qKAT: quantitativa coeficiente digitação de assassino-célula Genes de receptores de imunoglobulina-como

Resumo

Pilha de assassino quantitativa imunoglobulina-como receptor (KIR) semi-automático digitação (qKAT) é um método simples, alto rendimento e baixo custo para copiar números genes KIR de tipo para sua aplicação em estudos de associação de população e a doença.

Resumo

Receptores de imunoglobulina-like da pilha de assassino (KIRs) são um conjunto de receptores imunes inibitórios e ativando, assassinas naturais (NK) e células T, codificadas por um cluster polimórfico de genes no cromossomo 19. Seus ligantes mais bem caracterizadas são as moléculas de antigénios (HLA) de leucócito humano que são codificadas dentro o locus de (MHC) complexo principal de histocompatibilidade no cromossomo 6. Não há evidências substanciais de que desempenham um papel significativo na imunidade, reprodução e transplante de órgãos, tornando-se crucial ter técnicas que podem com precisão genótipo-los. No entanto, sequência de alta homologia, também como alélica e variação do número de cópia, dificultam ao genótipo e, eficientemente, métodos de projeto que podem com precisão todos os genes KIR . Os métodos tradicionais são geralmente limitados a resolução dos dados obtidos, produtividade, rentabilidade e o tempo necessário para configurar e executar os experimentos. Nós descrevemos um método chamado quantitativo KIR digitação semi-automática (qKAT), que é um método de reação em cadeia de polimerase em tempo real multiplex do elevado-throughput que pode determinar o número de cópias do gene para todos os genes no locus do KIR . qKAT é um método simples de alto rendimento que pode fornecer dados de alta resolução KIR cópia números, que podem ser mais usados para inferir as variações nos haplótipos estruturalmente polimórficas que eles englobam. Dados de número e haplótipo esta cópia podem ser benéficos para estudos sobre associações de doença em grande escala, genética de populações, bem como investigações sobre a expressão e interações funcionais entre KIR e HLA.

Introdução

Em humanos, os receptores de imunoglobulina-como assassino(KIR) locus é mapeado no braço longo do cromossomo 19 dentro o leucócitos do receptor complexo (LRC). Esse locus é cerca de 150 kb de comprimento e inclui 15 KIR genes arranjados cabeça a cauda. Os loci KIR que é atualmente conhecidos são KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e dois pseudogenes, KIR2DP1 e KIR3DP1. Os genes KIR codificam para bidimensional (2D) e tridimensionais (3D) domínio de imunoglobulina-como receptores com short (S; ativando) ou longa (L; inibitório) cauda citoplasmática, que é expressos por células assassinas naturais (NK) e subconjuntos de T células. Variação de número de cópia exibiu dentro das formas de locus KIR diversos haplótipos com gene variável conteúdo¹. Recombinação homóloga não-alélica (NAHR), facilitada por um arranjo de gene de cabeça-de-cauda estreita e sequência de alta homologia, é o mecanismo proposto para ser responsável para a variabilidade de haplotypic. Mais de 100 diferentes haplótipos foram relatados em populações em todo o mundo^1,2,3,4. Todos estes haplótipos podiam ser divididos em dois grandes grupos: A e B haplótipos. O haplótipo A contém 7 genes KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, que são inibitórios genes KIR e a activação KIR gene KIR2DS4. No entanto, até 70% de indivíduos de origem europeia que são homozigotos para KIR haplótipo A exclusivamente levar para uma forma de "exclusão" não-funcional de KIR2DS4^5,6. Todas as outras combinações de genes KIR formam grupo B haplótipos, incluindo pelo menos um dos genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e tipicamente incluem dois ou mais genes KIR ativando.

Moléculas de HLA classe I foram identificados como ligantes para determinados receptores inibitórios (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), ativando os receptores (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e para KIR2DL4, que é um exclusivo KIR que contém um longo citoplasmático rabos como outros receptores KIR inibitórios, mas também tem um resíduo de carga positiva perto o domínio extracelular, que é um comum característica de outros receptores KIR ativando. A combinação de variantes dentro dos genes KIR e os genes HLA influencia a interação do ligante do receptor que formas potencial NK célula capacidade de resposta a nível individual^7,8. Evidências de estudos genéticos Associação indicou que KIR desempenha um papel na resistência viral (ex.., vírus de imunodeficiência humana [HIV]⁹ e hepatite C vírus [HCV]¹⁰), o sucesso do transplante de ¹¹, o risco de gravidez transtornos e sucesso reprodutivo^12,13, a proteção contra a recaída após células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH)^{14,15, 16}e o risco de cancros¹⁷.

A combinação de sequência de alta homologia e alélica e haplotypic diversidade apresenta desafios na tarefa de genes KIR com precisão genotipagem. Métodos convencionais para digitar genes KIR incluem a primeira demão de sequência-específica (SSP) do polymerase reação em cadeia (PCR)^18,19,20, sequência específica oligonucleotide sonda PCR (SSOP)²¹, e laser assistida matriz desorção ionização-tempo de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS)²². As desvantagens dessas técnicas são que eles só fornecem visão parcial sobre o genótipo de um indivíduo enquanto também ser trabalhoso executar. Recentemente, sequenciamento de próxima geração (NGS) tem sido aplicado para digitar o locus KIR especificamente. Enquanto este método é muito poderoso, pode ser caro executar, e é demorado para realizar verificações de dados e análise em profundidade.

qKAT é um método PCR quantitativo elevado-throughput. Enquanto os métodos convencionais são laborioso e demorado, este método torna possível executar quase 1.000 amostras de DNA (gDNA) genômicas em cinco dias e dá o genótipo KIR , bem como o número de cópia do gene. qKAT é composto por dez reações multiplex, cada um dos quais metas dois loci KIR e um gene de referência de um número fixo de cópia no genoma (STAT6) utilizado para a quantificação relativa do gene KIR copiar número²³. Este ensaio tem sido usado com sucesso em estudos envolvendo painéis de grande população e doença coortes sobre doenças infecciosas como HCV, doenças auto-imunes, como diabetes tipo 1 e transtornos da gravidez como pré-eclâmpsia, bem como fornecendo uma genética na base de estudos que visa compreender o NK celular função^1,4,24,25,26.

Protocolo

1. preparação e chapeamento do DNA

1. Quantificar com precisão a concentração de gDNA usando um instrumento espectrofotométrico ou fluorométrica.
2. Dilua o DNA a 4 ng / µ l em uma placa de 96 poços profundos-bem. Incluem pelo menos uma amostra de gDNA de controle com um número de cópia conhecida e um modelo de controle.
3. Centrifugar as placas de 96 poços a 450 x g por 2 min.
4. Usando um instrumento de manipulação de líquidos, dispensar cada amostra em quadriplicado nas chapas de qPCR 384-bem, para que cada poço tem 10 ng de DNA (2,5 µ l/poço). Prepare pelo menos dez chapas de 384-bem, uma para cada reação qKAT.
5. Se gDNA fornecimento de mais de uma placa de 96 poços, realize uma lavagem de volume completo com 2% de lixívia e água ultrapura para limpar as agulhas do líquido sistema entre cada placa de 96 poços de gDNA amostras de manipulação.
6. Secar o DNA por incubar as placas de 384-bem em uma área limpa, em temperatura ambiente pelo menos 24 h.

2. preparação das sondas e Primers

Nota: qKAT é composto por dez reações multiplex. Cada reação inclui três pares da primeira demão e três sondas de fluorescência-etiquetada que amplificam especificamente dois genes KIR e referência de um gene. As sondas que foram publicadas no Jiang et al.²⁷ foram modificadas para que os oligonucleotides agora são rotulados com corantes ATTO desde que eles oferecem maior fotoestabilidade e vidas sinal longo. Cartilha pré-aliquotadas combinações são comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).

1. Prepare as combinações de cartilha para cada reação conforme as diluições indicado na tabela 1.
2. Prepare sonda combinações para cada reação, conforme tabela 1. Teste cada sonda individual antes de fazer a combinação.

3. preparação do Master Mix

Nota Os volumes mencionados abaixo são para a realização de uma reação de qKAT em um conjunto de placas de 10 x 384-bem.

1. Certifique-se de que as amostras de gDNA chapeadas com as placas do 384-bem estão completamente secas. Realizar todos os passos no gelo e manter os reagentes cobertos da exposição à luz tanto quanto possível, desde que as sondas de fluorescência-etiquetada são foto - e termo-sensível.
2. Degele o buffer de qPCR, primer e alíquotas de sonda a 4 ° C.
3. No gelo, prepare uma mistura de mestre para placas de 10 x 384-bem adicionando 18,86 mL de água ultrapura, 20 mL de tampão de qPCR, 1.000 µ l de combinação preprepared cartilha e 180 µ l de combinação de sonda preprepared (tabela 2).
4. Distribua uniformemente a mistura de mestre através de uma placa de 96 de profundidade bem usando uma pipeta multicanal, pipetagem 415 µ l em cada poço. Manter esta placa em uma caixa de gelo coberta de luz.
5. Usando um instrumento de manipulação de líquidos, dispense 9,5 µ l do mix mestre em cada poço da placa 384-bem com gDNA seca. Selar o prato com uma folha e coloque-o imediatamente a 4 ° C. Repita este processo para as restantes placas, garantindo que as agulhas do líquido sistema de manipulação são lavadas com água entre cada prato.
6. Centrifugar as placas de 384 poços a 450 x g por 3 min e incube-os a 4 ° C durante a noite ou entre 6-12 h para Ressuspender o DNA e para dissipar quaisquer bolhas de ar.

4. ensaio de qPCR

1. Após a incubação durante a noite, centrifugar a 450 x g durante 3 min dissipar quaisquer bolhas de ar restantes.
2. Para efeitos de automação, ligue a máquina de qPCR (por exemplo, LightCycler 480) a um manipulador de microplaca (ver Tabela de materiais). Programa manipulador de microplacas para colocar as placas na máquina qPCR de uma doca de armazenamento refrigerado protegido da luz.
   Nota os ensaios devem, em teoria, trabalhar em outras máquinas de qPCR com configurações de ópticas compatíveis.
3. Use as seguintes condições de ciclismo: 95 ° C por 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 66 ° C para 50 s, com coleta de dados a 66 ° C.
4. Uma vez concluída a execução, tem o robô recolher a placa da máquina qPCR e colocá-lo no banco do réus de descarte.

5. após a execução da análise

1. Após a amplificação, calcular os valores de ciclo (Cq) de quantificação usando o segundo método de máximo derivativo ou o método de pontos de ajuste com o software da máquina qPCR (ver Tabela de materiais), seguindo os passos abaixo.
2. Abra o software de qPCR e, na aba do navegador , abra o arquivo de experimento de reação salvos para um prato.
3. Para a análise usando o segundo método de máximo derivado, selecione a guia de análise e criar uma nova análise, usando o método Abs Quant/Second derivado Max.
   1. Na janela criar nova análise , seleccione o tipo de análise: o método Abs Quant/Second derivado Max, subconjunto: todas as amostras, programa: amplificação, nome: Rx-DFO (onde x é o número de reação).
   2. Selecione Filtro Comb e escolha VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Isso garante que os dados coletados para STAT6 estão selecionados.
   3. Selecione cor compensação para VIC/HEX/Yellow555(533-580). Clique em calcular. Repita isto para Fam (465-510) e Cy5/Cy5.5(618-660). Clique em salvar arquivo.
4. Para a análise usando o método de pontos de ajuste, selecione Abs Quant/Fit pontos na guia de análise.
   1. Na janela criar nova análise , seleccione o tipo de análise: o método Abs Quant/Fit pontos, subconjunto: todas as amostras, programa: amplificação, nome: RxF-DFO (onde x é o número de reação).
   2. Selecione os filtros corretos e compensações de cor para cada um dos genes KIR (Fam/Cy5) e o STAT6 . Na guia Noiseband , defina a banda ruído para eliminar o ruído de fundo.
   3. Na guia análise , definir os pontos de ajuste para 3 e selecione que mostrar pontos de ajuste. Clique em calcular. Clique em salvar arquivo.

6. exportação dos resultados

1. No software qPCR, abra o navegador Tab. Selecione Exportar de lote de resultados.
2. Abra a pasta na qual os arquivos do experimento são salvos em transferir os arquivos para a seção do lado direito da janela. Clique em seguinte. Selecione o nome e o local do arquivo de exportação.
3. Selecione o tipo de análise o método Abs Quant/Second derivado Max ou Abs Quant/Fit pontos. Clique em seguinte. Verifique se o nome do arquivo, a pasta de exportação e o tipo de análise estão correto e clique em próximo para iniciar o processo de exportação.
4. Espere até que o Status de exportação é Okey. A tela automaticamente se moverá para o próximo passo. Verifique que todos os arquivos selecionados foram exportados com sucesso para que o número de arquivos falhou = 0. Clique em concluído.
5. Use scripts split_file.pl e roche2sds.pl para dividir as placas exportadas em reações individuais para cada placa.
   Nota os scripts são fornecidos na solicitação/GitHub.

7. Copie o número de cálculos

1. Abra o software de análise número da cópia (por exemplo, CopyCaller). Selecione Importar arquivo de resultados PCR em tempo real e carregar arquivos de texto criados pelo roche2sds.pl.
2. Selecione analisar e realizar a análise ou selecionando amostra Calibrador com número de cópia conhecida ou selecionando o número mais frequente de cópia. Ver tabela 5 para o número mais frequente de cópia de genes KIR tipicamente observada em populações de origem europeia.

8. qualidade dos dados verifica

1. Use script de R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R para combinar dados de número de cópia de todas as placas em uma planilha.
   Nota os scripts são fornecidos na solicitação/GitHub.
2. Verifique novamente os dados brutos sobre o software de análise de número de cópia para amostras que não estão em conformidade com o desequilíbrio de ligação conhecida (LD) para genes KIR (quadro 6).

Resultados

Análise do número de cópia pode efectuar exportando os arquivos para o software de análise número de cópia, que fornece o número de cópia previsto e estimado baseado no método ΔΔCq.

O número de cópia pode ser previsto com base no número de amostras de DNA de controle na placa ou inserindo o número de cópia de gene mais frequente (tabela 5) cópia conhecida. A Figura 1 mostra os resultados de uma placa para uma reação que tem como alvo KIR2DL4 e KIR3DS1, bem como o gene de referência STAT6. O número de cópia mais frequente para KIR2DL4, um gene de quadro no locus KIR , é duas cópias, Considerando que o número de cópia mais frequente para KIR3DS1, um gene de activação, é uma cópia. Os resultados na figura mostram as parcelas de amplificação do PCR observadas sobre o software de qPCR e os dados de número de cópia gerados a partir dos dados de qPCR. Como mostrado, o ensaio é capaz de distinguir entre 0, 1, 2, 3 e 4 número de cópias do gene de KIR . O software de análise de número de cópia também permite uma visualização da distribuição do número de cópia através da placa como um gráfico de pizza ou um gráfico de barras. A eficácia da previsão de número de cópia é inferior para amostras com um número maior de cópia.

A qualidade de todos os materiais usados nas reações gDNA, tampão, primers e sondas, pode afetar a precisão dos resultados obtidos. No entanto, a discordância nos resultados é mais provável ser causado devido a variação na concentração de DNA através de uma placa. A pureza do gDNA extraído, o que pode ser medido usando a 260/280 e 260/230 rácios, também pode ter um efeito sobre a qualidade. Um rácio de 260/280 cuja relação 1,8-2 e 260/230 2-2.2 são desejáveis. Um concentrações de intervalo irregular de DNA através de uma placa podem levar a uma alta variabilidade no ciclo de limiar (C_t) entre amostras e discordância no intervalo do número estimado de cópia. Os resultados na Figura 2 mostram o efeito que a disparidade entre os valores de_t C através de uma placa pode ter sobre a exactidão na predição do número de cópia. A linha vermelha indica o intervalo do número estimado de cópia para uma amostra e, idealmente, deveria ser mais próximo de um número inteiro possível.

Os dados de número de cópia, uma vez analisados, podem ser exportados como um arquivo de planilha em um formato de 96 poços. Usamos um script de R (disponível quando solicitado) para combinar os dados de número de cópia de todos os 10 placas que são executados como um conjunto em uma planilha. Os dados publicados sobre KIRs de populações de origem europeia na maior parte permite a previsão de regras de LD que existem entre os vários genes no complexo KIR ¹. Estas previsões são usados para conduzir verificações a jusante na cópia números resultados obtidos (tabela 6). Amostras que não estão em conformidade com o previsto LD entre os genes podem conter incomum polimorfismo ou variações estruturais de haplotypic. Um fluxograma descrevendo o protocolo é mostrado na Figura 3.

Uma ferramenta chamada KIR haplótipo identificador (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) foi desenvolvida para facilitar a imputação de haplótipos do conjunto de dados. A imputação funciona com base numa lista de haplótipos de referência observadas em uma população de origem europeia¹. No entanto, a ferramenta também permite um conjunto personalizado de haplótipos de referência a ser usado em vez disso. Três arquivos separados são gerados; o primeiro arquivo lista todas as combinações de haplótipo para uma amostra, o segundo arquivo fornece uma lista aparada as combinações de haplótipos que têm as mais altas frequências combinadas, e o terceiro arquivo listas de exemplos que não podem ser atribuídos haplótipos. Non-atribuição de haplótipos poderia ser usado como um indicador de haplótipos de romance.

Figura 1: número de resultados representativos de uma placa para a reação 5. (A), este painel mostra amplificação parcelas. (B), este painel mostra copiar números parcelas. (C), este painel mostra a distribuição do número de cópia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: número de resultados representativos de uma placa com uma concentração variável de DNA pela reação 5. (A), este painel mostra amplificação parcelas. (B), este painel mostra copiar números parcelas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: fluxograma do protocolo qKAT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ensaio	Genes	Primers para a frente	Concentração (nM)	Primers reversos	Concentração (nM)	Sondas	Concentração (nM)
N º 1	3DP1	A4F	250	A5R	250	P4a	150
	2DL 2	2DL2F4	400	C3R2	600	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 2	2DS2	A4F	400	A6R	400	P4a	200
	2DL 3	D1F	400	D1R	400	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 3	3DL 3	A8F	500	A8R	500	P4a	150
	2DS4Del	2DS4Del	250	2DS4R2	250	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 4	3DL1e4	B1F	250	B1R	125	P4b	150
	3DL1e9	D4F	250	D4R2	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 5	3DS1	B2F	250	B1R	250	P4b	150
	2DL 4	C1F	200	C1R	200	P5B - 2DL 4	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 6	2DL 1	B3F	500	B3R	125	P4b	150
	2DP1	D3F	250	D3R	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 7	2DS1	B4F	500	B4R	250	P4b	150
	2DL 5	D2F	500	D2R	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 8	2DS3	B5F	250	E55	250	P4b	150
	3DL2e9	D4F	250	C55	125	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 9	3DL2e4	A1F	200	A1R	200	P4a	150
	2DS4FL	2DS4FL	250	2DS4R2	500	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N º 10	2DS5	B6F2	200	B6R3	200	P4b	150
	2DS4	C5F	250	C5R	250	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150

Tabela 1: combinação e concentração de primers e sondas utilizadas em cada reação de qKAT ²⁷ .

Reação					Primeira demão alíquotas (µ l)				Alíquotas de sonda (µ l)
R1	3DP1	A4F	A5R	2DL2F4	C3R2	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DL 2	100	100	160	240	200	80	80	60	60	60
R2	2DS2	A2F	A6R	D1F	D1R	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4A	P9	PSTAT6
	2DL 3	160	160	160	160	160	80	80	80	60	60
									Nota: preciso de 20 µ l de menos água no MasterMix
R3	3DL 3	A8F A8FB	A8R	2DS4DELF	2DS4R2	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4DEL	100 100	200	100	100	200	80	80	60	60	60
R4	3DL1E4	B1F	B1R	D4F	D4R2	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL1E9	100	50	100	200	350	80	80	60	60	60
R5	3DS1	B2F	B1R	C1F	C1R	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B - 2L 4	PSTAT6
	2DL 4	100	100	80	80	440	80	80	60	60	60
R6	2DL 1	B3F	B3R	D3F	D3R	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DP1	200	50	100	200	250	80	80	60	60	60
R7	2DS1	B4F	B4R	D2F	D2R	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DL 5	200	100	200	200	100	80	80	60	60	60
R8	2DS3	B5F	E55	D4F	C55	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL2E9	100	100	100	50	450	80	80	60	60	60
R9	3DL2E4	A1F	A1R	2DS4WTF	2DS4R2	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4WT	80	80	100	200	340	80	80	60	60	60
R10	2DS5	B6F2	B6R3	C5F	C5R	ÁGUA	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B	PSTAT6
	2DS4TOTAL	80	80	100	100	440	80	80	60	60	60

Tabela 2: Volumes (µ l) da cartilha de 100 µM/ponta de estocam soluções para fazer a primeira demão e sonda alíquotas de combinação.

Nome	Direção	modificação de 5´	modificação de 3´	Sequência (5' →3')	Comprimento	TM	% DE GC	Exão	Posição
P4a	Sentido	FAM	BHQ-1	TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA	27	60	44,4	4	425-451
P4b	Antisentido	FAM	BHQ-1	AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T	28	62	50	4	576-603
P5B	Sentido	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG	25	60	52	5	828-852
P5B - 2DL 4	Sentido	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG	25	61	56	5	828-852
P9	Sentido	ATTO647N	BHQ-2	CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC	24	60	62,5	9	1246-1269
PSTAT6		ATTO550	BHQ-2	CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT	26	62	50

Tabela 3: lista das sondas utilizadas em qKAT ^{1, 27}. os corantes fluorescentes usados na extremidade 5' das sondas oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9 e PSTAT6 foram modificados para corantes ATTO.

Gene	Primeiras demão	Direção	Sequência (5´-3´)		Comprimento	TM	% DE GC	Exão	Posição	Amplicon (bp)	Alelos podem ser desperdiçados.
3DL2e4	A1F	Para a frente	GCCCCTGCTGAA ATCAGG		18	52	61.1	4	399-416	179	3DL 008 * 2, * 021, * 027, * 038.
	A1R	Inverter	CTGCAAGGACAG GCATCAA		19	53	52,6		559-577		3DL 2 * 048
3DP1	A4F	Para a frente	GTCCCCTGGTGA AATCAGA		19	49	52,6	4	398-416	112	Nenhum
	A5R	Inverter	GTGAGGCGCAAA GTGTCA		18	52	55.6		492-509		Nenhum
2DS2	A2F	Para a frente	GTCGCCTGGTGA AATCAGA		19	49	52,6	4	398-416	111	Nenhum
	A6R	Inverter	TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT		21	51	42,9		488-508		Nenhum
3DL 3	A8Fa	Para a frente	GTGAAATCGGGA GAGACG		18	50	55.6	4	406-423	139	Nenhum
	A8Fb	Para a frente	GGTGAAATCAGG AGAGACG		19	50	52,6		405-423		3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
	A8R	Inverter	AGTTGACCTGGG AACCCG		18	51	61.1		526-543		Nenhum
3DL1e4	B1F	Para a frente	CATCGGTCCCAT GATGCT		18	51	55.6	4	549-566	85	3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
	B1R	Inverter	GGGAGCTGACAA CTGATAGG		20	52	55		614-633		3DL 1 * 00502
3DS1	B2F	Para a frente	CATCGGTTCCAT GATGCG		18	51	55.6	4	549-566	85	3DS1 * 047; pode pegar 3DL 1 * 054.
	B1R	Inverter	GGGAGCTGACAA CTGATAGG		20	52	55		614-633		Nenhum
2DL 1	B3F	Para a frente	TTCTCCATCAGT CGCATGAC		20	52	50	4	544-563	96	2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
	B3R	Inverter	GTCACTGGGAGC TGACAC		18	50	61.1		622-639		2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1	B4F	Para a frente	TCTCCATCAGTC GCATGAA		19	51	47,4	4	545-563	96	2DS1 * 001
	B4R	Inverter	GGTCACTGGGAG CTGAC		17	49	64,7		624-640		Nenhum
2DS3	B5F	Para a frente	CTCCATCGGTCG CATGAG		18	53	61.1	4	546-563	96	Nenhum
	E55	Inverter	GGGTCACTGGGA GCTGAA		18	51	61.1		624-641		Nenhum
2DS5	B6F2	Para a frente	AGAGAGGGGACG TTTAACC		19	50	52,6	4	475-493	173	Nenhum
	B6R3	Inverter	TCCAGAGGGTCA CTGGGC		18	53	66,7		630-647		2DS5 * 003
2DL 4	C1F	Para a frente	GCAGTGCCCAGC ATCAAT		18	52	55.6	5	808-825	83	Nenhum
	C1R	Inverter	CCGAAGCATCTG TAGGTCT		19	52	52,6		872-890		2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2	2DL2F4	Para a frente	GAGGTGGAGGCC CATGAAT		19	52	57.9	5	778-796	151	2DL 2 * 009; 782G mudado para r.
	C3R2	Inverter	TCGAGTTTGACC ACTCGTAT		20	51	45		909-928		Nenhum
2DS4	C5F	Para a frente	TCCCTGCAGTGC GCAGC		17	57	70.6	5	803-819	120	Nenhum
	C5R	Inverter	TTGACCACTCGT AGGGAGC		19	52	57.9		904-922		2DS4 * 013
2DS4Del	2DS4Del	Para a frente	CCTTGTCCTGCA GCTCCAT		19	54	57.9	5	750-768	203	Nenhum
	2DS4R2	Inverter	TGACGGAAACAA GCAGTGGA		20	53	50		933-952		Nenhum
2DS4FL	2DS4FL	Para a frente	CCGGAGCTCCTA TGACATG		19	53	57.9	5	744-762	209	Nenhum
	2DS4R2	Inverter	TGACGGAAACAA GCAGTGGA		20	53	50		933-952		Nenhum
2DL 3	D1F	Para a frente	AGACCCTCAGGA GGTGA		17	48	58,8	9	1180-1196	156	Nenhum
	D1R	Inverter	CAGGAGACAACT TTGGATCA		20	50	45		1316-1335		2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 e 2DL 3 * 01802
2DL 5	D2F	Para a frente	CACTGCGTTTTC ACACAGAC		20	52	50	9	1214-1233	120	2DL5B * 011 e 2DL5B * 020
	D2R	Inverter	GGCAGGAGACAA TGATCTT		19	49	47,4		1315-1333		Nenhum
2DP1	D3F	Para a frente	CCTCAGGAGGTG ACATACGT		20	53	55	9	1184-1203	121	Nenhum
	D3R	Inverter	TTGGAAGTTCCG TGTACACT		20	50	45		1285-1304		Nenhum
3DL1e9	D4F	Para a frente	CACAGTTGGATC ACTGCGT		19	52	52,6	9	1203-1221	93	3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
	D4R2	Inverter	CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA		23	53	43,5		1273-1295		3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9	D4F	Para a frente	CACAGTTGGATC ACTGCGT		19	52	52,6	9	1203-1221	156	Nenhum
	D5R	Inverter	GACCTGACTGTG GTGCTCG		19	54	63,2		1340-1358		Nenhum
STAT6	STAT6F	Para a frente	CCAGATGCCTAC CATGGTGC		20	54	60			129.
	STAT6R	Inverter	CCATCTGCACAG ACCACTCC		20	54	60

Tabela 4: sequências dos primers utilizados em qKAT ^{1, 27}.

KIR gene		3DL 3	2DS2	2DL 2	2DL 3	2DP1	2DL 1	3DP1	2DL 4	3DL 1 EX9	3DL 1 EX9	3DS1	2DL 5	2DS3	2DS5	2DS1	2DS4 Total	2DS4 FL	2DS4 DEL	3DL 2 EX4	3DL 2 EX9
Número de cópia mais frequente		2	1	1	2	2	2	2	2	2	2	1	1	1	1	1	2	1	1	2	2

Tabela 5: Número de cópia mais frequente para KIR genes comumente observados em amostras de origem europeia.

	Regras de desequilíbrio de ligação para qKAT com base em populações europeias				Verificação do número de cópia
1	KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 são quadro genes presentes em ambos os haplótipos.				KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 = 2
2	KIR2DS2 e KIR2DL2 são em LD uns com os outros				2DS2=2 DL 2
3	KIR2DL2 e KIR2DL3 são alelos de um mesmo gene				2 DL de 2+2 DL 3= 2
4	KIR2DP1 e KIR2DL1 são em LD uns com os outros				2DP1=2 DL 1
5	Exon 4 de KIR3DL1 e KIR3DL2 é igual a exon 9 de KIR3DL1 e KIR3DL2 respectivamente.				3DL1ex4=3DL1ex9 e 3DL2ex4=3DL2ex9
6	KIR3DL1 e KIR3DS1 são alelos				3 DL 1+3DS1= 2
7	KIR2DS3 e KIR2DS5 estão em LD com KIR2DL5				2DS3+2DS5=2 DL 5
8	KIR3DS1 e KIR2DS1 estão em LD				3DS1=2DS1
9	Presença de KIR2DS1 e KIR2DS4Tvirgula é mutuamente exclusiva em um haplótipo				2DS1+2DS4TOTAL= 2
10	KIR2DS4FL e KIR2DS4del são variantes de KIR2DS4TOTAL				2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabela 6: desequilíbrio de ligação entre KIR os genes comumente observados em populações de origem Europeia podem ser usados para verificar os dados de número de cópia ^1,27.

Discussão

Nós descrevemos um método de alta produtividade semi-automatizadas romance, chamado qKAT, que facilita a digitação de número cópia dos genes KIR . O método é uma melhoria sobre os métodos convencionais como SSP-PCR, que são de baixo rendimento e só podem indicar a presença ou ausência destes genes altamente polimórficos.

A precisão dos dados cópia números obtidos é dependente de vários fatores, incluindo a qualidade e uniformidade-concentração de amostras gDNA e a qualidade dos reagentes. A qualidade e a precisão das amostras gDNA através de uma placa são extremamente importantes, uma vez que as variações na concentração do outro lado da placa podem resultar em erros no cálculo do número de cópia. Desde os ensaios foram validados utilizando conjuntos de exemplo de origem europeia, dados de coortes de outras partes do mundo exigem verificações mais minuciosa. Isto é para garantir que instâncias do abandono do alelo ou ligação não-específica da primeira demão/sonda não são mal interpretadas como variação de número de cópia.

Enquanto os ensaios foram projetados e otimizados para rodar como alta produtividade, eles podem ser modificados para executar amostras menos. A métrica de confiança no software de análise do número cópia é afectada quando analisando amostras de menos, mas isso pode ser melhorado se amostras de DNA genômicas controle com um número de cópia de gene conhecido do KIR estão incluídas na placa e repetições de exemplo adicionais são incluído.

Para os laboratórios sem líquido/placa-manipulação de robôs, mistura de mestre pode ser dispensada usando pipetas multicanais e chapas podem ser carregadas manualmente dentro do instrumento qPCR.

O principal objetivo por trás do desenvolvimento de qKAT foi criar um simples, alta produtividade, alta resolução e econômica método genótipo KIRs para doença estudos de associação. Isto foi conseguido com sucesso desde que qKAT tem sido empregado em investigar o papel do KIR em vários estudos de associação grande doença, incluindo uma variedade de doenças infecciosas, doenças auto-imunes e distúrbios de gravidez^{4, 24 , 25 , 26}.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Oligonucleotides	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit	Bioline	BIO-86020	−
MilliQ water	−	−	−
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor	Eppendorf(or equivalent)	Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
OR
QuBit Fluorometer	Life Technologies	Q33216
Matrix Hydra	Thermo Scientific	109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well	Roche	05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour)	Caliper Life Sciences	204135
Vortex mixer	Biosan	BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL)	Gilson(or equivalent)	F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL)	Starlab (or equivalent)	S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL	STARLAB	E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube	STARLAB	E1450-0200
96-well deep well plate	Fisher Scientific	12194162
LC480 384 Multi-well plates	Roche	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04729757001
Name	Company	Catalog Number	Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1			https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier			http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/