qKAT: Semi-automated כמותיים הקלדה של הרוצח-תא גנים קולטני דמוי נוגדן

Jyothi Jayaraman; Vitalina Kirgizova; Da Di; Christopher Johnson; Wei Jiang; James A. Traherne

doi:10.3791/58646

Summary

תא הרג כמותיים קולטן דמוי אימונוגלובולינים (קיר) חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT) היא שיטה פשוטה, תפוקה גבוהה וחסכונית להעתיק מספר גנים "קיר" סוג של היישום שלהם במחקרים האגודה האוכלוסייה ומחלות.

Abstract

תא הרג בנוגדנים דמוי קולטנים (KIRs) הם קבוצה של רצפטורים מעכבות, הפעלת המערכת החיסונית, על הרוצח הטבעיים (NK) ותאי T, מקודד על ידי מקבץ רב שלבית של גנים על כרומוזום 19. ליגנדים מאופיין ביותר שלהם הם מולקולות אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים מקודדים בתוך histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) לוקוס על כרומוזום 6. יש עדויות משמעותיות כי הם לשחק תפקיד משמעותי חסינות, רבייה, ההשתלה, שהופך אותו מכריע יש טכניקות יכולים במדויק גנוטיפ אותם. עם זאת, הומולוגיה גבוהה-רצף, כמו גם כמו allelic, וריאציה מס העתק, להקשות על שיטות עיצוב יכול בצורה מדויקת ויעילה גנוטיפ כל הגנים "קיר" . שיטות מסורתיות מוגבלים בדרך כלל את הרזולוציה של נתונים שהושגו, תפוקה, משתלמת, הזמן שנדרשו עבור התקנה והפעלה הניסויים. אנו מתארים שיטה הנקראת כמותיות וקיר חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT), אשר היא שיטה תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת מולטיפלקס תפוקה גבוהה שיכול לקבוע את מספרי עותק ג'ין עבור כל הגנים במיקומה "קיר" . qKAT היא שיטה פשוטה תפוקה גבוהה שיכול לספק ברזולוציה גבוהה וקיר עותק מספר נתונים, אשר יכול לשמש עוד יותר להסיק הווריאציות haplotypes רב-צורתיות מבנית, שמעבירים אותם. מספר זה העתק נתונים haplotype יכול להועיל במחקרים על עמותות המחלה בקנה מידה גדול, גנטיקה של אוכלוסיות, כמו גם חקירות על הביטוי ואינטראקציות פונקציונלי בין קיר הלע.

Introduction

בבני אדם, הקולטן בנוגדנים כמו רוצח("קיר") לוקוס ממופה על הזרוע הארוכה של כרומוזום 19 בתוך הקולטן ליקוציט מורכבים (LRC). לוקוס זה בסביבות 150 kb אורך וכוללת 15 וקיר הגנים מסודרים ראש זנב. לוקוסים וקיר הידועות כיום הם KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, שני pseudogenes, KIR2DP1 ו- KIR3DP1. הגנים וקיר קידוד עבור דו מימדי (2D) ואת רצפטורים תלת מימדי (3D) בנוגדנים כמו תחום עם קצר (S; הפעלת) או ארוכים (L; מעכבות) cytoplasmic זנבות, הבאים לידי ביטוי על ידי תאים הרוצח הטבעיים (NK) קבוצות משנה של T תאים. וריאציה מספר עותק הציג בתוך הצורות לוקוס וקיר haplotypes מגוונת עם תוכן משתנה ג'ין¹. Non-allelic רקומבינציה הומולוגית (לבנון), בהנחייתם של סידור הגן ראש זנב קרוב והומולוגיה גבוהה-רצף, הוא המנגנון המוצע להיות אחראי על ההשתנות haplotypic. מעל 100 haplotypes שונות דווחו אוכלוסיות ברחבי העולם¹^,²^,³^,⁴. כל haplotypes האלה יכול להיות מחולק לשתי קבוצות עיקריות: A ו- B haplotypes. A haplotype מכיל גנים קיר 7: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, ואשר הינם גנים וקיר מעכבות, את הפעלת "קיר" ג'ין KIR2DS4. עם זאת, למעלה עד 70% של אנשים ממוצא אירופי homozygous על קיר haplotype A באופן בלעדי לשאת צורה פונקציונלי "מחיקת" של⁵^, KIR2DS4⁶. כל השילובים גנים אחרים וקיר בצורת haplotypes קבוצה B, כולל לפחות באחד מהגנים קיר מסוים KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, KIR2DL5, וכוללים בדרך כלל שניים או יותר גנים "קיר" הפעלת.

הלע מחלקה אני מולקולות זוהו על ליגנדים עבור מסוימים רצפטורים מעכבים (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1), הפעלת קולטנים (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, ו KIR3DS1), KIR2DL4, אשר הוא ייחודי קיר מכיל של זנב ארוך cytoplasmic כמו אחרים קולטנים וקיר מעכבות, אך גם יש משקע הטעון חיובית ליד המחשבים חוץ-תאית אשר נפוצה תכונה של אחרים הפעלת קולטני "קיר" . השילוב של משתנים בתוך הגנים "קיר", הגנים הלע משפיע על האינטראקציה ליגנד לקולטן הזה צורות אפשריות NK תא תגובתיות-ברמת הפרט⁷^,⁸. עדויות ממחקרים שיוך גנטי ציין כי וקיר משחק תפקיד ההתנגדות ויראלי (למשל., וירוס הכשל החיסוני האנושי [HIV]⁹ ו הפטיטיס C וירוס [בזכות]¹⁰), ההצלחה של השתלת¹¹, הסיכון של הפרעות הריון¹²^,הצלחה הרבייה¹³, הגנה מפני נסיגה לאחר¹⁴^,(HSCT) השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic¹⁵^, ¹⁶, את הסיכון של סרטן¹⁷.

השילוב של high-רצף הומולוגיה, allelic ואתגרים haplotypic גיוון מתנות במשימה של מדויק genotyping וקיר גנים. שיטות קונבנציונליות כדי להקליד "קיר" הגנים כוללים רצף ספציפי פריימר (SSP) פולימראז תגובת שרשרת (PCR)¹⁸^,¹⁹^,²⁰, רצף ספציפי oligonucleotide בדיקה PCR (SSOP)²¹, ו לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS)²². החסרונות של טכניקות אלה הן רק הם מספקים תובנה חלקית גנוטיפ של הפרט אך גם מפרך כדי לבצע. לאחרונה הוחל הדור הבא רצפי (הגדרות) כדי להקליד את לוקוס וקיר במיוחד. בעוד ששיטה זו היא רבת עוצמה, זה יכול להיות יקר כדי להפעיל, וזה זמן רב כדי לערוך בדיקות מעמיקה בניתוח ונתונים.

qKAT היא שיטת ה-PCR כמותי תפוקה גבוהה. בעוד שיטות קונבנציונליות מפרך וצורך, שיטה זו מאפשרת להפעיל כמעט 1,000 דגימות דנ א (gDNA) גנומית בחמישה ימים ונותן של גנוטיפ "קיר" , כמו גם את מספר עותק גנטי. qKAT מורכב עשר תגובות מולטיפלקס, שכל אחד מהם מטרות שני לוקוסים וקיר והעתק אחד הגנים הפניה של מספר עותק קבוע של הגנום (STAT6) משמש כימות היחסי של הגן וקיר מספר²³. Assay הזה שימש בהצלחה בלימודי מעורבים לוחות אוכלוסייה גדולה לבין המחלה המפחידה על מחלות זיהומיות כגון בזכות, מחלות אוטואימוניות כמו בסוכרת מסוג 1, הריון הפרעות כגון רעלת, וכן מתן גנטי לגורם המרכזי עליו מושתתת על מחקרים להבנת NK תא פונקציה¹^,⁴^,²⁴^,²⁵^,²⁶.

Protocol

1. ציפוי מתוך ה-DNA והכנה

לכמת במדויק את הריכוז gDNA שימוש בכלי spectrophotometric או fluorometric.
לדלל את הדנ א כדי ng/µL 4 על צלחת עמוקה 96-טוב-טוב. כוללים אחד לפחות שליטה מדגם gDNA עם מספר עותק הידוע ושליטה שאינם מתבנית אחת.
Centrifuge הלוחות 96-ובכן ב x 450 גרם למשך 2 דקות.
שימוש בכלי טיפול בנוזלים, לוותר על כל מדגם ב ארבע פעמים על גבי לוחות qPCR 384-ובכן כך בכל טוב יש 10 ng של DNA (2.5 µL טוב). להכין לפחות 10 צלחות 384-. ובכן, אחד עבור כל תגובה qKAT.
אם הוא להיות בגליל gDNA באמצעות גלופה 96-ובכן אחד או יותר, לבצע שטיפה מלא בנפח 2% אקונומיקה ומים הנדסה גנטית כדי לנקות את המחטים של הנוזל טיפול מערכת בין כל צלחת 96-ובכן דוגמאות gDNA.
מילה נהדרת ה-DNA על ידי המקננת הלוחות 384-ובכן באזור נקי בטמפרטורת החדר במשך לפחות 24 שעות.

2. הכנת תחל וזונדים

הערה: qKAT מורכב תגובות מולטיפלקס עשר. כל התגובה כוללת שלושה זוגות פריימר וזונדים שלושה התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית המדגישים במיוחד שני גנים וקיר וג'ין הפניה אחת. הגששים שפורסמו בשנת ג'יאנג ואח²⁷ שונו כך oligonucleotides מסומנות כעת עם צבעי אטו מאז הם מציעים פוטוסטביליטי משופרת ואורך זמן שידור. שילובים פריימר Pre-aliquoted הינם זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).

הכנת תחל השילובים עבור כל תגובה לפי דילולים נתון בטבלה 1.
להכין שילובים בדיקה עבור כל תגובה לפי טבלה 1. בדיקת כל בדיקה בודדים לפני קבלת השילוב.

3. הכנת המיקס מאסטר

הערה אמצעי האחסון המוזכרים להלן הם עבור ביצוע התגובה qKAT אחד על קבוצה של 10 x 384-ובכן צלחות.

להבטיח כי הדגימות gDNA מצופה על לוחות 384-ובכן יבש לחלוטין. לנהל את כל השלבים על הקרח ולשמור את ריאגנטים מכוסה מחשיפה לאור ככל האפשר מאחר התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית הגששים צילום התרמו-והרגיש.
מפשירים את מאגר qPCR, פריימר ולאחר בדיקה aliquots ב 4 º C.
על קרח, להכין תערובת בסיס 10 x 384-ובכן הצלחות על-ידי הוספת 18.86 מ ל מים הנדסה גנטית, 20 מ"ל של מאגר qPCR, µL 1,000 שילוב פריימר preprepared µL 180 שילוב בדיקה preprepared (טבלה 2).
פזר את תערובת הבסיס באופן שווה על פני צלחת 96-עמוק היטב באמצעות פיפטה של רב ערוצית, pipetting 415 µL לבאר כל. לשמור על הצלחת הזו בתיבת קרח מכוסה אור.
שימוש בכלי טיפול בנוזלים, לוותר על µL 9.5 של המיקס מאסטר לבאר כל צלחת 384-טוב עם gDNA מיובשים. לאטום את הצלחת בנייר ולמקם אותו מיד ב 4 º C. חזור על תהליך זה עבור לוחות הנותרים, המבטיח כי המחטים של הנוזל טיפול מערכת נשטפים במים בין כל צלחת.
Centrifuge הלוחות 384-ובכן ב 450 x g למשך 3 דקות, דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בין 6-12 שעות כדי resuspend את ה-DNA וכדי להפיג כל בועות האוויר.

4. qPCR Assay

בעקבות הדגירה לילה, צנטריפוגה ב x 450 גרם במשך 3 דקות לפרוק את כל בועות האוויר הנותרים.
למטרות של אוטומציה, לחבר את המכונה qPCR (למשל, LightCycler 480) מלווה microplate (ראה טבלה של חומרים). תוכנית המטפל microplate כדי למקם את הצלחות לתוך המכונה qPCR מן מזח אחסון מקורר זה מוגן מפני אור.
הערה מבחני צריך, בתיאוריה, לעבוד על מכונות אחרות qPCR עם הגדרות אופטיים תואם.
השתמש אופניים התנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- C ° 66 תמורת 50 s, עם איסוף נתונים ב 66 º C.
לאחר סיום ההפעלה, יש את הרובוט לאסוף את הצלחת מהמכונה qPCR ולמקם אותו לרציף להשליך.

5. פוסט-לרוץ לניתוח

לאחר הגברה, לחשב את הערכים כימות מחזור (סי) באמצעות השיטה השניה המרבי נגזרות או השיטה מתאימה נקודות עם התוכנה של המכונה qPCR (ראה טבלה של חומרים), ביצוע השלבים הבאים.
פתח את תוכנת qPCR, בכרטיסייה ' ניווט ', פתח את הקובץ ניסוי התגובה שנשמרו עבור לוח אחד.
על הניתוח באמצעות השיטה השניה המרבי נגזרות, בחר בכרטיסיה ניתוח, וליצור ניתוח חדש בשיטת Abs Quant/Second נגזרת מקס.
1. בחלון ' יצירת ניתוח חדש ', בחר סוג ניתוח: Abs Quant/Second נגזרת מקס שיטה, משנה: כל דגימות, תוכנית: הגברה, שם: Rx-DFO (כאשר x הוא מספר התגובה).
2. בחר מסנן מסרק ובחר הקס/ויק/Yellow555 (533-580). פעולה זו מבטיחה כי הנתונים שנאספו עבור STAT6 נבחרה.
3. בחר צבע פיצוי עבור VIC/HEX/Yellow555(533-580). לחץ על חשב. חזור על הפעולה עבור המשפחה (465-510) ו- Cy5/Cy5.5(618-660). לחץ על שמור קובץ.
לניתוח בשיטת נקודות מתאים, בחר נקודות חשבים/Fit Abs בכרטיסיה ניתוח.
1. בחלון ' יצירת ניתוח חדש ', בחר סוג ניתוח: נקודות חשבים/Fit Abs שיטה, משנה: כל דגימות, תוכנית: הגברה, שם: RxF-DFO (כאשר x הוא מספר התגובה).
2. בחר את המסננים הנכונה ואת צבע פיצויים עבור STAT6 וכל אחת של גנים "קיר" (Fam/Cy5). בכרטיסייה ' Noiseband ', הגדר את להקת רעש כדי לא לכלול את רעשי הרקע.
3. בכרטיסייה ' ניתוח ', הגדר את הנקודות מתאים ל- 3 ובחר שהצג מתאים נקודות. לחץ על חשב. לחץ על שמור קובץ.

6. ייצוא של תוצאות

בהתוכנה qPCR, פתח את הנווט בכרטיסיית לבחור לייצא את התוצאות אצווה.
פתח את התיקייה שבה הקבצים ניסוי נשמרות, להעביר את הקבצים לתוך המקטע מצד ימין של החלון. לחץ על הבא. בחר את השם והמיקום של קובץ הייצוא.
בחר סוג ניתוח Abs Quant/Second נגזרת מקס שיטה או Abs חשבים/Fit נקודות. לחץ על הבא. בדוק השם של הקובץ, התיקיה לייצא את סוג ניתוח הן נכונות, לחץ על הבא כדי להתחיל את תהליך הייצוא.
המתן עד מצב ייצוא הוא בסדר. המסך יעבור אוטומטית לשלב הבא. . תבדוק את כל הקבצים שנבחרו יוצאו בהצלחה כך מספר הקבצים נכשל = 0. לחץ על לעשות.
להשתמש בקבצי script split_file.pl roche2sds.pl כדי לפצל את הצלחות מיוצא תגובות בודדות עבור כל צלחת.
הערה קבצי ה-script מסופקים על פי בקשה/GitHub.

7. העתק מספר חישובים

פתח את מספר ניתוח התוכנה להעתיק (לדוגמה, CopyCaller). בחר ייבוא קובץ תוצאות ה-PCR בזמן אמת , לטעון קבצי טקסט שנוצר על-ידי roche2sds.pl.
בחרו נתח , לערוך את הניתוח על-ידי גם בחירת כיל לדוגמה עם עותק הידוע מספר או על-ידי בחירת מספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר. ראה טבלה 5 עבור המספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר של גנים "קיר" בדרך כלל נצפתה באוכלוסיות ממוצא אירופי.

8. איכות הנתונים בודק

להשתמש בקובץ script R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R לשלב העתק נתונים מספר הצלחות לתוך גיליון אלקטרוני.
הערה קבצי ה-script מסופקים על פי בקשה/GitHub.
בדוק מחדש את הנתונים הגולמיים על התוכנה ניתוח מספר עותק עבור דגימות לא תואמות הידוע תאחיזה לא שוויונית (LD) עבור קיר גנים (טבלה 6).

תוצאות

ניתוח מספר עותק יכול להתבצע על-ידי ייצוא הקבצים לתוכנה עותק מספר ניתוח, אשר מספק מספר להעתיק החזוי המשוערת בהתבסס על שיטת ΔΔCq.

המספר עותק ניתן לחזות שגם בהתבסס על עותק הידוע מספר דגימות די אן איי שליטה בצלחת או על-ידי הזנת המספר עותק גנטי בתדירות הגבוהה ביותר (טבלה 5). איור 1 מציג את התוצאות של צלחת לתגובה שמכוונת KIR2DL4 , KIR3DS1, כמו גם את הגן הפניה STAT6. המספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר עבור KIR2DL4, גן מסגרת במיקומה "קיר" , היא שני עותקים, בעוד מספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר של KIR3DS1, הפעלת הגן, אינו עותק אחד. התוצאות באיור מציגות החלקות הגברה PCR שנצפו על התוכנה qPCR, הנתונים מספר עותק שנוצר מהנתונים qPCR. כפי שמוצג, וזמינותו הוא היכולת להבחין בין 0, 1, 2, 3 ו- 4 מספרים עותק של ג'ין "קיר" . ניתוח מספר עותק התוכנה גם מאפשר צפייה של ההתפלגות של מספר עותק על-פני לוח תרשים עוגה או תרשים עמודות. היעילות של התחזית מספר העותק הוא נמוך יותר עבור דגימות עם העתק מספר גבוה יותר.

האיכות של כל החומרים המשמשים את התגובות gDNA, מאגר, תחל, רגשים, יכול להשפיע על הדיוק של התוצאות המתקבלות. הכתבים בתוצאות זאת, סביר להניח להיגרם עקב וריאציה הריכוז של ה-DNA על פני צלחת. טוהר gDNA חילוץ, אשר ניתן למדוד באמצעות של 260/280 ו- 260/230 יחסי, גם יכולה להיות השפעה על האיכות. יחס 260/280 של 1.8-2 ו 260/230 יחס של 2-2.2 הם רצויים. ריכוזים טווח לא אחידה של הדנ א על פני צלחת יכול להוביל השתנות גבוהה במחזור הסף (סי_טי) בין הכתבים בטווח של המספר המשוער עותק ודוגמאות. התוצאות באיור 2 מציגות האפקט שהפער בין ערכי_t C על פני צלחת יכולה להיות על הדיוק בניבוי של המספר עותק. הקו האדום מציין את טווח המספר המשוער עותק עבור מדגם ו, באופן אידיאלי, צריך להיות קרוב שלם ככל האפשר.

ניתן לייצא את עותק מספר נתונים, פעם ניתח, בתור קובץ הגיליון האלקטרוני בתבנית 96-ובכן. השתמשנו קובץ script R (זמין על פי בקשה) כדי לשלב את הנתונים מספר עותק של כל לוחות 10 שמופעלות כערכה לתוך גיליון אלקטרוני אחד. נתונים שפורסמו על KIRs של אוכלוסיות ממוצא אירופאי בעיקר מאפשרת נבואתו של LD הכללים הקיימים בין גנים שונים מורכבים "קיר" ¹. תחזיות אלה משמשים לערוך בדיקות במורד הזרם על עותק מספר התוצאות המתקבלות (טבלה 6). דוגמאות לא תואמות תעודת הזהות החזוי בין הגנים עשוי להכיל פולימורפיזם יוצא דופן או וריאציות מבניות haplotypic. תרשים זרימה המתאר את הפרוטוקול מוצג באיור3.

כלי שנקרא "קיר" Haplotype המזהה (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) פותחה כדי להקל את מעומק של haplotypes של ערכת הנתונים. מעומק עובד על בסיס רשימת הפניה haplotypes הנהוגות האוכלוסייה האירופית-מקור¹. עם זאת, הכלי מאפשרת גם עבור ערכה מותאמת אישית של הפניה haplotypes כדי להשתמש במקום זאת. שלושה קבצים נפרדים נוצרים; הקובץ הראשון מפרטת את כל השילובים haplotype עבור מדגם, הקובץ השני מספק רשימת הצירופים haplotypes שיש משולב התדרים הגבוהים החתוך, ומפרטת הקובץ השלישי כדוגמאות אין אפשרות להקצות haplotypes. Non-הקצאה של haplotypes יכול לשמש כמחוון של haplotypes רומן.

figure-results-3368
איור 1: התוצאות נציג של צלחת על תגובה מספר 5- (א) זה הגברה מראה החלונית חלקות. (B) לוח זה מראה להעתיק מספר חלקות. (ג) לוח זה מציג את התפלגות מספר עותק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3884
איור 2: התוצאות נציג של צלחת עם ריכוז ה-DNA משתנה עבור התגובה מספר 5- (א) זה הגברה מראה החלונית חלקות. (B) לוח זה מראה להעתיק מספר חלקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4369
איור 3: תרשים זרימה של פרוטוקול qKAT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Assay	גנים	תחל קדימה	ריכוז (אן אם)	תחל הפוכה	ריכוז (אן אם)	הגששים	ריכוז (אן אם)
מס ' 1	*3DP1*	A4F	250	A5R	250	P4a	150
	*2DL 2*	2DL2F4	400	C3R2	600	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 2	*2DS2*	A4F	400	A6R	400	P4a	200
	*2DL 3*	D1F	400	D1R	400	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
מס ' 3	*3DL 3*	A8F	500	A8R	500	P4a	150
	*2DS4Del*	2DS4Del	250	2DS4R2	250	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
4. לא	*3DL1e4*	B1F	250	B1R	125	P4b	150
	*3DL1e9*	D4F	250	D4R2	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 5	*3DS1*	B2F	250	B1R	250	P4b	150
	*2DL 4*	C1F	200	C1R	200	P5b - 2DL 4	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
6. לא	*2DL 1*	B3F	500	B3R	125	P4b	150
	*2DP1*	D3F	250	D3R	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
. מספר 7	*2DS1*	B4F	500	B4R	250	P4b	150
	*2DL 5*	D2F	500	D2R	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 8	*2DS3*	B5F	250	B5R	250	P4b	150
	*3DL2e9*	D4F	250	G51	125	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 9	*3DL2e4*	A1F	200	A1R	200	P4a	150
	*2DS4FL*	2DS4FL	250	2DS4R2	500	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
10. לא	*2DS5*	B6F2	200	B6R3	200	P4b	150
	*2DS4*	C5F	250	C5R	250	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150

טבלה 1: שילוב עם ריכוז תחל וזונדים בשימוש כל תגובה qKAT ²⁷ .

התגובה					פריימר Aliquots (µL)				בדיקה Aliquots (µL)
R1	3DP1	A4F	A5R	2DL2F4	C3R2	מים	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DL 2	100	100	160	240	200	80	80	60	60	60
R2	2DS2	A2F	A6R	D1F	D1R	מים	STAT6F	STAT6R	P4A	P9	PSTAT6
	2DL 3	160	160	160	160	160	80	80	80	60	60
									שים לב: עליך µL 20 פחות מים MasterMix
R3	3DL 3	A8F A8FB	A8R	2DS4DELF	2DS4R2	מים	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4DEL	100 100	200	100	100	200	80	80	60	60	60
R4	3DL1E4	B1F	B1R	D4F	D4R2	מים	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL1E9	100	50	100	200	350	80	80	60	60	60
R5	3DS1	B2F	B1R	C1F	C1R	מים	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B - 2L 4	PSTAT6
	2DL 4	100	100	80	80	440	80	80	60	60	60
R6	2DL 1	B3F	B3R	D3F	D3R	מים	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DP1	200	50	100	200	250	80	80	60	60	60
R7	2DS1	B4F	B4R	D2F	D2R	מים	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DL 5	200	100	200	200	100	80	80	60	60	60
R8	2DS3	B5F	B5R	D4F	D5R	מים	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL2E9	100	100	100	50	450	80	80	60	60	60
R9	3DL2E4	A1F	A1R	2DS4WTF	2DS4R2	מים	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4WT	80	80	100	200	340	80	80	60	60	60
R10	2DS5	B6F2	B6R3	C5F	C5R	מים	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B	PSTAT6
	2DS4TOTAL	80	80	100	100	440	80	80	60	60	60

טבלה 2: כרכים (µL) של 100 מיקרומטר פריימר/בדיקה במלאי פתרונות פריימר ולבצע בדיקה בשילוב aliquots.

שם	כיוון	שינוי 5´	שינוי 3´	רצף (5' →3')	אורך	Tm	GC %	אקסון	מיקום
P4a	הגיוני	FAM	BHQ-1	TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA	27	60	44.4	4	425-451
P4b	Antisense	FAM	BHQ-1	AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T	28	62	50	4	576-603
P5b	הגיוני	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG	25	60	52	5	828 – 852
P5b - 2DL 4	הגיוני	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG	25	61	56	5	828 – 852
P9	הגיוני	ATTO647N	BHQ-2	CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC	24	60	62.5	9	1246-1269
PSTAT6		ATTO550	BHQ-2	CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT	26	62	50

טבלה 3: רשימה של הגששים בשימוש qKAT ¹^, ²⁷. צבעי פלורסנט השתמשו בקצה 5' של הגששים oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9, PSTAT6 שונו כדי צבעי אטו.

ג'ין	תחל	כיוון	רצף (5´-3´)	אורך	Tm	GC %	אקסון	מיקום	אמפליקון (bp)	אללים עלול לפספס
3DL2e4	A1F	קדימה	GCCCCTGCTGAA ATCAGG	18	52	61.1	4	399-416	179	3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
	A1R	הפוך	CTGCAAGGACAG GCATCAA	19	53	52.6		559-577		3DL 2 * 048
3DP1	A4F	קדימה	GTCCCCTGGTGA AATCAGA	19	49	52.6	4	398-416	112	אף אחד
	A5R	הפוך	GTGAGGCGCAAA GTGTCA	18	52	55.6		492-509		אף אחד
2DS2	A2F	קדימה	GTCGCCTGGTGA AATCAGA	19	49	52.6	4	398-416	111	אף אחד
	A6R	הפוך	TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT	21	51	42.9		488-508		אף אחד
3DL 3	A8Fa	קדימה	GTGAAATCGGGA GAGACG	18	50	55.6	4	406-423	139	אף אחד
	A8Fb	קדימה	GGTGAAATCAGG AGAGACG	19	50	52.6		405-423		3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
	A8R	הפוך	AGTTGACCTGGG AACCCG	18	51	61.1		526-543		אף אחד
3DL1e4	B1F	קדימה	CATCGGTCCCAT GATGCT	18	51	55.6	4	549-566	85	3DL 1 * 00505, DL 3 1 * 006, DL 3 1 * 054, DL 3 1 * 086, DL 3 1 * 089
	B1R	הפוך	GGGAGCTGACAA CTGATAGG	20	52	55		614-633		3DL 1 * 00502
3DS1	B2F	קדימה	CATCGGTTCCAT GATGCG	18	51	55.6	4	549-566	85	3DS1 * 047; ייתכן לאסוף 3DL 1 * 054.
	B1R	הפוך	GGGAGCTGACAA CTGATAGG	20	52	55		614-633		אף אחד
2DL 1	B3F	קדימה	TTCTCCATCAGT CGCATGAC	20	52	50	4	544-563	96	DL 2 1 * 020, DL 2 1 * 028
	B3R	הפוך	GTCACTGGGAGC TGACAC	18	50	61.1		622-639		DL 2 1 * 023, DL 2 1 * 029, DL 2 1 * 030
2DS1	B4F	קדימה	TCTCCATCAGTC GCATGAA	19	51	47.4	4	545-563	96	2DS1 * 001
	B4R	הפוך	GGTCACTGGGAG CTGAC	17	49	64.7		624-640		אף אחד
2DS3	B5F	קדימה	CTCCATCGGTCG CATGAG	18	53	61.1	4	546-563	96	אף אחד
	B5R	הפוך	GGGTCACTGGGA GCTGAA	18	51	61.1		624-641		אף אחד
2DS5	B6F2	קדימה	AGAGAGGGGACG TTTAACC	19	50	52.6	4	475-493	173	אף אחד
	B6R3	הפוך	TCCAGAGGGTCA CTGGGC	18	53	66.7		630-647		2DS5 * 003
2DL 4	C1F	קדימה	GCAGTGCCCAGC ATCAAT	18	52	55.6	5	808-825	83	אף אחד
	C1R	הפוך	CCGAAGCATCTG TAGGTCT	19	52	52.6		872-890		2DL 4 * 018, DL 2 4 * 019
2DL 2	2DL2F4	קדימה	GAGGTGGAGGCC CATGAAT	19	52	57.9	5	778-796	151	2DL 2 * 009; 782G לשנות לא
	C3R2	הפוך	TCGAGTTTGACC ACTCGTAT	20	51	45		909-928		אף אחד
2DS4	C5F	קדימה	TCCCTGCAGTGC GCAGC	17	57	70.6	5	803-819	120	אף אחד
	C5R	הפוך	TTGACCACTCGT AGGGAGC	19	52	57.9		904-922		2DS4 * 013
2DS4Del	2DS4Del	קדימה	CCTTGTCCTGCA GCTCCAT	19	54	57.9	5	750-768	203	אף אחד
	2DS4R2	הפוך	TGACGGAAACAA GCAGTGGA	20	53	50		933-952		אף אחד
2DS4FL	2DS4FL	קדימה	CCGGAGCTCCTA TGACATG	19	53	57.9	5	744-762	209	אף אחד
	2DS4R2	הפוך	TGACGGAAACAA GCAGTGGA	20	53	50		933-952		אף אחד
2DL 3	D1F	קדימה	AGACCCTCAGGA GGTGA	17	48	58.8	9	1180-1196	156	אף אחד
	D1R	הפוך	CAGGAGACAACT TTGGATCA	20	50	45		1316-1335		2DL 3 * 010, DL 2 3 * 017, DL 2 3 * 01801, DL 2 3 * 01802
2DL 5	D2F	קדימה	CACTGCGTTTTC ACACAGAC	20	52	50	9	1214-1233	120	2DL5B * 011 ו- 2DL5B * 020
	D2R	הפוך	GGCAGGAGACAA TGATCTT	19	49	47.4		1315-1333		אף אחד
2DP1	D3F	קדימה	CCTCAGGAGGTG ACATACGT	20	53	55	9	1184-1203	121	אף אחד
	D3R	הפוך	TTGGAAGTTCCG TGTACACT	20	50	45		1285-1304		אף אחד
3DL1e9	D4F	קדימה	CACAGTTGGATC ACTGCGT	19	52	52.6	9	1203-1221	93	3DL 1 * 061, DL 3 1 * 068
	D4R2	הפוך	CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA	23	53	43.5		1273-1295		3DL 1 * 05901, DL 3 1 * 05902, DL 3 1 * 060, DL 3 1 * 061, DL 3 1 * 064, DL 3 1 * 065, DL 3 1 * 094N, DL 3 1 * 098
3DL2e9	D4F	קדימה	CACAGTTGGATC ACTGCGT	19	52	52.6	9	1203-1221	156	אף אחד
	D5R	הפוך	GACCTGACTGTG GTGCTCG	19	54	63.2		1340-1358		אף אחד
STAT6	STAT6F	קדימה	CCAGATGCCTAC CATGGTGC	20	54	60			129
	STAT6R	הפוך	CCATCTGCACAG ACCACTCC	20	54	60

בטבלה 4: רצף צבעי יסוד בשימוש qKAT ¹^, ²⁷-

*"קיר"* ג'ין		3DL 3	2DS2	2DL 2	2DL 3	2DP1	2DL 1	3DP1	2DL 4	3DL 1 EX9	3DL 1 EX9	3DS1	2DL 5	2DS3	2DS5	2DS1	2DS4 סה	2DS4 פל	2DS4 דל	3DL 2 ex4	3DL 2 EX9
מספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר		2	1	1	2	2	2	2	2	2	2	1	1	1	1	1	2	1	1	2	2

טבלה 5: העתק בתדירות הגבוהה ביותר למספר "קיר" גנים שנצפתה בדרך כלל נקודת המוצא האירופי דגימות.

	תאחיזה לא שוויונית לכללי qKAT מבוסס על אוכלוסיות האירופית	סימון מספר עותק
1	KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 ו KIR3DL2 הם מסגרת הגנים המצויים על שתי haplotypes.	KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 , KIR3DL2 = 2
2	KIR2DS2 , KIR2DL2 הינם LD אחד עם השני	2DS2=2 DL 2
3	KIR2DL2 ו KIR2DL3 הם אללים של אותו גן	2 DL 2+2 DL 3= 2
4	KIR2DP1 , KIR2DL1 הינם LD אחד עם השני	2DP1=2 DL 1
5	אקסון 4 של KIR3DL1 ו- KIR3DL2 שווה אקסון 9 של KIR3DL1 ו- KIR3DL2 בהתאמה.	3DL1ex4=3DL1ex9 , 3DL2ex4=3DL2ex9
6	KIR3DL1 ו KIR3DS1 הם אללים	3 DL 1+3DS1= 2
7	KIR2DS3 , KIR2DS5 הינם LD עם KIR2DL5	2DS3+2DS5=2 DL 5
8	KIR3DS1 , KIR2DS1 הינם LD	3DS1=2DS1
9	הנוכחות של otal KIR2DS1 , KIR2DS4Tהיא שבחירה-haplotype	2DS1+2DS4TOTAL= 2
10	KIR2DS4FL ו KIR2DS4del הם וריאציות של KIR2DS4TOTAL	2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

טבלה 6: תאחיזה לא שוויונית בין "קיר" גנים נצפתה נפוץ בקרב אוכלוסיות ממוצא אירופאי יכול לשמש כדי לבדוק את הנתונים מספר עותק ¹^,²⁷-

Discussion

אנו המתואר הרומן חצי אוטומטיות תפוקה גבוהה בשיטה, הנקראת qKAT, אשר מקלה על הקלדת מספר עותק של "קיר" גנים. השיטה היא שיפור על פני שיטות קונבנציונליות כמו SSP-PCR, תפוקה נמוכה והם יכולים רק להצביע על נוכחות או היעדרות של גנים אלה מאוד רב שלבית.

הדיוק של הנתונים מספר עותק שהושג תלויה גורמים רבים, כולל את האיכות ואת ריכוז-אחידות של הדגימות gDNA והאיכות של ריאגנטים. האיכות והדיוק של הדגימות gDNA על פני צלחת חשובים ביותר מאז וריאציות בריכוז על פני הצלחת עלולה לגרום לשגיאות בחישוב של המספר עותק. מאז מבחני היו מאומת באמצעות ערכות המדגם האירופי-מקור, נתונים גדודים משאר חלקי העולם דורשות בדיקות יסודית יותר. זו היא להבטיח כי מקרים של נשירת אלל או שאינם ספציפיים פריימר/בדיקה איגוד הם לא טעו לחשוב כמו העתק מספר וריאציות.

בעוד מבחני היו מעוצבות וממוטבות לרוץ כמו תפוקה גבוהה, ניתן לשנותן כדי להפעיל פחות דגימות. מדד ביטחון בתוכנת ניתוח מספר עותק מושפע בעת ניתוח דגימות פחות, אבל זה יכול להשתפר אם בקרת דגימות די אן איי גנומית עם מספר ידוע של עותק הגן וקיר כלולים בצלחת נוספים דוגמת משכפל כלל.

עבור מעבדות ללא נוזל/צלחת-טיפול רובוטים, מיקס מאסטר יכול ובשמפו באמצעות פיפטות רב ערוצית, צלחות ניתן לטעון ידנית לתוך הכלי qPCR.

המטרה העיקרית מאחורי התפתחות qKAT הייתה ליצור פשוטה, תפוקה גבוהה, ברזולוציה גבוהה, וחסכונית שיטה גנוטיפ KIRs למחלה האגודה מחקרים. דבר זה הושג בהצלחה מאז qKAT ננקטה חוקרים את התפקיד של "קיר" במספר מחקרים האגודה מחלה גדולה, כולל מגוון של מחלות זיהומיות, מחלות אוטואימוניות הריון הפרעות⁴^, ²⁴ ^, ²⁵ ^, ²⁶.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

הפרויקט קיבל מימון של המועצה למחקר רפואי (MRC), אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת אופק 2020 מחקר וחדשנות התכנית של האיחוד האירופי (גרנט הסכם מס 695551) וקיימברידג המכון הלאומי לבריאות (NIH) ביו המרכז לחקר דם מחקר NIH והשתלת יחידת המחקר (NIHR BTRU) תרומת איברים והשתלות -מנדרינית, בשיתוף עם דם NHS השתלה (NHSBT). הדיעות הם אלה היוצרים ואלה לא בהכרח של בקופת חולים, את NIHR, מחלקת הבריאות או את NHSBT.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Oligonucleotides	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit	Bioline	BIO-86020	−
MilliQ water	−	−	−
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor	Eppendorf(or equivalent)	Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
OR
QuBit Fluorometer	Life Technologies	Q33216
Matrix Hydra	Thermo Scientific	109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well	Roche	05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour)	Caliper Life Sciences	204135
Vortex mixer	Biosan	BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL)	Gilson(or equivalent)	F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL)	Starlab (or equivalent)	S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL	STARLAB	E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube	STARLAB	E1450-0200
96-well deep well plate	Fisher Scientific	12194162
LC480 384 Multi-well plates	Roche	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04729757001
Name	Company	Catalog Number	Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1			https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier			http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

References

Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).
Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145 Immunogenetics KIRs haplotype qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: