단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

요약

여기, 우리 애기 잎 (봉투, 기질, 그리고 thylakoids), 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 그대로 엽록체를 정화 하는 방법을 설명 차동 centrifugations, 연속 Percoll 기울기의 조합을 사용 하 고 불연속 자당 기온 변화도입니다. 메서드는 subplastidial 및 immunoblotting과 proteomics에 의해 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 귀중 한.

초록

엽록체는 식물 세포의 주요 구성 요소. 이러한 plastids 필수 대사 산물의 합성 탄소, 유황 및 질소의 동화 등 많은 중요 한 기능을 성취 한다. 다음 세 가지 주요 하위 구획이이 세포에 의하여 이루어져 있다. 두 막이 특징인 봉투 둘러싸는 세포 기관이 고 다른 세포 구획 plastid의 통신을 제어 합니다. 스트로 마는 엽록체와 이산화탄소 탄수화물으로 변환 되는 주요 사이트의 가용성 단계입니다. Thylakoid 막 grana (평면 압축된 sac)의 구성 된 내부 막 네트워크 이며 lamellae (더 적은 조밀한 구조), 장소 oxygenic 광합성 걸립니다. 현재 프로토콜 차동 centrifugations 및 Percoll 그라데이션, 애기및 그들의 분류에서 그대로 엽록체의 사용 하 여, 3 자당 기온 변화도 사용 하 여 정화에 필요한 단계별 절차를 설명 합니다. 하위 구획 (즉, 봉투, 기질, 및 thylakoids) 이 프로토콜은 또한 다양 한 엽록체 하위 구획을 연결 하는 마커를 사용 하 여 이러한 분수의 순도 평가 하는 방법에 지침을 제공 합니다. 여기에 설명 된 방법은 subplastidial 단백질에 대 한 뿐만 아니라 immunoblotting을 사용 하 여 지역화에 대 한 귀중 한 subcellular subplastidial 단백질 및 다른 연구.

서문

엽록체는 식물 세포의 주요 구성 요소. 그들은 한 endosymbiosis 겪고 있으며 결국 진화^1,2중으로 한 세포 기관이 진화 cyanobacterial 조상에서 파생 됩니다. 이러한 세포 세 가지 주요 구획 (그림 1)를 포함합니다. 봉투 시스템 내부 및 주변 세포 기관이 외부 막의 이루어집니다. 이 이중 멤브레인 시스템 지질과 안료의 대사에 관련 된 다양 한 효소를 포함 하 고 plastids는 cytosol 간의 통신 제어 하는데 대부분 이다. 인코딩된 핵 단백질의 가져오기 및 이온 그리고 대사 산물은 cytosol와 따라서 식물 세포^{3,4 필수적인 대사 기능을 조절 하는 엽록체의 교환을 허용 하는 다양 한 전송 시스템 포함} . 기질, 엽록체의 용 해 단계 포함 캘빈 주기 (CO₂ 동화)의 효소와 비타민, 아미노산과 plastid의 전사 및 번역 기계를 포함 하 여 다양 한 대사 산물의 합성. Thylakoid 막 광합성의 빛 단계 수행 널리 조직된 내부 막 네트워크입니다. 따라서, 엽록체는 필수적인 대사 경로⁵발생 하는 장소입니다.

엽록체 역학 및 생리학을 제어 하는 새로운 규제 메커니즘을 해독 하려면 엽록체 단백질의 하위 plastidial 지역화를 정의 따라서 중요 하다 단백질 기능 파악을 목표로 하는 타겟된 연구를 지원 하기 위해 모델 생물⁶에서. 이 단백질의 정품 subplastidial 지역화에 대 한 액세스를 얻으려면, 따라서 매우 순수한 subplastidial 분수 (봉투 막, 기질, 및 thylakoids)에서 시작 필수적 이다. 이러한 맥락에서 현재 프로토콜의 목표는 애기 단풍 차동 centrifugations 및 연속 Percoll 그라디언트를 사용 하 여에서 그대로 엽록체를 정화 하 고 그들을 충분치 3 불연속 자당 기온 변화도 사용 하 여 하위 구획 (즉, 봉투, 기질, 및 thylakoids) 여기 설명 하는 방법을 다양 한 엽록체 하위 구획을 연결 하는 마커를 사용 하 여 순화 된 하위 organellar 분수의 순도 평가 하기 위해 또한 설명 합니다. 이 프로토콜은 immunoblotting를 사용 하 여 단백질의 subplastidial 지역화와 질량 분석 (MS)를 사용 하 여 순화 된 분수의 추가 분석을 위해 귀중 한-proteomic 연구를 기반으로.

프로토콜

1. 버퍼, 재고 솔루션 및 그라디언트의 준비

1. 4 ° c.에 6 개월 저장 될 수 있는 다음과 같은 재고 솔루션을 준비
   1. Tricine 버퍼 (1 M, pH 8.4) 및 Tricine 버퍼 (1 M, pH 7.6) 1 리터를 준비 합니다. 코 펠 릿을 추가 하 여 pH를 조정 합니다.
   2. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, 0.5 M, pH 8) 1 리터와 3-(N-morpholino) 프로 판 술 폰 산 (MOPS) 버퍼 (1 M, pH 7.8) 준비 합니다. NaOH 산 탄을 추가 하 여 pH를 조정 합니다.
   3. MgCl₂ (1m) 50 mL를 준비 합니다.
   4. 준비 50ml protease 억제제 솔루션: phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF 소 프로 파 놀, 100 m m에), benzamidine 염 산 염 수화물 (100 m m), 및 ε-아미노 카프 산 (50 mM).
      참고: 동안 PMSF 및 아미노 카프 산 솔루션에서 안정적인 4 ° C에서 개월 동안, benzamidine 솔루션 저장 해야-20 ° c.에
2. 실험 전에 하루 다음 솔루션을 준비 하 고 4 ° c.에 모든 솔루션 저장
   1. 보통 pH 8.4 Tricine-코 (20 m m, pH 8.4), 포함 된 연 삭의 4 L 준비 톨 (0.4 M), (10 m m, pH 8), EDTA 그리고 NaHCO₃ (10 mM). NaOH 산 탄을 추가 하 여 pH를 조정 합니다. 그냥 사용 하기 전에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 0.1% (w/v)을 추가 하 고 잘 혼합.
   2. 중간 (2 배) pH 7.6 Tricine-코 (20 m m, pH 7.6), 포함 된 세척의 500 mL를 준비 톨 (0.8 M), MgCl₂ (5 m m), 그리고 EDTA (2.5 m m). NaOH 산 탄을 추가 하 여 pH를 조정 합니다. Percoll 그라데이션 솔루션의 세척 매체 (1x)를 준비 후 같은 솔루션을 희석.
   3. 50% (v/v) Percoll에서 최종 솔루션을 동일한 볼륨에서 세척 매체 (2 배)와 Percoll를 혼합 하 여 엽록체 정화 200 mL Percoll 그라데이션 솔루션의 준비 / 0.4 M 톨.
   4. MOPS (10 m m, pH 7.8), MgCl₂ (4 m m), 자당 (0.3 M, 0.6 M, 0.93 M)의 다른 농도 혼합 하 여 엽록체 분별에 대 한 자당 솔루션 50 mL를 준비 합니다.
3. 다음 그라디언트 및 실험을 시작 하기 전에 버퍼를 준비 합니다.
   1. Percoll 그라데이션 6 튜브 준비 (각각 50%의 30 mL를 포함 된 Percoll / 0.4 M sorbitol) 4 ° c.에서 55 분 38,700 x g에서 원심 분리 하 여 그래디언트의 혼합을 방지 하기 위해 브레이크 계속. 원심, 후 차가운 방에 미리 형성한 그라디언트 사용까지 포함 된 튜브를 저장 합니다.
   2. 3 다음 자당 계층 형성 각 그라데이션으로 자당 기온 변화도의 4 개의 튜브를 준비: 0.93 M, 2.5 ml 0.6 M, 0.3 M 자당의 2 mL의 3 mL. 조심 스럽게 시작 0.93 m 아래쪽에 그리고 0.3 M로 상단에 연동 펌프를 사용 하 여 각 레이어 오버레이.
   3. MOPS (10 m m, pH 7.8), MgCl₂ (4 m m), PMSF (1mm, 소 프로 파 놀에서 설정), benzamidine 염 산 염 수화물 (1 m m), 및 ε-아미노 카프 산 (0.5 m m)를 포함 하는 엽록체 세포에 대 한 소형 매체의 50 mL를 준비 합니다. 사용까지 얼음에 버퍼를 저장 합니다.
   4. 막 세척 MOPS (10 m m, pH 7.8), PMSF (1mm), benzamidine 염 산 염 수화물 (1 m m), 및 ε-아미노 카프 산 (0.5 m m)를 포함 하는 버퍼의 50 mL를 준비 합니다. 사용까지 얼음에 버퍼를 저장 합니다.

2. 성장과 애기 잎의 수확

1. 애기 식물의 성장에 대 한 준비 4 큰 플라스틱 팬 (0.5 ~ 1 m²의 총 표면) 애기 식물의 각 팬에는 씨앗의 30 mg을 파 종 하 여. 150 μ M m^{-2의 -1}의 광도와 23 ° C (일) / 18 ℃ (밤) 12-h 라이트 사이클에서 5 주 동안 애기 식물을 성장.
2. (엽록체에 전 분 알갱이의 양을 줄이기 위해)을 실험 전에 하룻밤 어둡고 차가운 룸 (4 ° C)에 식물을 품 어.
3. 1 리터 비 커를 미리 무게를 다음 잎 물자의 수확을 시작 하기 전에 얼음에 넣습니다.
4. 토양 (퇴 비)를 피하 여 애기 잎 수확. 다시 비 커의 무게와 조직 무게 기록.
   참고: 잎 물자의 400 ~ 500 g 4 개의 팬에서 예상 된다.
5. 버퍼를 연 삭의 2 패와 함께 추운 방에 나뭇잎 균질 (BSA 사용 하기 전에) 3 번 추가 2 / s 고속 믹서 기에 각 시간.
6. 캘 리코의 4 개의 층 및 나일론 blutex의 1 개의 층을 사용 하 여 차가운 방에 homogenate를 필터링 합니다. 부드럽게 모든 액체를 추출 하는 캘 리코/나일론 blutex 내부 homogenate 잎을 짠 다.
7. 두 번째 추출에 대 한 믹서 기 컵에 나머지 조직을 복구 합니다. 2.5 및 2.6 (추운 방에) 캘 리코의 4-5 레이어 매체 및 새로운 연 삭의 2 L을 사용 하 여 단계를 반복 합니다.

3. 차등 원심 분리를 사용 하 여 원유 엽록체의 정화

1. 똑같이 6 500 mL 병으로 원유 세포 추출 물 고 원심 분리 전에 얼음에 병을 배치. 최대 속도 (2,070 x g) (최대 가속 및 브레이크에, 4 ° C)에 2 분 동안 원심 분리기.
2. 부드럽게는 상쾌한을 삭제 합니다.
3. 물 펌프를 사용 하 여 나머지 상쾌한 발음 하 고 얼음에 집중된 원유 엽록체를 포함 하는 펠 릿을 유지.
4. 부드럽게 세척 매체 (1x)의 최소한의 볼륨을 추가 하 여 펠 릿을 resuspend (결합 된 엽록체 정지의 최종 볼륨 = 36 mL)를 붓 또는 곡선된 플라스틱 주걱을 사용 하 여. 10ml 피펫으로 사용 하 여 각 병에는 중간 세척 3 mL를 추가.
   참고: 엽록체의 파손을 피하기 위해 아주 좋은 팁 피펫으로 사용 하지 마십시오. 또는, 더 큰 구멍을 생성 하는 면도날으로 피펫으로의 파란색 팁 잘라.
5. 10ml 피펫으로 사용 하 여 한 튜브에 resuspended 엽록체를 수집 합니다. Percoll 그라데이션에 로드 하기 전에 동일한 정지를 튜브를 거꾸로 하 여 부드럽게 섞는다.

4. 연속 Percoll 그라데이션에 그대로 엽록체의 정화

1. 천천히 6 mL 10ml 피펫으로 엽록체의 파손을 피하기 위해 사용 하는 6 Percoll 기온 변화도의 각 위에 엽록체의 서 스 펜 션의 로드.
2. 13300 x g, 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에서 10 분에 대 한 그라디언트 원심
   참고: 가속, 그리고 브레이크를 분리 한다 (에서 브레이크 또는 느린 감속) Percoll 그라디언트의 혼합을 방지 하기 위해.
3. 깨진된 엽록체와 물 펌프를 사용 하 여 그대로 미토 콘 드리 아를 포함 하는 위 단계를 발음 하 고 그대로 엽록체에에서 존재를 다음 검색 (광범위 한 다크 그린 밴드) 10ml 피펫으로와 단계. 수 핵과 세포 파편 (튜브의 하단에서 찾을) 그대로 엽록체 (그림 2A)으로 발음 하지 않도록 주의 하십시오.
4. 3-4-배 세척 버퍼 (1x) 그대로 엽록체 정지 희석. (2,070 x g, 4 ° C) 최대 속도 (최대 가속 및 브레이크에)에 2 분 동안 원심 분리기.
5. 신중 하 게는 상쾌한을 삭제 합니다.
6. 완전히 물 펌프와 나머지 상쾌한 발음 하 고 얼음에 집중된 그대로 엽록체의 펠 릿을 유지.
7. 엽록체 세포의 용 해, 전에 약 1 ml의 세척 매체 (1x) 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)와 서 부 럽을 사용 하 여 추가 분석에 대 한 그대로 엽록체 분수의 약 수를 유지. 작은 단백질 농도의 결정에 대 한 이러한 그대로 엽록체의 aliquot 유지. 추가 실험을 위한 액체 질소에 그대로 엽록체 분수를 저장 합니다.

5. 당뇨 버퍼와 엽록체 하위 구획의 정화를 사용 하 여 불연속 자당 기온 변화도에 그대로 엽록체의 세포의 용 해

1. 소형 매체 protease 억제제 (최종 볼륨 12 mL를 초과 하지 않아야 합니다)을 포함 하는 펠 릿을 resuspending에 의해 순화 그대로 엽록체를 lyse.
   참고:이 단계에서 피펫으로 좋은 팁 (블루 팁) 사용 가능 하다 때문에 엽록체의 intactness는 더 이상 필수 (펠 릿은 전적으로 resuspended 하지로 아래로 엽록체 pipetting). 애기 엽록체는 (해당 되는 경우 예를 들어 완 두 엽록체에 비해) 매우 깨지기 쉬운 이며 그들의 세포의 용 해 거의 즉시 부 화 후 소형 매체에.
2. 연동 펌프를 사용 하 여 각 미리 형성한 자당 그라디언트 상단 lysed 엽록체의 3 mL를 천천히 로드.
3. Ultracentrifuge (70000 x g, 4 ° C)에서 1 시간에 대 한 그라디언트. 원심 분리 이전 소형 중간 버퍼를 사용 하 여 튜브의 쌍을 균형.
4. 신중 하 게 그라데이션 (3 mL 각 그라데이션에서)의 상위 단계를 pipetting으로 수용 성 기질 단백질을 복구 (그림 2B). 단백질 농도⁷의 결정에 대 한 약 수를 가져가 라. 추가 실험을 위한 액체 질소에 기질을 저장 합니다.
5. 각 그라디언트의 나머지 상위 단계 발음까지 물 펌프를 사용 하 여 노란색 밴드.
6. 피펫으로 (각 그라데이션에서 약 1 mL)와 노란색 밴드 (봉투)를 검색 합니다. 1 개의 관에 봉투를 풀.
7. 각 그라디언트의 나머지 단계를 최대 thylakoid 펠 릿 물 펌프를 사용 하 여 제거 합니다.

6. 세척 및 Thylakoid 및 봉투 막 시스템의 농도

1. 막 세척 (protease 억제제)와 버퍼 (1x)의 최소 볼륨 (2 mL) thylakoid 펠 릿 (녹색 알갱이)를 resuspend.
2. 봉투와 thylakoid 정지 희석 3-4-배 막 세척 매체에서 (10 mL에 양을 맞추십시오) 및 ultracentrifuge (110000 x g, 4 ° C)에서 1 시간에 대 한. 막 세척 원심 분리 이전 버퍼를 사용 하 여 튜브의 쌍을 균형.
3. 조심 스럽게 물 펌프를 사용 하 여 supernatants 발음.
4. 버퍼 (protease 억제제) 봉투 펠 릿을 세척 하는 막의 약 100 µ L를 추가 합니다. 단백질 농도⁷의 결정에 대 한 약 수를 가져가 라. 액체 질소에 순화 된 봉투 막 준비를 저장 합니다.
5. (Protease 억제제)와 버퍼를 세척 하는 멤브레인의 3 ml에서 thylakoids 펠 릿을 resuspend. 단백질 농도⁷의 결정에 대 한 약 수를 가져가 라. 액체 질소에 thylakoid 막 분수를 저장 합니다.

결과

순화 된 엽록체 그리고 그들의 하위 구획 인 절차의 후속 단계는 그림 2에 다시 시작 됩니다. Percoll 그라데이션 (그림 2A) 깨진된 엽록체와 미토 콘 드리 아 (그라데이션의 위) 또는 핵 세포 파편 (그라데이션 아래)에서 그대로 엽록체를 구별 수 있습니다. 삼투성 충격 덕분에 Percoll 정화 세포의 파열, 후 결과 분수 자당 기온 변화도 (그림 2B)에 분리 된다. 성 부는 엽록체의 기질 자당 기온 변화도의 표면에 부동 이다. 빛 봉투 막 소포 0.6/0.93 M 자당 인터페이스에서 개별 노란 악대로 복구 됩니다. 가장 무거운 thylakoid 막 소포는 튜브의 하단에 집중. 복구 후, 세척 두 막 분수의 농도, 단백질 정량 하 고 모든 4 개의 분수의 조성은 SDS 페이지 (그림 2C) 분석. 레인은 동등한 단백질 (각 순화 된 분수의 20 µ g)에 로드 됩니다. 엽록체 포함 봉투 단백질의 1%와 스트로 마에서 나는 thylakoids에서 단백질의 50%만 알면,이 크로스-오염 정화 봉투 준비 다른 엽록체 하위 구획의 대 평가 하는 경향이 있다. 그러나,이 방법은 수 분 양의 단백질 봉투 분수 교차 오염 감지. 각 구획 (즉, 풍부한 단백질)에서 마커는 분수의 교차 오염 평가에 매우 유용 합니다. 사실, 봉투 및 thylakoid 막 분수 큰 소 단위의 RuBisCO (RBCL), 기질 (50 kDa)에서 가장 풍부한 단백질의 매우 낮은 금액을 포함 하도록 예상 된다. 깨진된 엽록체가 기질 단백질⁸의 손실로 인해 그대로 엽록체에서 쉽게 구분할 수 있습니다. 복잡 한 단백질 (LHCP)를 수확 하는 빛은 거의 해야 25 kDa 풍부한 thylakoid 구성 요소 (3% 미만) 봉투 막⁹오염. 마지막으로, 인산 triose 인산 염 translocator (TPT) 때문에 그것의 강한 농축 정제 봉투 분수에서 볼 수만 30 kDa 단백질 이다 (즉, 50 ~ 100 x) 전체 엽록체에 비교 될 때 봉투 일부에서 추출. 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 엽록체 하위 구획은 일반적으로 제대로 서쪽 오 점 분석 (그림 2D) 의존 하는 모든 3 개의 하위 구획의 알려진된 표식에 대하여 지시 하는 항 체를 사용 하 여 확인 교차 오염:는 기질에서 녹는 ketol 산 reductoisomerase (카 리), 엽록체 봉투 구리 ATPase (HMA1), 그리고 복잡 한 단백질 (LHCP) 수확 thylakoid 막에서. 3 하위 구획의 교차 오염은 immunoblotting 및 질량 분석 분석⁹를 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 기질 보통 봉투 또는 thylakoid 분수에 의해 오염 되지, 하는 동안 정화 봉투 분수 포함 thylakoid 단백질의 3%와 10% 단백질의 기질에서. 단백질 기질에서 저조한 오염 thylakoid 막 (1% 미만) 하지만 봉투 막 단백질의 3%까지를 포함 하는 thylakoids. 발생 하는 단백질의 subplastidial 지역화에 대 한 잘못 된 결론을 제한 또한 따라서 엽록체 단백질, 현재 방법의 정품 subplastidial 위치 식별에 중요 한 역할을가지고 보다 더 교차 오염.

그림 1: 엽록체 하위 구획의 대표적인 제도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 그대로 엽록체의 정화 및 그들의 3 개의 주요 하위 Percoll 및 자당 기온 변화도 사용 하 여 구획. A. Percoll 그라데이션 부서 지 고 그대로 엽록체의 분리 허용. B. 자당 기온 변화도 기질, 봉투, 및 thylakoid 분수의 분리 허용. C. 대표 SDS 페이지 그대로 엽록체와 각 하위 구획에서 풍부한 마커를 시각화할 수 있도록 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 단백질의. 각 차선에는 단백질의 10 µ g을 포함 되어 있습니다. 분자 무게 마커: RBCL, RuBisCO (기질에 대 한 마커);의 큰 소 단위 TPT, 인산 염/triose 인산 염 translocator (봉투 표식); LHCP, 수확 하는 복잡 한 단백질 (마커는 thylakoid에 대 한) 빛. D. 각 하위 구획에서 허용 (특정 항 체를 사용 하 여) 특정 마커를 감지 하는 서쪽 오 점 실험: 엽록체 봉투 구리 ATPase HMA1¹⁰, 복잡 한 단백질 LHCP는 thylakoid에서 수확 하는 빛 막¹¹, 그리고 기질⁹ketol 산 reductoisomerase 카 리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

현재 문서에서 애기 thaliana엽록체 (그리고 그들의 하위 구획)를 정화 하는 데 사용 하는 단계 프로토콜 세부 목표로 합니다. 그것의 완전 한 게놈 순서 거의 2 년 전와 지역 사회에 게 제공 하는 삽입 돌연변이의 대규모 컬렉션의 가용성, 이후 애기 는 지금 널리 받아들여진다 모델 식물으로. 그러나,이 식물 유전 접근에 대 한 완벽 하 게 적응 시킨 동안, 과학자 들은 생 화 확 및 생리 적인 도구가 신흥 모델에 적응 하는 데 필요한 공장. 따라서 시금치¹² 또는 완두콩¹³ 같은 잘 설립 된 생 화 학적 모델의 잎에서 photosynthetically 활성 엽록체를 정화 수 있도록 프로토콜 적응 했다. 애기 엽록체의 정화를 설명 하는 첫 번째 방법은 1998¹⁴, 애기 게놈 시퀀스의 출시 직전에 간행 되었다. 몇 년 동안 애기 엽록체 순화 된 세포에 있는 단백질의 생체 외에서 수입을 분석 하는 것을 목표로 연구와 호환 하기 위한 후, 간단한 방법은 사용할 수^15,16되었다. 그러나, 이러한 방법은 순도의 높은 수준 및 순화 된 엽록체의 광합성 활동의 보존을 결합 허용 하지 않았다. 최근¹⁷, 빠른 방법 설립 되었다, Percoll 그라데이션의 사용에 의존 하 고 애기의 시작 잎에서 측정 하는 광합성 속도의 거의 90%를 유지할 수 있습니다.

여기에 설명 된 프로토콜 순도의 우수한 수준 애기 엽록체 정화 수 있습니다. 실제로, 다른 세포 구획에서 오염 물질의 면역 검출 순화 된 세포는 미토 콘 드리 아 없는 시연 및 플라즈마 멤브레인 마커^9,10. 이 프로토콜은 여러 애기 ecotypes¹⁸, 컬럼비아 (열) 또는 Wassilewskija (WS), 즉, 같은 엽록체 정화 효율 또한 ecotypes 게놈에 사용 되거나 표현 된 태그 (에스토니아어) 시퀀싱 시퀀싱 또한에 애기에 T-DNA 삽입 돌연변이 생성 하지만 프로젝트. 즉, proteomics 연구 수행 될 때, 현재 프로토콜 애기에서이 두 참조 ecotypes와 호환 됩니다. 마지막으로, 현재 프로토콜을 사용 하 여 엽록체의 수익률은 시금치 나 완두콩 잎 (즉, 3%, Percoll 정화 엽록체는 총에 비교 될 때에 엽록소 콘텐츠 측정에서 시작 했을 때 확인 하는 것과 유사 염 록 소 양 잎을 시작에 존재)입니다. 단백질, 측면에서 수익률 때 엽록체 단백질의 50 밀리 그램 가까이 세포 5 주 된 애기 잎 500 g에서 순화 된다.

그러나 이러한 좋은 수확량 (와 엽록체 무결성), 도달을 현재 프로토콜을 사용 하는 경우 하나 몇 가지 단계에 특별 한 주의 기울여야 한다. 애기 에 엽록체 (이건 완 두 엽록체에 대 한 경우 예를 들어) 매우 깨지기 쉬운 구조 이다. 특정 관심 따라서 정화 동안에 세포의 대규모 파열을 피하기 위해 필요 합니다. 수와 엽록체에 전 분 알갱이의 크기는 그대로 엽록체의 준비에 대 한 중요 합니다. 실제로, 큰 전 분 곡물을 포함 하는 엽록체 일반적으로 손상 됩니다 원유 엽록체 분수¹²집중을 목표로 초기 차동 centrifugations 단계. 따라서, 식물 전 분의 양을 줄이기 위해 실험 전에 어둡고 차가운 룸 (4 ° C)에서 하룻밤 유지 되어야 한다.

현재의 프로토콜의 새로운 사용자가 더 많은 양의 잎 소재 (큰 잎을 가진 오래 된 애기 식물에서 거 대 한 근 엽)에서 시작 하 유혹 수 정화 엽록체의 복구를 강화 하려고. 그러나, 우리의 손 안에, 수율, 순도, 고 정화 세포의 무결성을 결합 하 여 최고의 타협은 젊은 잎 (5 주 된)에서 시작. 사실, 너무 오래 된 잎은 엽록체 무결성¹⁹에 부정적인 영향을 표시 했다 페 놀 화합물에 높은 농축 된다.

마지막으로, 초기 추출 단계 (조직의 연 삭) 또 다른 중요 한 단계가입니다. 혼합 프로세스는 몇 초를 제한 해야 합니다. 위에서 설명 했 듯이, 새로운 사용자 유혹 수도 있습니다 될 더 이상 혼합 사용 하 여 따라서 강력 하 게 순화 된 세포의 수율 향상을 기대. 그러나, 더 이상 효과적으로 혼합 잎에서 더 많은 자료 출시, 그것은 깨진된 엽록체의 비율 원유 세포 추출 물에서 급속 하 게 증가 나타납니다. 깨진 매체에 그대로 엽록체의이 높은 비율 때문 추가 정화 단계 (Percoll 그라디언트에 분리) 강하게 영향을 고 정화의 수확량은 예기치 않게 낮은.

세포를 정화 하는 특정 프로토콜의 일련 높은 처리량의 proteomics 기반 실험 엽록체 샘플에 실시 될 수 있다. 이러한 데이터는 여러 공용 데이터베이스⁶, 따라서 생물학 분야에서 많은 엽록체 단백질에 대 한 정확한 subcellular (및 subplastidial) 지역화 제공 가능 했다. 이것은 특히 사실 봉투 단백질에 대 한 id와 위치 남아 있었다 주로 이러한 분석 하기 전에 알 수 없는 때문에 봉투 막 엽록체에서 중요 한 역할을 재생 하는 동안 사소한 엽록체 구성 요소 (엽록체 단백질의 1-2%)를 나타냅니다. 신진 대사와 속^5,20. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 최근 분석에서 애기 3 엽록체 주요 구획의 구성 (즉, 기질, thylakoids, 및 봉투 멤브레인 시스템)⁹. Proteomics 반 양적 접근 (스펙트럼 계산)에 따라,이 3 개의 엽록체 구획에 있는 단백질의 수백의 분할 평가할 수 있었습니다.

현재 프로토콜 애기에서 엽록체의 세 가지 주요 구획을 정화 수 있습니다, 하는 동안 추가 하위 구획은 엽록체에서 구별 가능한 이기도 합니다. 사실, 봉투 막 시스템의 내부 및 외부 봉투 막 (그림 1) 이루어집니다. 그러나, 우리의 지식 최선을 애기 엽록체에서 내부 및 외부 봉투 막 정화 하는 방법을 설정할 수 있다. 내부 및 외부 봉투 막 시금치 완두콩 또는^{21 22} 엽록체에서 정화 될 수 있다. 애기 의 주요 제한 시작 물자의 제한 금액에서 주로 발생 합니다. (요구 하는 이미 성장 챔버에 1 m² 표면) 애기 잎 500 g에서 시작만 100 µ g 봉투 단백질의 정화 수 있습니다. 다른 한편으로, 그것은 쉽습니다 시작으로 시금치의 5-10 k g 시장, 많은 양의 엽록체⁸ 을 정화 하 고이 자료에서 봉투 단백질의 3 ~ 10 밀리 그램의 항복으로 끝에서 나뭇잎.

같은 thylakoid 하위 구획에 대 한 사실 이다. 실제로, thylakoids 빛의 만들어진다 막 소포 (lamellae) 및 밀도 구조 (grana) (그림 1). 특정 프로토콜 애기^23,24에이 2 개의 구획을 구별할 수 있습니다. 우리 다시, 최근 이러한 두 개의 하위 구획²⁴에 단백질을 인벤토리 양이 많은 proteomics 분석을 바탕으로. 이러한 접근 문학, 깊이 있는 조사와 검증, 또는 가설을 제안 하는 위치에 대 한, subplastidial thylakoid 단백질의 수백의 허용. 그러나, thylakoids의 곡선된 여백에 추가 막 microdomains 존재는 중요 하다. 이 지 하위 구획, 또는 plastoglobules, thylakoid 막에 영구적으로 결합 하는 고 단백질²⁵의 특정 집합을 포함. 현재 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 불가능 따라서 다른 thylakoid 구성 요소에서이 특정 단백질을 구별 하.

일부 정품 (잘 알려진) 봉투, 기질, 또는 thylakoid 구성 요소는 검색 된 단백질의 목록에서 아직 부족 한. 타겟된 생 화 학적 및 면역 분석, 함께 MS 감도의 지속적인 개선의 다양 한 하위 구획의 구성의 완전 한 레 퍼 토리로 엽록체 콘텐츠를 다시 하는 게 큰 도움이 될 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Percoll	GE Healthcare	17089101
Tricine	Roth	6977.2
Sorbitol	Roth	6213.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	H5032
NaHCO3	Roth	8551.1
Bovine serum albumin (BSA)	Roth	8076.5
MgCl2	Roth	2189.1
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzamidine	Sigma	B6506
ε-amino caproic acid	Fluka	21530
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Roth	6979.3
Sucrose	Roth	9286.2
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide	Roth	3029.1
Tris	Fisher	BP152-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Roth	1057.1
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T-8133
Ammonium persulfate (APS)	Roth	9592.1
Glycerol	Roth	3783.1
Bromophenol blue	USB	US12370
Glycin	Roth	3908.3
Gel staining medium	Clini-sciences	GEN-QC-STAIN
Ethanol	CARLO ERBA	528151
NaCl	Euromedex	1112-A
Triton X-100	Promega	H5141
Fat-free milk powder	Régilait
HCl	Fisher	H/1150/PB15
KOH pellets	Sigma	1.05012
NaOH pellets	CARLO ERBA	480507
Anti-HMA1 antibody		Seigneurin-Berny et al, 2006	Used at a 1:1000 dilution
Anti-KARI antibody		Ferro et al, 2010	Used at a 1:1000 dilution
Anti-LHCP antibody		Vallon et al, 1991	Used at a 1:25,000 dilution
P-coumaric acid	Sigma	C-9008
Luminol (3-aminophalhydrazin)	Fluka	9253
Dimethyl sulfoxide (DMSO).	Sigma	D5879
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases	Puteaux	162135
A. thaliana seeds			Around 30 mg of seeds for a whole case
Compost "Floragard"	Puteaux	16311770
Growth rooms			12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s.
Muslin or cheesecloth	Raffin	70116	80-cm-large
Nylon blutex 50 μm aperture	Tripette et Renaud, Sailly Saillisel		50 μm aperture
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity	Waring Blender
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles)	Beckman Coulter
Beckman JA-20 rotor	Beckman Coulter
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes)	Sorvall instruments
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes)	Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes)	Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)	Beckman Coulter
Ultracentrifuge (Beckman L7)	Beckman Coulter
Centrifuge (Beckman JSE-06D18)	Beckman Coulter
Microcentrifuge	Eppendorf 5415D or equivalent
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.
Nitrocellulose membranes	BA85, Schleicher and Schuell
Filter paper	3MM, Whatman, Maidstone
Liquid nitrogen
Peristaltic pump	Gilson
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).	Bio-Rad Protean 3 or equivalent
System for protein transfer to nitrocellulose membranes	Bio-Rad Protean 3 or equivalent