO (סמן stroma); TPT, פוספט/triose-פוספט translocator (סמן המעטפה); . LHCP, אור קציר חלבונים מורכבים (סמן תילקואיד). D. ניסויים המערבי-כתם המאפשר לזהות סמנים ספציפי (באמצעות נוגדנים ספציפיים) של כל תא משנה: כלורופלסט מעטפת נחושת ATPase HMA1¹⁰, האור קציר המורכב מהחלבונים LHCP תילקואיד ממברנות¹¹, ו- reductoisomerase ketol בחומצה של קארי משתית⁹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

המאמר הנוכחי שואפת פירוט פרוטוקול צעד אחר צעד שמשמש לטהר מהכלורופלסט (וגם את התאים משנה) של תודרנית לבנה. מאז הזמינות של רצף הגנום המלא שלו כמעט שני עשורים, ואת אוספים גדולים של מוטציות הכניסה לרשות הקהילה, תודרנית עכשיו מקובל כמו צמח מודל. עם זאת, בעוד הצמח הזה היה מותאם בצורה מושלמת עבור גישות גנטיות, צמח המדענים צריך להתאים כלים הביוכימי פיזיולוגיים למודל זה המתעוררים. פרוטוקולים ומאפשר לטהר מהכלורופלסט photosynthetically הפעיל מן העלים ומבוססת הביוכימי דגמים כמו תרד¹² או אפונה¹³ וכך היה צריך להיות מותאם. השיטה הראשונה המתארת טיהור של תודרנית מהכלורופלסט פורסם ב 1998¹⁴, לפני שחרורו של רצף הגנום תודרנית . מספר שנים מאוחר יותר, פשוט שיטות לבידוד תודרנית מהכלורופלסט התואמים מחקרים במטרה לנתח במבחנה ייבוא של חלבונים ב- organelles מטוהרים נעשו זמינים^15,16. עם זאת, שיטות אלה לא איפשרה לשלב בין רמה גבוהה של טוהר ושימור הפעילות פוטוסינתטיים של בתורה מהכלורופלסט מטוהרים. לאחרונה¹⁷, שיטה מהירה הוקמה, אשר נסמכת על השימוש של מעברי צבע Percoll, ומאפשר לשמור כמעט 90% של קצב פוטוסינתזה נמדד העלים ההתחלתי של תודרנית.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לטהר תודרנית מהכלורופלסט ברמה מעולה של טוהר. אכן, זיהוי אימונולוגי של מזהמים של תאים תאים אחרים הדגימו כי organelles מטוהרת הם חסרי מיטוכונדריאלי קרום פלזמה סמני^9,10. פרוטוקול זה גם היה יעיל לטהר מהכלורופלסט של מספר תודרנית ecotypes¹⁸, כמו קולומביה (Col) או Wassilewskija (WS), קרי, ecotypes משמש הגנום או הביע רצף תגיות (ESTs) רצף פרויקטים אבל גם, כדי ליצור ב- T-DNA ההכנסה מוטציות ב תודרנית. במילים אחרות, כאשר מחקרים פרוטאומיקס חייב להתבצע, פרוטוקול הנוכחי הוא תואם ecotypes התייחסות שני אלה של תודרנית. לבסוף, התשואה של מהכלורופלסט משתמש בפרוטוקול הנוכחי הוא דומה לזה המתקבל כאשר החל מעלי תרד או אפונה (קרי, 3%, כפי שנמדד מן התוכן כלורופיל כלורופלסט מטוהר Percoll בהשוואה לסה כלורופיל הסכום הנוכחי החל עלים). במונחים של חלבונים, התשואה קרובה 50 מ"ג של כלורופלסט חלבונים, כאשר organelles וגופם מטוהר מ 500 גרם של בת שבוע 5 תודרנית עלים.

כדי להגיע כזה של תשואה טובה (ותקינות כלורופלסט), אחד עם זאת צריך לשים לב מיוחד במספר שלבים בעת שימוש בפרוטוקול הנוכחי. כלורופלסט ב תודרנית הוא מבנה רגישים במיוחד (זהו לא המקרה מהכלורופלסט אפונה, לדוגמה). תשומת לב מסוימת ולכן נדרשת כדי למנוע קרע בקנה מידה גדול של organelles במהלך טיהור. המספר והגודל של גרגרי עמילן נוכח מהכלורופלסט הם קריטיים עבור הכנת מהכלורופלסט ללא פגע. אכן, מהכלורופלסט המכיל עמילן גדול תבואה בדרך כלל יהיה שבור במהלך השלבים centrifugations מבדלת הראשונית שמטרתה להתרכז כלורופלסט גולמי שברים¹². לכן, הצמחים יש לשמור לילה בחדר חשוך וקר (4 ° C) לפני הניסוי, כדי להפחית את כמות עמילן.

משתמשים חדשים של הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מפתה כדי להתחיל כמויות גדולות יותר של החומר העלה (ענק רוזטות מצמחים תודרנית הישן עם עלים גדולים) מנסה לשפר את ההתאוששות של מהכלורופלסט מטוהרים. עם זאת, בידיים שלנו, החל מעלים צעירים (5-בת שבוע) הוא הפשרה הטובה ביותר לשלב בין התשואה, טוהר, שלמות organelles מטוהרים. אכן, עלים זקנים מדי מאוד מועשרים תרכובות בעל תאים פנוליים כי הוצגו יש השפעה שלילית על תקינות כלורופלסט¹⁹.

לבסוף, השלב הראשוני החילוץ (שחיקה של הרקמה) היא עוד צעד קריטי. תהליך המיזוג חייב להיות מוגבל כמה שניות. כאמור לעיל, משתמשים חדשים עלול להתפתות להשתמש מיזוג יותר, ובכך מצפה מאוד לשפר את התשואה של organelles מטוהרים. עם זאת, אם המיזוג יותר ביעילות משחרר עוד חומר של עלים, נראה כי שיעור מהכלורופלסט שבור במהירות מגביר תמצית תא גולמי. בשל זה יחס גבוה של שבור כדי מהכלורופלסט שלם בטווח הבינוני, עוד צעדים טיהור (ההפרדה על מעברי צבע Percoll) בחום מושפע, התשואה של הטיהור הוא נמוך באופן בלתי צפוי.

הזמינות של פרוטוקולים ספציפיים לטהר organelles אפשרו סדרה של תפוקה גבוהה מבוסס פרוטאומיקס ניסויים להתנהל על דגימות כלורופלסט. נתונים אלה נעשו זמינים ב מספר מסדי נתונים ציבוריים⁶, ובכך לספק ביולוגים בשדה לוקליזציה subcellular (וגם subplastidial) מדויק של חלבונים כלורופלסט רבים. זה היה נכון במיוחד עבור המעטפה חלבונים אשר זהותו, מיקום נותרה בעיקר ידוע לפני ניתוחים אלה, מאז המעטפה ממברנות מהוות רכיב כלורופלסט מינור (1-2% מכלל החלבונים כלורופלסט) בעת ששיחק תפקיד מפתח כלורופלסט חילוף החומרים, להן^5,20. באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, ניתחנו לאחרונה את ההרכב של התאים העיקריים כלורופלסט שלושה מן תודרנית (קרי, stroma, את thylakoids, ועל מערכת קרום מעטפה)⁹. בהתבסס על גישה פרוטאומיקס הכמותיים למחצה (ספירת ספקטרלי), היינו יכולים להעריך חלוקת מאות חלבונים בקרונות כלורופלסט שלושה אלה.

בעוד בפרוטוקול הנוכחי מאפשר לטהר את שלושה תאי העיקרי כלורופלסט מ תודרנית, זה גם ניתן להבחין בתאים תת נוספים כלורופלסט. ואכן, מערכת קרום המעטפה מורכב הפנימי, את הקרומים המעטפה החיצונית (איור 1). עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, שיטה לטהר את המעטפה הפנימית והחיצונית ממברנות של תודרנית מהכלורופלסט נשאר שתוקם. המעטפה הפנימית והחיצונית ממברנות יכול להיטהר מן מהכלורופלסט^{22 21} או אפונה תרד. המגבלה העיקרית של תודרנית נובעת בעיקר הגבלת כמויות החל חומר. החל מ- 500 גרם של תודרנית עלים (אשר כבר מחייב 1 מ' משטח² בחדר צמיחה) מאפשר טיהור µg רק 100 של המעטפה חלבונים. מצד שני, קל להתחיל עם 5-10 ק ג תרד עלים מן השוק, לטהר את כמות גדולה של מהכלורופלסט⁸ , עם תשואה של 3-10 מ ג של המעטפה חלבונים מן החומר הזה.

אותו הדבר נכון עבור תאים תת תילקואיד. אכן, thylakoids עשויים אור קרום שלפוחית (lamellae) ומבנים צפוף (grana) (איור 1). פרוטוקולים ספציפיים זמינים להבחין בין אלה שני תאים תודרנית^23,24. שוב, על סמך ניתוח כמותי פרוטאומיקס, אנחנו לאחרונה מטופלים החלבונים המצויים אלה שני תאים משנה²⁴. גישות אלה, יחד עם חקירה מעמיקה של הספרות, מותר אימות, או מציע היפותזה עבור, המיקום subplastidial של מאות תילקואיד חלבונים. עם זאת, חשוב לציין כי microdomains ממברנה נוספים נמצאים בשולי מעוקל thylakoids. אלה תאים תת ליפופרוטאין, או plastoglobules, הם ביחד לצמיתות לממברנות תילקואיד ומכילים קבוצה ספציפית של חלבונים²⁵. משתמש בפרוטוקול הנוכחי, ולכן בלתי אפשרי להבחין חלבונים ספציפיים אלה לבין רכיבים אחרים תילקואיד.

מקורית (ידוע) המעטפה, משתית או תילקואיד רכיבים מסוימים חסרים עדיין מתוך הרשימות של חלבונים שזוהו. יחד עם ניתוחים הביוכימי ו יישוב, שיפור מתמיד של MS רגישות יהיה לעזר רב לבקר את התוכן כלורופלסט לכיוון רפרטואר שלם של ההרכב של תאים תת השונים שלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Percoll	GE Healthcare	17089101
Tricine	Roth	6977.2
Sorbitol	Roth	6213.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	H5032
NaHCO3	Roth	8551.1
Bovine serum albumin (BSA)	Roth	8076.5
MgCl2	Roth	2189.1
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzamidine	Sigma	B6506
ε-amino caproic acid	Fluka	21530
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Roth	6979.3
Sucrose	Roth	9286.2
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide	Roth	3029.1
Tris	Fisher	BP152-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Roth	1057.1
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T-8133
Ammonium persulfate (APS)	Roth	9592.1
Glycerol	Roth	3783.1
Bromophenol blue	USB	US12370
Glycin	Roth	3908.3
Gel staining medium	Clini-sciences	GEN-QC-STAIN
Ethanol	CARLO ERBA	528151
NaCl	Euromedex	1112-A
Triton X-100	Promega	H5141
Fat-free milk powder	Régilait
HCl	Fisher	H/1150/PB15
KOH pellets	Sigma	1.05012
NaOH pellets	CARLO ERBA	480507
Anti-HMA1 antibody		Seigneurin-Berny et al, 2006	Used at a 1:1000 dilution
Anti-KARI antibody		Ferro et al, 2010	Used at a 1:1000 dilution
Anti-LHCP antibody		Vallon et al, 1991	Used at a 1:25,000 dilution
P-coumaric acid	Sigma	C-9008
Luminol (3-aminophalhydrazin)	Fluka	9253
Dimethyl sulfoxide (DMSO).	Sigma	D5879
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases	Puteaux	162135
A. thaliana seeds			Around 30 mg of seeds for a whole case
Compost "Floragard"	Puteaux	16311770
Growth rooms			12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s.
Muslin or cheesecloth	Raffin	70116	80-cm-large
Nylon blutex 50 μm aperture	Tripette et Renaud, Sailly Saillisel		50 μm aperture
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity	Waring Blender
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles)	Beckman Coulter
Beckman JA-20 rotor	Beckman Coulter
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes)	Sorvall instruments
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes)	Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes)	Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)	Beckman Coulter
Ultracentrifuge (Beckman L7)	Beckman Coulter
Centrifuge (Beckman JSE-06D18)	Beckman Coulter
Microcentrifuge	Eppendorf 5415D or equivalent
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.
Nitrocellulose membranes	BA85, Schleicher and Schuell
Filter paper	3MM, Whatman, Maidstone
Liquid nitrogen
Peristaltic pump	Gilson
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).	Bio-Rad Protean 3 or equivalent
System for protein transfer to nitrocellulose membranes	Bio-Rad Protean 3 or equivalent