Подготовка хлоропласта суб отсеков от Arabidopsis для анализа белка локализации Immunoblotting или протеомики

Резюме

Здесь мы опишем способ очистить нетронутыми хлоропластов Arabidopsis листья и их три основных суб отсеков (конверт, стромы и тилакоидов), с помощью сочетания дифференциального centrifugations, непрерывной Percoll градиенты, и разрывными сахарозы градиенты. Этот метод является ценным для subplastidial и внутриклеточных Локализация белков immunoblotting и протеомики.

Аннотация

Хлоропластов являются основными компонентами растительных клеток. Такие пластид выполнения многих важнейших функций, таких как ассимиляции углерода, серы и азота, а также синтез основных метаболитов. Эти органеллы состоят из следующих трех основных суб отсеков. Конверт, характеризуется двумя мембраны, окружает органелл и управления коммуникационных пластид с других клеточных компартментов. Строма является растворимы фазы хлоропластов и основной сайт, где углекислого газа преобразуется в углеводы. Тилакоидной мембраны является внутренней мембраны сеть, состоящая из Грано (плоский сжатых мешки) и ламели (менее плотной структуры), где oxygenic фотосинтез занимает место. Настоящий Протокол описывает шаг за шагом процедуры, необходимые для очистки, с помощью дифференциальной centrifugations и Percoll градиенты, нетронутыми хлоропластов Arabidopsis, и их фракционирование, используя сахарозу градиентов, в трех суб отсеков (то есть, конверт, стромы и тилакоидов). Этот протокол также содержит инструкции о том, как оценить чистоту этих фракций, с использованием маркеров, связанные в различных отсеках суб хлоропластов. Метод, описанный здесь ценно для локализации subplastidial белков с помощью immunoblotting, но и для субцеллюлярные и subplastidial протеомики и другие исследования.

Введение

Хлоропластов являются основными компонентами растительных клеток. Они являются производными от цианобактерий предка, который прошел endosymbiosis и в конечном итоге превратилась органелл в ходе эволюции^1,2. Такие органеллы содержат три основных отсеков (рис. 1). Конверт системы производится из внутренней и наружной мембраны, окружающие органеллы. Этот двойной мембраной Система содержит различных ферментов, участвующих в метаболизме липидов и пигменты и посвящен главным образом для управления связи между пластид и цитозоле. Он содержит различные транспортные системы, которые позволяют импорт ядерных кодировке белков и обмен ионов и метаболитов между цитозоле и хлоропластов, таким образом регулирующие основные метаболические функции завод ячейка^3,4 . Стромы, растворимы фазы хлоропластов, содержит ферменты цикл Кальвина (CO₂ ассимиляции), синтез различных метаболитов, включая аминокислоты и витамины и транскрипции и трансляции механизмов пластид. Тилакоидной мембраны представляет собой сеть широко организованной внутренней мембраны, где проходит свет этапа фотосинтеза. Таким образом хлоропластов являются местом, где основные метаболические пути происходят⁵.

Для того чтобы расшифровать новых регулирующих механизмов, которые управляют хлоропласта динамика и физиологии, определяя суб пластидная Локализация белков хлоропласта таким образом имеет решающее значение для поддержки целевых исследований, стремясь лучше понять функции белков в модели организмов⁶. Для того, чтобы получить доступ к подлинной subplastidial локализации этих белков, поэтому важно, чтобы начать с чистой subplastidial фракции (конверт мембраны, стромы и тилакоидов). В этом контексте, целью настоящего Протокола является очистить нетронутыми хлоропластов из листьев Arabidopsis , с использованием дифференциальной centrifugations и непрерывной Percoll градиенты и чтобы фракционировать их с использованием разрывных сахарозы градиентов, в трех суб отсеков (то есть, конверт, стромы и тилакоидов). Метод, описанный здесь также предоставляет инструкции для оценки чистоты очищенной суб organellar фракций, с использованием маркеров, связанные в различных отсеках суб хлоропластов. Этот протокол является ценным для локализации subplastidial белков, используя immunoblotting и для дальнейшего анализа очищенный фракций, с использованием масс-спектрометрия (МС)-на основе протеомических исследований.

протокол

1. Подготовка буферов, запасов решений и градиенты

1. Подготовить следующие акции решений, которые могут храниться до 6 месяцев при 4 ° C.
   1. Подготовка 1 Л Трицин буфер (1 M, рН 8,4) и буфер Трицин (1 M, рН 7,6). Отрегулируйте пэ-аш, добавив Кох окатышей.
   2. Подготовка 1 Л Этилендиаминтетрауксусная кислота (рН 8 ЭДТА, 0,5 М) и 3-(N-morpholino) пропан перфтороктановой сульфоновой кислоты (МОПЫ) буфера (1 M, pH 7,8). Отрегулируйте пэ-аш путем добавления NaOH окатышей.
   3. Подготовка 50 мл MgCl₂ (1 M).
   4. Подготовка 50 мл протеазы ингибиторы решения: phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF в изопропаноле, 100 мм), benzamidine гидрохлорида гидрат (100 мм) и ε-аминокислоты капроновая кислота (50 мм).
      Примечание: Хотя PMSF и амино капроновая кислота являются стабильными в растворе для месяцев при температуре 4 ° C, benzamidine раствор должен храниться при-20 ° C.
2. Подготовить следующие решения за день до эксперимента и хранить все решения при 4 ° C.
   1. Подготовка 4 L измельчения Средний рН 8,4, содержащие Трицин-Кох (20 мм, pH 8.4), сорбитол (0,4 М), ЭДТА (10 мм, pH 8) и NaHCO₃ (10 мм). Отрегулируйте пэ-аш путем добавления NaOH окатышей. Добавьте бычьим сывороточным альбумином (БСА) 0,1% (w/v) непосредственно перед использованием и хорошо перемешайте.
   2. Подготовка 500 мл моющего среднего (2 x) рН 7,6, содержащие Трицин-Кох (20 мм, pH 7,6), сорбитол (0,8 М), MgCl₂ (5 мм) и ЭДТА (2,5 мм). Отрегулируйте пэ-аш путем добавления NaOH окатышей. Разбавьте такое решение после подготовки градиентного раствора Percoll для получения среднего стиральные (1 x).
   3. Подготовка 200 мл Percoll раствора градиент для очистки хлоропласта путем смешивания Percoll с стиральная среднего (2 x) на равных громкость чтобы получить окончательное решение на 50% (v/v) Percoll / сорбита 0,4 М.
   4. Подготовка 50 мл растворов сахарозы для хлоропластов фракционирование путем смешивания МОПЫ (10 мм, pH 7,8), MgCl₂ (4 мм) и различных концентраций сахарозы (0,3 М, 0,6 М и 0,93 М).
3. Подготовьте следующие градиентов и буферов до начала эксперимента.
   1. Подготовить шесть трубы Percoll градиентов (каждый содержит 30 мл 50% Percoll / сорбита 0,4 М) центрифугированием при 38,700 x g 55 мин при 4 ° C. Держите тормоза от для предотвращения смешивания градиентов. После центрифугирования Храните пробирки, содержащие предварительно градиенты в холодной комнате до использования.
   2. Подготовить четыре трубы сахарозы градиентов, с каждого градиента, формируется из трех следующих сахарозы слоев: 3 мл 0,93 М, 2,5 мл 0,6 М, и 2 мл 0,3 М сахарозы. Тщательно наложение каждый слой, с использованием перистальтического насоса начиная с 0,93 М в нижней части и заканчивая 0,3 М в верхней.
   3. Подготовка 50 мл гипотонический среды лизис хлоропластов, содержащие МОПЫ (10 мм, pH 7,8), MgCl₂ (4 мм), PMSF (1 мм, в изопропиловый спирт), benzamidine гидрохлорида гидрат (1 мм) и ε-аминокислоты капроновая кислота (0,5 мм). Сохранить буфер на льду до использования.
   4. Подготовка 50 мл мембраны отмывающего буфера, содержащий МОПЫ (10 мм, pH 7,8), PMSF (1 мм), benzamidine гидрохлорида гидрат (1 мм) и ε-аминокислоты капроновая кислота (0,5 мм). Сохранить буфер на льду до использования.

2. рост и уборки листьев Arabidopsis

1. Для роста растений Arabidopsis подготовиться 4 большие пластиковые поддоны (общей площадью 0,5 – 1 м²) Arabidopsis растений, посев семян в каждом Пан 30 мг. Растут растения арабидопсис 5 недель в 12-h свет цикла при 23 ° C (день) / 18 ° C (ночь) с интенсивностью освещения 150 мкм m s^{-2 -1}.
2. Инкубируйте растений в темной и холодной комнате (4 ° C) на ночь до эксперимента (чтобы уменьшить количество гранул крахмала в хлоропластах).
3. Предварительно весят стакан емкостью 1 Л, а затем поместите его на льду перед началом уборки листьев материала.
4. Урожай листьев Arabidopsis , избегая почвы (компост). Повторно взвесить стакан и запишите Вес ткани.
   Примечание: 400-500 г листьев материала, как ожидается от четырех кастрюли.
5. Однородный листья в холодной комнате с 2 Л шлифовальных буфера (добавить BSA перед использованием) три раза / 2 s каждый раз, в блендере на высокой скорости.
6. Фильтр огневки в холодной комнате, используя 4 слоев муслин и один слой нейлона blutex. Осторожно выжмите огневки листья внутри муслина/нейлон blutex чтобы извлечь все жидкости.
7. Восстановите оставшиеся ткани в чашке блендер для второй добычи. Повторите шаги 2.5 и 2.6, используя 2 Л шлифование средних и новые 4-5 слоев муслина (в холодной комнате).

3. очистка сырой хлоропластов, с помощью дифференциального центрифугирования

1. Поровну распределить сырой сотовый экстракт в шесть 500 мл бутылки и место бутылки на льду перед центрифугированием. Центрифуги для 2 мин, как только достигается максимальная скорость (2070 x g) (максимальное ускорение и тормоз, 4 ° C).
2. Осторожно удалить супернатант.
3. Аспирационная оставшиеся супернатанта, с помощью водяного насоса и держать гранулы, содержащие концентрации нефти хлоропласты на льду.
4. Нежно ресуспензируйте окатышей, добавив минимальный объем стирки среднего (1 x) (конечный объем комбинированных хлоропласта суспензий = 36 мл) с помощью кисточки или изогнутые пластиковый шпатель. Использование пипетки 10 мл для добавления 3 мл моющего среднего в каждой бутылке.
   Примечание: Не используйте пипетки с очень тонкой советы чтобы избежать поломки хлоропластов. Кроме того вырежьте синий наконечник пипетки с лезвием бритвы для создания больших отверстие.
5. Сбор ресуспензированы хлоропластов в одной из труб с помощью пипетки 10 мл. Осторожно Смешайте, инвертирование трубки для получения однородной подвеска перед погрузкой на Percoll градиенты.

4. Очистка нетронутыми хлоропласты на постоянной Percoll градиент

1. Медленно нагрузки 6 мл суспензии хлоропласта на вершине каждого из шести Percoll градиенты с помощью пипетки 10 мл во избежание поломки хлоропластов.
2. Центрифуга градиентов для 10 мин на 13,300 x g, 4 ° C, с помощью ротора размахивая ведро.
   Примечание: Ускорение должно быть медленным, и должен быть отключен тормоз (тормоза покинуть или медленно замедления) для предотвращения смешивания Percoll градиентов.
3. Аспирационная Верхний этап, который содержит сломанной хлоропластов и нетронутыми митохондрий, с помощью водяной насос и затем извлечь нетронутыми хлоропластов в нижней фазе (широкая полоса темно зеленый) с 10 мл пипетки. Будьте осторожны, чтобы не аспирационная ядер и ячейки мусор (находится в нижней части трубки) с нетронутыми хлоропласты (рис. 2A).
4. Разбавьте 3-4 раза нетронутыми хлоропласта подвеска с Отмывающий буфер (1 x). Центрифуги для 2 мин, как только достигается максимальная скорость (2070 x g, 4 ° C) (максимальное ускорение и тормоз).
5. Тщательно удалить супернатант.
6. Полностью аспирационная оставшиеся супернатант с водяной насос и держать Пелле концентрированных нетронутыми хлоропласты на льду.
7. До лизис хлоропластов Держите Алиготе нетронутыми хлоропласта фракции в приблизительно 1 мл промывки среднего (1 x) для дальнейшего анализа с использованием натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) и Западный blotting. Храните небольшой аликвота этих нетронутыми хлоропластов для определения концентрации белка. Сохраните нетронутыми хлоропласта фракция в жидком азоте для дальнейших экспериментов.

5. lysis нетронутыми хлоропластов, используя гипотонический буфер и очистки хлоропласта суб отсеков на разрывные сахарозы градиенты

1. Лизируйте очищенный нетронутыми хлоропластов, resuspending гранулы в гипотонический среды, которая содержит ингибиторы протеазы (окончательный объем не должен превышать 12 мл).
   Примечание: От этого шага, использование пипетки с тонкой советы (синий советы) возможен, поскольку целостности хлоропластов больше не важно, (дозирование хлоропластов вверх и вниз до тех пор, как гранулы не высокомобильна полностью). Arabidopsis хлоропластов являются очень хрупкими, (по сравнению с хлоропластах гороха, например) и их лизис почти немедленно после инкубации в гипотонический среде.
2. Медленно нагрузки 3 мл лизированных хлоропластов на вершине каждой предварительно сахарозы градиенты с использованием перистальтического насоса.
3. Ультрацентрифуги градиентов для 1 ч при (70 000 x g, 4 ° C). Баланс пары труб с использованием гипотонический средних буфера до центрифугирования.
4. Тщательно восстановить растворимые белки стромы, закупорить этапа верхнего градиента (3 мл от каждого градиента) (рис. 2B). Возьмите Алиготе для определения концентрации белка⁷. Храните стромы в жидком азоте для дальнейших экспериментов.
5. Аспирационная этапа оставшиеся верхние каждого градиента до желтой полосой, с помощью водяного насоса.
6. Пипетки (примерно 1 мл от каждого градиента) для извлечения желтая полоса (конверт). Бильярд конвертов в одной из труб.
7. Удалите оставшиеся стадии каждого градиента до тилакоидов Пелле, с помощью водяного насоса.

6. мытье и концентрации тилакоидов и конверт мембранных систем

1. Ресуспензируйте тилакоидов окатышей (сырые окатыши) в минимальный объем (2 mL) мембраны отмывающего буфера (1 x) (с ингибиторами протеазы).
2. Разбавить конверт и тилакоидов подвески 3-4 раза в среде стирки мембрана (регулировка громкости по 10 мл) и ультрацентрифугирования за 1 ч при (110 000 x g, 4 ° C). Баланс пары труб с помощью мембраны отмывающего буфера перед центрифугированием.
3. Тщательно аспирационная supernatants, с помощью водяного насоса.
4. Добавьте примерно 100 мкл мембраны отмывающего буфера (с ингибиторами протеазы) конверт Пелле. Возьмите Алиготе для определения концентрации белка⁷. Храните очищенную конверт мембраны подготовки в жидком азоте.
5. Ресуспензируйте тилакоидов Пелле в 3 мл мембраны отмывающего буфера (с ингибиторами протеазы). Возьмите Алиготе для определения концентрации белка⁷. Хранить тилакоидной мембраны фракция в жидком азоте.

Результаты

Последовательные шаги процедуры приводит к очищенной хлоропластов и их суб отсеков возобновил на рисунке 2. Percoll градиент (рисунок 2A) позволяет отличить нетронутыми хлоропластов от сломанной хлоропластов и митохондрии (верхней части градиента) или ядер и ячейки мусор (внизу градиент). После разрыва очищенный Percoll органеллы благодаря осмотическим шоком результирующей дроби разделены на градиент сахарозы (рис. 2B). Стромы (растворимые частью хлоропластов) плавает на поверхности сахарозы градиента. Мембрана везикулы света конверт восстанавливаются как дискретные желтая полоса в интерфейсе 0,6/0,93 М сахарозы. Тяжелая тилакоидной мембраны везикулы сосредоточены в нижней части трубки. После восстановления, мытья и концентрации фракций двух мембраны количественно белки и состав всех четырех фракций анализируется на SDS-PAGE (рис. 2 c). Полосы загружаются на основе равных белка (20 мкг каждая очищенная фракция). Зная, что хлоропласты содержат только 1% конверт белков и 50% белков из стромы или Тилакоиды, это, как правило, переоценивают перекрестного загрязнения очищенного конверт препаратов с другими суб отсеков хлоропластов. Однако этот метод позволяет обнаружить мизерных количествах кросс загрязнять конверт фракция белков. Маркеры от каждого отсека (т.е., обильные протеины) очень полезны при оценке загрязнения фракций. Действительно фракций мембрана тилакоида и конверт, как ожидается, содержат очень низкие объемы большие субъединицы Рибулозобисфосфаткарбоксилаза (RBCL), наиболее обильные белка из стромы (50 kDa). Сломанной хлоропластов можно легко отличить от нетронутыми хлоропласта из-за потери этого стромальные белка⁸. Свет, уборки комплекс белков (LHCP) — 25 кДа обильные тилакоидов компоненты, которые должны едва (менее 3%), загрязнить конверт мембраны⁹. Наконец, фосфат Триозы фосфат вступают (TPT) является 30-kDa белок, который виден только в очищенной конверт фракции из-за его сильного обогащения (т.е., 50-100 x) в конверт фракции по сравнению с всего хлоропласта экстрактов. Используя метод, описанный здесь, суб отсеков хлоропластов, как правило, плохо кросс загрязненных подтверждено с помощью Западной блот анализ (Рисунок 2D) опираясь на антитела, направленные против известных маркеров всех трех суб отсеков: растворимые ketol кислоты reductoisomerase (Кари) от стромы, конверт хлоропласта медь АТФаза (HMA1) и свет, уборки комплекс белков (LHCP) от тилакоидной мембраны. Перекрестного загрязнения трех суб отсеки могут быть количественно с помощью immunoblotting и масс спектрометрии анализов⁹. В то время как стромы обычно не загрязнены конверт или тилакоидных фракций, очищенный конверт фракции содержат 3% тилакоидных белков и до 10% белков от стромы. Белки из стромы плохо загрязнить тилакоидной мембраны (менее 1%), но тилакоидов содержат до 3% конверт мембранных белков. Больше, чем иметь решающую роль в выявлении подлинных subplastidial расположение хлоропласта белков, нынешний метод таким образом также ограничивает ошибочным выводам о локализации subplastidial белков, обусловленные крест загрязнений.

Рисунок 1: представитель схема суб отсеков хлоропласта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Очистка нетронутыми хлоропластов и их три основных югу отсеков с использованием Percoll и сахароза градиентов. A. Percoll градиент позволяет разделение сломанной и нетронутыми хлоропластов. Б. градиент сахарозы, позволяя разделение стромы, конверт и тилакоидных фракций. C. Представитель SDS-PAGE белков от нетронутыми хлоропластов и их три основных суб отсеков, позволяя визуализировать обильные маркеры от каждого суб отсека. Каждый Лейн содержит 10 мкг белков. Маркеры молекулярный вес: RBCL, большой субблок Рибулозобисфосфаткарбоксилаза (маркер для строма); ТПТ, фосфат/Триозы фосфат вступают (маркер для конверта); LHCP, легкая уборка комплекс белков (маркер для тилакоидов). D. Западная помарка эксперименты, позволяющий обнаружить конкретные маркеры (с использованием специфических антител) из каждого суб отсека: хлоропласта конверт меди АТФазы HMA1¹⁰, свет, уборки сложные белки LHCP от тилакоидов мембраны¹¹и ketol кислоты reductoisomerase Кари из стромы⁹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Настоящей статьи направлен на подробно шаг за шагом протокол, используемый для очистки хлоропласты (и их вложенные отсеков) от Arabidopsis thaliana. Поскольку доступность его полного генома почти два десятилетия назад и большие коллекции мутантов вставки доступны для сообщества Arabidopsis теперь широко признается как модель завод. Однако в то время как этот завод был отлично приспособлены для генетических подходов, завод ученых, необходимые для адаптации биохимических и физиологических инструменты для этой новой модели. Протоколы, позволяя таким образом очистить фотосинтетически активные хлоропластов из листьев устоявшихся биохимические модели как шпинат¹² или гороха¹³ пришлось быть адаптированы. Первый метод, описывая очистки Arabidopsis хлоропластов был опубликован в 1998 году¹⁴, непосредственно перед выпуском последовательности геном арабидопсиса . Несколько лет спустя, простые методы для изоляции Arabidopsis хлоропластов совместимы с целью анализа в vitro импорта белков в очищенной органеллы исследований были сделаны доступно^15,16. Однако эти методы не позволяют сочетать высокий уровень чистоты и сохранение фотосинтетической активности очищенный хлоропластов. Совсем недавно¹⁷, быстрый метод был создан, который основывается на использовании Percoll градиенты и позволяет сохранить почти 90% от фотосинтеза измеряется в начальный листья арабидопсиса.

Протокол, описанные здесь позволяет очистить Arabidopsis хлоропласты на превосходном уровне чистоты. Действительно, иммунологические обнаружения загрязнителей из других клеточных компартментов показал, что очищенный органеллы лишены митохондрий и маркеры плазматическую мембрану^9,10. Этот протокол был также эффективно очищают хлоропластов от нескольких Arabidopsis экотипов¹⁸, как Columbia (Col) или Wassilewskija (WS), то есть, экотипов, которые были использованы для генома или выразили последовательности Теги (ЭБТ) последовательности проекты, но также генерировать T-ДНК вставки мутантов в арабидопсиса. Другими словами когда протеомики исследования должны быть выполнены, настоящий Протокол совместим с этих двух экотипов ссылку от арабидопсиса. Наконец доходность хлоропластов, используя настоящий протокол похож на полученные при запуске из шпината или гороха листья(т.е. 3%, как измерено от содержания хлорофилла в Percoll очищенная хлоропласта по сравнению с общей Хлорофилл сумма в начиная листья). С точки зрения белки урожайность находится недалеко от 50 мг хлоропласта белков, когда органеллы очищаются от 500 g 5-недельных Arabidopsis листьев.

Для достижения такой хороший урожай (и целостности хлоропласта), однако следует обратить особое внимание на несколько шагов при использовании настоящего Протокола. Хлоропластов в проростках Arabidopsis является чрезвычайно хрупкой структурой (это не в случае хлоропластах гороха, например). Чтобы избежать крупномасштабного разрушения органеллы во время очистки таким образом требуется особое внимание. Количество и размер гранул крахмала в хлоропластах имеют решающее значение для подготовки нетронутыми хлоропластов. Действительно хлоропласты, содержащих большие крахмала зерна обычно будет нарушена во время первоначального дифференциального centrifugations шаги стремится сконцентрировать фракций нефти хлоропласта¹². Таким образом растения должны храниться на ночь в темной и холодной комнате (4 ° C) до эксперимента, чтобы уменьшить количество крахмала.

Новых пользователей настоящего Протокола может быть соблазн начинать с больших количеств материала листьев (огромные розеток из старых Arabidopsis растений с более крупные листья) пытается повысить восстановление очищенной хлоропластов. Однако, в наших руках начиная от молодых листьев (5-неделю Старый) является наилучший компромисс объединить урожайности, чистоты и целостности очищенный органеллы. Действительно слишком старые листья сильно обогащенный в фенольных соединений, которые были показаны, чтобы иметь негативное воздействие на целостность хлоропласта¹⁹.

Наконец первоначальное извлечение шаг (шлифовка ткани) – еще один важный шаг. Процесс наложения должно быть ограничено до нескольких секунд. Как указывалось выше, новых пользователей может возникнуть соблазн использовать больше смешивания, таким образом, ожидая сильно улучшить доходность очищенный органеллы. Однако если больше смешивания эффективно выпускает больше материала из листьев, похоже, что доля сломанной хлоропластов быстро возрастает в экстракте сырой ячейки. Вследствие этого высокий коэффициент сломанной нетронутыми хлоропластов в среде дальнейшие шаги очистки (разделение на подъемах Percoll) сильно пострадавших и доходность очистки неожиданно ниже.

Наличие конкретных протоколов для очистки органеллы позволили серии высокой пропускной способности на основе протеомики эксперименты проводятся на образцах хлоропластов. Эти данные были доступны в нескольких общедоступных баз данных⁶, обеспечивая для биологов в области точной субцеллюлярные (и subplastidial) локализации для многих белков хлоропластов. Это было особенно актуально для конверт белков, чья личность и местонахождение основном оставалась неизвестной до этих анализов, поскольку конверт мембраны представляют собой незначительные хлоропласта компонент (1-2% белков хлоропластов) играя ключевую роль в хлоропласте метаболизм и биогенеза^5,20. Используя протокол, описанный здесь, мы недавно проанализировали состав трех главных хлоропласта отсеков от выращивания арабидопсиса (т.е., стромы, Тилакоиды и конверт мембраны системы)⁹. На основе полуколичественного протеомики подхода (спектральный подсчета), мы смогли оценить секционирование сотни белков в этих трех отсеков хлоропластов.

Хотя настоящий протокол позволяет очистить три основных отсеков хлоропласта от Arabidopsis, это также можно выделить дополнительные вложенные отсеков в хлоропластов. Действительно конверт мембраны системы состоит из внутренней и внешней оболочки оболочки (рис. 1). Однако в меру наших знаний, метод для того чтобы очистить внутренний и внешний конверт мембраны из хлоропластов Arabidopsis остается должен быть создан. Внутренний и внешний конверт мембраны могут быть очищены от шпината²¹ или гороха²² хлоропластов. Основное ограничение Arabidopsis главным образом результаты от ограничения количества исходного материала. Начиная с 500 г листьев арабидопсиса (который уже требует 1 м² поверхности в камере роста) позволяет очищать только 100 мкг конверт белков. С другой стороны это легко начать с 5-10 кг шпинат уходит с рынка, чтобы очистить большое количество хлоропластов⁸ и покончить с выходом 3 до 10 мг конверт белков из этого материала.

То же самое верно для тилакоидов суб отсеков. Действительно, тилакоидов изготовлены из света мембрана везикулы (ламели) и плотной структуры (Грана) (рис. 1). Различать эти два отделения в проростках Arabidopsis^23,24доступны конкретные протоколы. Опять же основываясь на анализе количественных протеомики, мы недавно опись белков, присутствующих в эти два подпункта отсеков²⁴. Эти подходы, а также углубленное исследование литературы, Допускается проверка, или предлагая гипотезы, subplastidial расположение сотен тилакоидных белков. Однако важно отметить, что дополнительные мембраны microdomains присутствуют на изогнутые поля тилакоидов. Эти липопротеинов суб отсеков, или plastoglobules, постоянно соединены тилакоидной мембраны и содержат определенный набор белков²⁵. Используя настоящий Протокол, он таким образом не позволяет отличить эти специфические белки от других компонентов тилакоидов.

Некоторые подлинные (хорошо известных) конверт, строма или тилакоидов компоненты по-прежнему отсутствуют из списка обнаруженных белков. Вместе с целевых биохимические и иммунологические анализы постоянное улучшение чувствительности MS будет иметь большую помощь, чтобы вернуться к хлоропласта содержание к полный репертуар состава его различных суб отсеков.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Percoll	GE Healthcare	17089101
Tricine	Roth	6977.2
Sorbitol	Roth	6213.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	H5032
NaHCO3	Roth	8551.1
Bovine serum albumin (BSA)	Roth	8076.5
MgCl2	Roth	2189.1
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzamidine	Sigma	B6506
ε-amino caproic acid	Fluka	21530
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Roth	6979.3
Sucrose	Roth	9286.2
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide	Roth	3029.1
Tris	Fisher	BP152-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Roth	1057.1
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T-8133
Ammonium persulfate (APS)	Roth	9592.1
Glycerol	Roth	3783.1
Bromophenol blue	USB	US12370
Glycin	Roth	3908.3
Gel staining medium	Clini-sciences	GEN-QC-STAIN
Ethanol	CARLO ERBA	528151
NaCl	Euromedex	1112-A
Triton X-100	Promega	H5141
Fat-free milk powder	Régilait
HCl	Fisher	H/1150/PB15
KOH pellets	Sigma	1.05012
NaOH pellets	CARLO ERBA	480507
Anti-HMA1 antibody		Seigneurin-Berny et al, 2006	Used at a 1:1000 dilution
Anti-KARI antibody		Ferro et al, 2010	Used at a 1:1000 dilution
Anti-LHCP antibody		Vallon et al, 1991	Used at a 1:25,000 dilution
P-coumaric acid	Sigma	C-9008
Luminol (3-aminophalhydrazin)	Fluka	9253
Dimethyl sulfoxide (DMSO).	Sigma	D5879
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases	Puteaux	162135
A. thaliana seeds			Around 30 mg of seeds for a whole case
Compost "Floragard"	Puteaux	16311770
Growth rooms			12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s.
Muslin or cheesecloth	Raffin	70116	80-cm-large
Nylon blutex 50 μm aperture	Tripette et Renaud, Sailly Saillisel		50 μm aperture
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity	Waring Blender
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles)	Beckman Coulter
Beckman JA-20 rotor	Beckman Coulter
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes)	Sorvall instruments
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes)	Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes)	Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)	Beckman Coulter
Ultracentrifuge (Beckman L7)	Beckman Coulter
Centrifuge (Beckman JSE-06D18)	Beckman Coulter
Microcentrifuge	Eppendorf 5415D or equivalent
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.
Nitrocellulose membranes	BA85, Schleicher and Schuell
Filter paper	3MM, Whatman, Maidstone
Liquid nitrogen
Peristaltic pump	Gilson
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).	Bio-Rad Protean 3 or equivalent
System for protein transfer to nitrocellulose membranes	Bio-Rad Protean 3 or equivalent