qKAT: nicel Semi-automated yazmaktan katil hücreli immünglobulin benzeri reseptör gen

Özet

Nicel katil hücre immünglobulin benzeri reseptör (kır) yarı otomatik (qKAT) yazarak sayı türü kır genler kendi uygulama için nüfus ve hastalığı Derneği çalışmalarda kopyalamak için basit, yüksek performans ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

Özet

Katil hücre immünglobulin benzeri reseptörler (KIRs) doğal öldürücü (NK) ve T hücreleri, kromozom 19 genlerin Polimorfik bir kümeye tarafından kodlanmış üzerinde inhibitör ve aktive bağışıklık reseptörleri kümesidir. Onların en çok karakterize ligandlar MHC kompleksi (MHC) odağı Kromozom 6 Tarih içinde kodlanmış insan lökosit antijeni (HLA) moleküllerdir. Önemli kanıt onlar bağışıklık, üreme ve nakli, doğru bir şekilde genotip olabilir teknikleri çok önemli hale önemli bir rol oynamak onları. Ancak, yüksek-sıra homoloji, de allelic ve kopya numarası varyasyon, zor yapmak doğru olabilir tasarım yöntemleri ve verimli bir şekilde genotip tüm KIR genler. Geleneksel yöntemler genellikle çözünürlük elde edilen veri, performans, maliyet-etkililik ve ayarlama ve deneyler çalıştırmak için geçen süre sınırlıdır. Biz nicel kır yarı otomatik (qKAT), tipik olarak adlandırılan bir yöntem tarif tüm KIR locus genlerinde Gen kopya numaraları belirlemek yüksek üretilen iş çok katmanlı gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi olduğu. qKAT daha da onları kapsayacak yapısal olarak çok biçimli haplotypes değişimler anlaması için kullanılan yüksek çözünürlüklü kır sayı veri kopyalama, sağlayan basit bir yüksek üretilen iş yöntemidir. Bu kopya sayısı ve haplogrubundan veri büyük ölçekli hastalığı dernekler, Populasyon genetiği gibi ifade ve KIR ve HLAarasındaki işlevsel etkileşimler üzerine araştırmalar çalışmaları için yararlı olabilir.

Giriş

İnsanlarda, katil immünglobulin benzeri reseptör(kır) odağı kromozom 19 lökosit reseptör kompleksi (LRC) içinde uzun kolundaki eşleştirilir. Bu locus yaklaşık 150 kb uzunluğunda ve 15 kır düzenlenmiş genler baş-için-kuyruk içerir. Şu anda bilinir kır loci vardır KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, ve iki psödogenler, KIR2DP1 ve KIR3DP1. Kır genler iki boyutlu (2D) kodlamak ve üç boyutlu (3D) immünglobulin benzeri etki alanı reseptörleri ile kısa (S; aktive) veya uzun (L; inhibitör) doğal öldürücü (NK) hücreleri ve T alt kümeleri tarafından ifade edilir sitoplazmik kuyruk hücreleri. Kopya numarası varyasyon kır locus formları içinde değişken gen içerik¹çeşitli haplotypes sergiledi. Bir yakın kafa kuyruk gen düzenlemesi ve yüksek-sıra homoloji, Sigara allelic homolog rekombinasyon (NAHR), haplotypic değişkenliği için sorumlu olmak için önerilen mekanizmasıdır. 100'den fazla farklı haplotypes nüfus dünya çapında^1,2,3,4' te bildirilmiştir. Bu haplotypes iki ana gruba ayrılmıştır olabilir: A ve B haplotypes. A haplogrubundan 7 kır gen içermektedir: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1ve KIR3DL2, inhibitör kır genler ve aktive kır gen KIR2DS4. Ancak, yukarı sadece KIR haplogrubundan A için homozigoz Avrupa kökenli bireylerin % 70 KIR2DS4^5,6işlevsel olmayan "silme" şeklinde taşımak. Tüm diğer KIR gen kombinasyonları oluşturmak dahil en az bir özel KIR genlerin KIR2DS1, B grubu haplotypes, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, ve KIR2DL5ve genel olarak iki veya daha fazla aktive kır genler içerir.

HLA sınıf ı molekülleri ligandlar için belirli inhibitör reseptörler (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3ve KIR3DL1), aktive reseptörleri (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, olarak tespit edilmiştir KIR2DS5ve KIR3DS1), ve KIR2DL4için hangi diğer inhibitör kır reseptörleri gibi uzun sitoplazmik kuyruk içerir ancak Ayrıca bir ortak olan ekstrasellüler etki alanı pozitif yüklü bir kalıntı sahip benzersiz bir kır diğer aktive kır reseptörleri özelliğidir. Kasanın içinde KIR genler ve HLA genleri versiyonlarının Reseptör ligand etkileşim o şekiller potansiyel NK hücre yanıt bireysel düzeyde^7,8etkiler. Genetik Derneği çalışmaları kanıt belirtilen kır viral direnç (e.g., insan immün yetmezlik virüsü [HIV]⁹ ve hepatit C virüsü [HCV]¹⁰), bir rol oynamaktadır nakli ^{başarısı 11}, gebelik bozuklukları ve üreme başarı^12,13, allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HKHT)^{14,15, sonra nüks karşı koruma risk 16}ve¹⁷Kanser riski.

Kombinasyon yüksek sıra homoloji ve allelic ve haplotypic çeşitlilik sunar sorunları genlerin doğru Genotipleme KIR görevde. Kır genler yazmanız için geleneksel yöntemler arasında fingerprinting astar (SSP) Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)^18,19,20, fingerprinting Oligonükleotid (SSOP) PCR²¹, yoklama ve matris yardımlı lazer desorption iyonlaşma-saat uçuş kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS)²². Bu teknikler sakıncaları onların sadece kısmi bir bireyin genotipi içgörü iken de gerçekleştirmek zahmetli olma sağlamak vardır. Son zamanlarda yeni nesil sıralama (NGS) KIR locus özellikle yazın uygulandı. Bu yöntem çok güçlü olsa da, çalıştırmak pahalı olabilir ve derinlemesine analiz ve veri denetimleri yapmak zaman alır.

qKAT bir yüksek-den geçerek kantitatif PCR yöntemidir. Geleneksel yöntemlerle zahmetli ve zaman alıcı olmakla birlikte, bu yöntem, beş gün içinde yaklaşık 1000 genomik DNA (gDNA) örnekleri çalıştırmak olanak verir ve KIR genotip Gen kopya numarası verir. qKAT her biri iki KIR loci hedefleyen on multiplex reaksiyonları, oluşur ve bir referans gen kır gen göreli miktar için kullanılan genom (STAT6) bir sabit kopya sayısının sayı²³kopyalayın. Bu tahlil başarıyla büyük nüfus panellere ve hastalığı kohort HCV, tip 1 diyabet gibi otoimmün koşulları gibi bulaşıcı hastalıklar ve preeklampsi gibi gebelik bozuklukları ile ilgili olarak bir genetik çalışmalarda kullanılan NK hücre işlevi^1,4,24,25,26anlama amaçlı çalışmalar için destek.

Protokol

1. hazırlık ve DNA dışında kaplama

1. Doğru bir spektrofotometrik veya Fluorometrik enstrüman kullanarak gDNA konsantrasyon ölçmek.
2. DNA 4 ng/µL 96-şey derin-şey tabakta oranında seyreltin. En az bir denetim gDNA örnek bir bilinen kopya numarası ile ve bir şablon sigara denetimi içerir.
3. 96-şey plakaları 450 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi.
4. Sıvı işleme aracı kullanarak dağıtmak quadruplicate 384-de qPCR plakaları üzerine her örnekte böylece her şey 10 ng DNA'ın (2.5 µL/de). En az on 384-şey levha, her qKAT reaksiyon için hazırlayın.
5. GDNA birden fazla 96-şey plaka reçete, tam birim yıkama % 2 çamaşır suyu ve işleme sistemi her 96-şey plaka gDNA örneklerin arasında sıvı iğnelerden temizlemek için ultrasaf su ile gerçekleştirin.
6. DNA, oda sıcaklığında en az 24 saat için temiz bir alan 384-şey levha kuluçka tarafından kuruması.

2. Astar ve sondalar hazırlanması

Not: qKAT on multiplex reaksiyonları oluşur. Her reaksiyon üç astar çift ve özellikle iki KIR genler ve bir referans gen yükseltmek üç Floresans etiketli sondalar içerir. Geliştirilmiş photostability ve uzun sinyal yaşam süreleri sundukları beri oligonucleotides şimdi ATTO boyalar ile etiketlenir böylece Jiang vd.²⁷ ' de Yayınlandı sondalar modifiye edilmiştir. Pre-bölünmemeli astar piyasada bulunan (bakınız Tablo reçetesi) oluşur.

1. Astar bileşimleri her reaksiyon başı olarak Tablo 1' de verilen dilutions için hazır olun.
2. Sonda kombinasyonları her reaksiyon başı olarak Tablo 1için hazır olun. Kasanın yapmadan önce tek tek her sonda sınayın.

3. Master Mix hazırlanması

Not Aşağıda belirtilen birimleri bir qKAT reaksiyon 10 x 384-şey kaplamalar kümesi üzerinde gerçekleştirmek için vardır.

1. 384-şey Tabaklarda kaplama gDNA örnekleri tamamen kuru olduğundan emin olun. Buz üstünde tüm adımları yapmak ve floresan etiketli probları fotoğraf ve ısı duyarlı olduğundan mümkün olduğu kadar gün ışığına maruz kaplı reaktifler tutun.
2. QPCR arabellek, astar ve sonda aliquots 4 ° C'de defrost
3. Buz üzerinde 10 x 384-şey plakalar için 18.86 mL ultrasaf su, 20 mL qPCR arabellek, preprepared astar kombinasyonu 1000 µL ve preprepared sonda birleşimi (Tablo 2) 180 µL ekleyerek ana bir karışım hazır olun.
4. Ana karışımı eşit bir 96-derin iyi plaka 415 µL her kuyuya pipetting bir çok kanallı pipet kullanarak dağıtmak. Bu plaka bir buz kutusuna gelen ışık kapalı tutun.
5. Sıvı işleme enstrüman kullanarak, kurutulmuş gDNA ile 384-şey plaka her kuyuya ana karışımı 9.5 µL dağıtmak. Plaka bir folyo ile kapatın ve hemen 4 ° C'de yer Sistem işleme sıvı iğnelerden her plaka arasında su ile yıkanır sağlanması kalan plakaları için bu işlemi yineleyin.
6. 450 x g 3 dk de 384-şey plakaları santrifüj kapasitesi ve gecede 4 ° C'de veya arasında 6-12 h DNA resuspend için ve herhangi bir hava kabarcıkları dağılımı için kuluçkaya.

4. qPCR tahlil

1. Gecede kuluçka vasıl 450 x g için kalan herhangi bir hava kabarcıkları dağılımı 3 dk santrifüj kapasitesi.
2. Otomasyon amacıyla, qPCR makine (örneğin, LightCycler 480) Mikroplaka işleyicisine bağlanmak ( Tablo malzemelerigörmek). Program Mikroplaka işleyicinin ışıktan korunan bir soğutulmuş depolama dock qPCR makineden tabak yerleştirin.
   Not deneyleri teorik olarak, diğer qPCR makine ile uyumlu optik ayarları üzerinde çalışması gerektiğini.
3. Aşağıdaki bisiklet koşullarını kullanın: 95 ° C 5 min için takip 95 ° C 40 döngüsü tarafından 15 s ve 50 66 ° C için veri toplama 66 ° C'de ile s
4. Çalışma tamamlandıktan sonra robot plaka qPCR makineden toplamak ve atma havuzda yer var.

5. çalıştırma sonrası analizi

1. Amplifikasyon sonra ikinci türev maksimum yöntemi veya uyum Puan yöntemi qPCR makine yazılım programıyla miktar döngüsü (Cq) değerleri hesaplamak (bkz. Tablo malzemeler), aşağıdaki adımları izleyerek.
2. QPCR yazılımını açın ve Navigator sekmede bir tabak kaydedilmiş tepki deneme dosyasını açın.
3. İkinci türev maksimum yöntemiyle analizi için analiz sekmesini seçin ve yeni bir analiz Abs Quant/Second türev Max yöntemini kullanarak oluşturun.
   1. Oluştur yeni analiz penceresinde analiz türünü seçin: Abs Quant/Second türev Max yöntemi, alt: tüm örnekleri, programı: amplifikasyon, adı: Rx-DFO ( x nerede tepki numarası).
   2. Filtre tarak ve VIC/HEX/Yellow555 (533-580)seçin. Bu STAT6 için toplanan veriler seçilir sağlar.
   3. Renk tazminat VIC/HEX/Yellow555(533-580)için seçin. Hesaplar' ı tıklatın. Bu Fam (465-510) ve Cy5/Cy5.5(618-660) için yineleyin. Dosya Kaydet' i tıklatın.
4. Uyum Puan yöntemiyle analizi için Abs Quant/Fit noktaları analiz sekmesinde seçin.
   1. Oluştur yeni analiz penceresinde analiz türünü seçin: Abs Quant/uyum Puan yöntemi, alt: tüm örnekleri, programı: amplifikasyon, adı: RxF-DFO ( x nerede tepki numarası).
   2. Doğru filtreleri ve renk tazminatlar için STAT6 ve her kır genlerin (Fam/Cy5) seçin. Noiseband sekmesinde, arka plan gürültü çıkarmak için gürültü grubu ayarlayın.
   3. Analiz sekmesi uygun Puan 3 ' e ayarlayın ve gösteri Puan Sığdır' ı. Hesaplar' ı tıklatın. Dosya Kaydet' i tıklatın.

6. ihracat sonuçları

1. QPCR yazılımında Navigator açın sekmesini seçin Toplu iş sonuçlarını aktarın.
2. Deney dosyaları kaydedilir ve pencerenin sağ tarafında bölümüne transfer dosyaları içeren klasörü açın. İleri' yi tıklatın. Adı ve dışa aktarma dosyasının konumunu seçin.
3. Analiz türü Abs Quant/Second türev Max yöntemi veya Abs Quant/Fit noktalarıseçin. İleri' yi tıklatın. Dosya, ihracat klasör ve analiz türünün adını doğru olduğundan ve verme işlemini başlatmak için İleri ' yi tıklatın emin olun.
4. Verme durumu Okolana kadar bekleyin. Ekran otomatik olarak bir sonraki adıma hareket edecek. Seçilen tüm dosyalar başarıyla verildiğini kontrol böylece dosya sayısı başarısız oldu = 0. Bitti' yi tıklatın.
5. Komut dosyaları split_file.pl ve roche2sds.pl verilen plakaları her plaka için bireysel tepkiler içine bölmek için kullanın.
   Not komut dosyalarını istek/GitHub sağlanır.

7. kopya sayı hesaplamaları

1. Kopya numara analiz yazılımı (örneğin, CopyCaller) açın. Alma gerçek zamanlı PCR sonuçları dosyasını seçin ve roche2sds.pltarafından oluşturulan metin dosyaları yükleyin.
2. Analiz seçin ve her iki seçme Kalibratör örnek bilinen kopya numarası ile veya en sık kopya numarasıseçerek analiz yapmak. Bkz. Tablo 5 kır genler genellikle Avrupa kökenli nüfus içinde gözlenen en sık kopya sayısı için.

8. veri kalite denetimleri

1. KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 komut dosyası kullan R. R bir elektronik tabloya tüm plakaları kopya sayı veri birleştirmek için.
   Not komut dosyalarını istek/GitHub sağlanır.
2. Kır genler (Tablo 6) için bilinen bağlantı dengesizliği (LD) için uygun olmayan örnekleri için kopya numara analiz yazılımı ham veri yeniden denetleyin.

Sonuçlar

Kopya numara analizi ΔΔCq yöntemine göre tahmini ve tahmini kopya numarası sağlayan kopya numara analiz yazılım, dosyaları dışa aktararak yürütülen olabilir.

Kopya sayısı da kontrol DNA örnekleri plaka üzerinde veya en sık Gen kopya sayısı (Tablo 5) giren tarafından bilinen kopya sayısına dayalı tahmin edilebilir. Şekil 1 gösterir KIR2DL4 ve KIR3DS1gibi referans gen hedefleyen bir tepki için bir tabak sonuçlarını STAT6. En sık kopya KIR2DL4, kır odağı bir çerçeve gen numarasıdır iki kopya, KIR3DS1, aktive bir gen için en sık kopya numarası bir kopya ise. Rakam sonuçlarında qPCR yazılım ve qPCR verilerinden oluşturulan kopya sayı veri üzerinde gözlenen PCR güçlendirme araziler göster. Görüldüğü gibi tahlil 0, 1, 2, 3 ve 4 kır Gen kopya numaraları arasında ayrım yapabiliyor. Kopya numara analiz yazılımı da bir kopya sayısı dağılımı bir pasta grafik veya çubuk grafik olarak plaka arasında sağlar. Kopya sayı tahmin etkinlik örnekleri ile daha yüksek bir kopya sayı için düşüktür.

Reaksiyonlar, gDNA, tampon, astar ve sondalar, kullanılan malzemelerin kalitesi elde edilen sonuçları doğruluğunu etkileyebilir. Ancak, sonuçlarında uyumsuzluk nedeniyle DNA toplama bir plaka arasında varyasyon nedeni büyük olasılıkla. 260/280 ve 260 kullanarak ölçülen ayıklanan gDNA saflığı/230 oranları, ayrıca kalitesi üzerinde bir etkisi olabilir. 2-2,2 1,8-2 ve 260/230 a oranı 260/280 oranında arzu vardır. Bir plaka üzerinde bir DNA düzensiz aralığı konsantrasyonları yüksek bir değişkenlik örnekleri ve uyumsuzluk tahmini kopya numarası aralığında arasındaki eşik döngüsü (C_t) yol açabilir. Sonuçlar Şekil 2 C_t değerleri arasında bir plaka arasında eşitsizlik kopya numarası tahminindeki doğruluğu üzerinde olabilir etkisi gösterir. Kırmızı çizgi bir örnek için tahmini kopya numarası aralığını gösterir ve ideal olarak, bir tamsayı olarak mümkün olduğunca yakın olmalıdır.

Bir kez analiz, sayı veri kopyalama, 96-şey biçiminde elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarılabilir. Biz bir R komut dosyası (istek üzerine temin edilebilir) bir elektronik tabloya bir küme olarak çalıştırılan tüm 10 plakaları kopya sayı veri birleştirmek için kullanılır. Yayınlanan verilerden çoğunlukla Avrupa kökenli nüfus KIRs hakkında tahmin kır karmaşık¹çeşitli genler arasındaki mevcut LD kuralları sağlar. Bu tahminler (Tablo 6) elde edilen kopya numara sonuçları karşıdan akış denetimi yapmak için kullanılır. Genler arasında tahmin edilen LD için uygun olmayan örnekleri olağandışı çok biçimlilik veya haplotypic yapısal farklılıklar içeriyor olabilir. Protokol açıklayan bir akış çizelgesi şekil 3' te gösterilmiştir.

Kır haplogrubundan tanımlayıcı (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) olarak adlandırılan bir araç zina ile haplotypes veri kümesinden kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Zina bir Avrupa kökenli nüfus¹' gözlenen başvuru haplotypes listesini temelinde çalışır. Ancak, bu araç da başvuru haplotypes özel bir kümesi için onun yerine kullanılacak sağlar. Üç ayrı dosyaları oluşturulur; ilk dosyanın bir örneği için tüm haplogrubundan birleşimleri listelenir, ikinci dosya kesilmiş en yüksek kombine frekansları var haplotypes birleşimlerinin listesini sağlar ve üçüncü dosyası, haplotypes atanamaz örnekleri listeler. Sigara-atama haplotypes, roman haplotypes bir göstergesi olarak kullanılabilir.

Şekil 1: tepki için bir tabak temsilcisi sonuçları 5 numara. (A) bu paneli gösterir amplifikasyon araziler. (B) bu panel programları numara araziler kopyalar. (C) bu paneli kopya numarası dağıtım gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: bir tabak tepki için değişken bir DNA konsantrasyon ile temsilcisi sonuçları 5 numara. (A) bu paneli gösterir amplifikasyon araziler. (B) bu panel programları numara araziler kopyalar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: qKAT iletişim kuralının akış şeması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tahlil	Genler	İleri astar	Konsantrasyonu (nM)	Ters astar	Konsantrasyonu (nM)	Probları	Konsantrasyonu (nM)
No 1	3DP1	A4F	250	A5R	250	P4a	150
	2DL 2	2DL2F4	400	C3R2	600	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 2	2DS2	A4F	400	A6R	400	P4a	200
	2DL 3	D1F	400	1ÖK	400	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 3	3DL 3	A8F	500	A8R	500	P4a	150
	2DS4Del	2DS4Del	250	2DS4R2	250	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 4	3DL1e4	B1F	250	B1R	125	P4b	150
	3DL1e9	D4F	250	D4R2	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 5	3DS1	B2F	250	B1R	250	P4b	150
	2DL 4	C1F	200	C1R	200	P5B - 2DL 4	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 6	2DL 1	B3F	500	B3R	125	P4b	150
	2DP1	D3F	250	D3R	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 7	2DS1	B4F	500	B4R	250	P4b	150
	2DL 5	D2F	500	2ÖK	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 8	2DS3	B5F	250	B5R	250	P4b	150
	3DL2e9	D4F	250	D5R	125	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 9	3DL2e4	A1F	200	A1R	200	P4a	150
	2DS4FL	2DS4FL	250	2DS4R2	500	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 10	2DS5	B6F2	200	B6R3	200	P4b	150
	2DS4	C5F	250	C5R	250	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150

Tablo 1: kombinasyon ve astar ve her qKAT tepki olarak kullanılan problar konsantrasyon ²⁷ .

Reaksiyon					Astar Aliquots (µL)				Sonda Aliquots (µL)
R1	3DP1	A4F	A5R	2DL2F4	C3R2	SU	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DL 2	100	100	160	240	200	80	80	60	60	60
R2	2DS2	A2F	A6R	D1F	1ÖK	SU	STAT6F	STAT6R	P4A	P9	PSTAT6
	2DL 3	160	160	160	160	160	80	80	80	60	60
									Not: daha az MasterMix suda 20 µL gerekir
R3	3DL 3	A8F A8FB	A8R	2DS4DELF	2DS4R2	SU	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4DEL	100 100	200	100	100	200	80	80	60	60	60
R4	3DL1E4	B1F	B1R	D4F	D4R2	SU	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL1E9	100	50	100	200	350	80	80	60	60	60
R5	3DS1	B2F	B1R	C1F	C1R	SU	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B - 2L 4	PSTAT6
	2DL 4	100	100	80	80	440	80	80	60	60	60
R6	2DL 1	B3F	B3R	D3F	D3R	SU	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DP1	200	50	100	200	250	80	80	60	60	60
R7	2DS1	B4F	B4R	D2F	2ÖK	SU	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DL 5	200	100	200	200	100	80	80	60	60	60
R8	2DS3	B5F	B5R	D4F	D5R	SU	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL2E9	100	100	100	50	450	80	80	60	60	60
R9	3DL2E4	A1F	A1R	2DS4WTF	2DS4R2	SU	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4WT	80	80	100	200	340	80	80	60	60	60
R10	2DS5	B6F2	B6R3	C5F	C5R	SU	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B	PSTAT6
	2DS4TOTAL	80	80	100	100	440	80	80	60	60	60

Tablo 2: astar yapmak ve birlikte aliquots soruşturma birimleri (µL) 100 µM astar/sonda hisse senedi çözümleri.

Adı	Yön	5´ değişiklik	3´ değişiklik	Sıra (5' →3')	Uzunluğu	TM	GC %	EXoN	Pozisyon
P4a	Anlamda	FAM	BHQ-1	TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA	27	60	44.4	4	425-451
P4b	Antisens	FAM	BHQ-1	AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T	28	62	50	4	576-603
P5B	Anlamda	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG	25	60	52	5	828-852
P5B - 2DL 4	Anlamda	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG	25	61	56	5	828-852
P9	Anlamda	ATTO647N	BHQ-2	CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC	24	60	62,5	9	1246-1269
PSTAT6		ATTO550	BHQ-2	CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT	26	62	50

Tablo 3: qKAT içinde kullanılan problar listesi ^{1, 27}. 5' sonunda oligo probları P5b, P5b - 2 DL 4, P9 ve PSTAT6 kullanılan floresan boyalar ATTO boyalar için modifiye edilmiştir.

Gen	Astar	Yön	Sıra (5´-3´)		Uzunluğu	TM	GC %	EXoN	Pozisyon	Amplicon (bp)	Gen cevapsız
3DL2e4	A1F	İleri	GCCCCTGCTGAA ATCAGG		18	52	61.1	4	399-416	179	3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
	A1R	Ters	CTGCAAGGACAG GCATCAA		19	53	52.6		559-577		3DL 2 * 048
3DP1	A4F	İleri	GTCCCCTGGTGA AATCAGA		19	49	52.6	4	398-416	112	Hiçbiri
	A5R	Ters	GTGAGGCGCAAA GTGTCA		18	52	55.6		492-509		Hiçbiri
2DS2	A2F	İleri	GTCGCCTGGTGA AATCAGA		19	49	52.6	4	398-416	111	Hiçbiri
	A6R	Ters	TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT		21	51	42,9		488-508		Hiçbiri
3DL 3	A8Fa	İleri	GTGAAATCGGGA GAGACG		18	50	55.6	4	406-423	139	Hiçbiri
	A8Fb	İleri	GGTGAAATCAGG AGAGACG		19	50	52.6		405-423		3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
	A8R	Ters	AGTTGACCTGGG AACCCG		18	51	61.1		526-543		Hiçbiri
3DL1e4	B1F	İleri	CATCGGTCCCAT GATGCT		18	51	55.6	4	549-566	85	3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
	B1R	Ters	GGGAGCTGACAA CTGATAGG		20	52	55		614-633		3DL 1 * 00502
3DS1	B2F	İleri	CATCGGTTCCAT GATGCG		18	51	55.6	4	549-566	85	3DS1 * 047; 3 DL 1 * 054 kadar teslim alabilirsiniz.
	B1R	Ters	GGGAGCTGACAA CTGATAGG		20	52	55		614-633		Hiçbiri
2DL 1	B3F	İleri	TTCTCCATCAGT CGCATGAC		20	52	50	4	544-563	96	2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
	B3R	Ters	GTCACTGGGAGC TGACAC		18	50	61.1		622-639		2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1	B4F	İleri	TCTCCATCAGTC GCATGAA		19	51	47.4	4	545 563	96	2DS1 * 001
	B4R	Ters	GGTCACTGGGAG CTGAC		17	49	64.7		624-640		Hiçbiri
2DS3	B5F	İleri	CTCCATCGGTCG CATGAG		18	53	61.1	4	546-563	96	Hiçbiri
	B5R	Ters	GGGTCACTGGGA GCTGAA		18	51	61.1		624-641		Hiçbiri
2DS5	B6F2	İleri	AGAGAGGGGACG TTTAACC		19	50	52.6	4	475-493	173	Hiçbiri
	B6R3	Ters	TCCAGAGGGTCA CTGGGC		18	53	66,7		630-647		2DS5 * 003
2DL 4	C1F	İleri	GCAGTGCCCAGC ATCAAT		18	52	55.6	5	808-825	83	Hiçbiri
	C1R	Ters	CCGAAGCATCTG TAGGTCT		19	52	52.6		872-890		2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2	2DL2F4	İleri	GAGGTGGAGGCC CATGAAT		19	52	57,9	5	778-796	151	2DL 2 * 009; 782G a ana bilgisayarına değişti
	C3R2	Ters	TCGAGTTTGACC ACTCGTAT		20	51	45		909-928		Hiçbiri
2DS4	C5F	İleri	TCCCTGCAGTGC GCAGC		17	57	70.6	5	803-819	120	Hiçbiri
	C5R	Ters	TTGACCACTCGT AGGGAGC		19	52	57,9		904-922		2DS4 * 013
2DS4Del	2DS4Del	İleri	CCTTGTCCTGCA GCTCCAT		19	54	57,9	5	750-768	203	Hiçbiri
	2DS4R2	Ters	TGACGGAAACAA GCAGTGGA		20	53	50		933-952		Hiçbiri
2DS4FL	2DS4FL	İleri	CCGGAGCTCCTA TGACATG		19	53	57,9	5	744-762	209	Hiçbiri
	2DS4R2	Ters	TGACGGAAACAA GCAGTGGA		20	53	50		933-952		Hiçbiri
2DL 3	D1F	İleri	AGACCCTCAGGA GGTGA		17	48	58.8	9	1180-1196	156	Hiçbiri
	1ÖK	Ters	CAGGAGACAACT TTGGATCA		20	50	45		1316-1335		2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 ve 2DL 3 * 01802
2DL 5	D2F	İleri	CACTGCGTTTTC ACACAGAC		20	52	50	9	1214-1233	42U	2DL5B * 011 ve 2DL5B * 020
	2ÖK	Ters	GGCAGGAGACAA TGATCTT		19	49	47.4		1315-1333		Hiçbiri
2DP1	D3F	İleri	CCTCAGGAGGTG ACATACGT		20	53	55	9	1184-1203	121	Hiçbiri
	D3R	Ters	TTGGAAGTTCCG TGTACACT		20	50	45		1285-1304		Hiçbiri
3DL1e9	D4F	İleri	CACAGTTGGATC ACTGCGT		19	52	52.6	9	1203-1221	93	3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
	D4R2	Ters	CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA		23	53	43.5		1273-1295		3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9	D4F	İleri	CACAGTTGGATC ACTGCGT		19	52	52.6	9	1203-1221	156	Hiçbiri
	D5R	Ters	GACCTGACTGTG GTGCTCG		19	54	63,2		1340-1358		Hiçbiri
STAT6	STAT6F	İleri	CCAGATGCCTAC CATGGTGC		20	54	60			129
	STAT6R	Ters	CCATCTGCACAG ACCACTCC		20	54	60

Tablo 4: qKAT içinde kullanılan astar dizisi ^{1, 27}.

Kır Gen		3DL 3	2DS2	2DL 2	2DL 3	2DP1	2DL 1	3DP1	2DL 4	3DL 1 EX9	3DL 1 EX9	3DS1	2DL 5	2DS3	2DS5	2DS1	2DS4 Toplam	2DS4 FL	2DS4 DEL	3DL 2 EX4	3DL 2 EX9
En sık kopya numarası		2	1	1	2	2	2	2	2	2	2	1	1	1	1	1	2	1	1	2	2

Tablo 5: En sık kopya numarası Kır yaygın olarak gözlenen Avrupa kökenli örneklerinde genler.

	Avrupa nüfus tabanlı qKAT için bağlantı dengesizlik kuralları				Kopya numarası onay
1	KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 ve KIR3DL2 framework genler üzerinde her iki haplotypes mevcut bulunmaktadır.				KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 ve KIR3DL2 = 2
2	KIR2DS2 ve KIR2DL2 LD içinde birbirleriyle olan				2DS22 DL 2 =
3	KIR2DL2 ve KIR2DL3 aynı gen allelleri vardır				2 DL 2+2 DL 3= 2
4	KIR2DP1 ve KIR2DL1 LD içinde birbirleriyle olan				2DP12 DL 1 =
5	EXoN 4 KIR3DL1 ve KIR3DL2 sırasıyla exon 9 KIR3DL1 ve KIR3DL2 eşittir.				3DL1ex43DL1ex9 = ve 3DL2ex4=3DL2ex9
6	KIR3DL1 ve KIR3DS1 gen vardır				3 DL 1+3DS1= 2
7	LD KIR2DL5 ile KIR2DS3 ve KIR2DS5 bulunmaktadır				2DS3+2DS5=2 DL 5
8	KIR3DS1 ve KIR2DS1 LD içinde vardır				3DS12DS1 =
9	KIR2DS1 ve KIR2DS4Total varlığı bir haplogrubundan birlikte kullanılamaz				2DS1+2DS4TOTAL= 2
10	KIR2DS4FL ve KIR2DS4del KIR2DS4TOTAL türevleri vardır				2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tablo 6: arasında bağlantı dengesizlik Kır Avrupa kökenli nüfus yaygın olarak gözlenen genlerin kopya sayı veri kontrol etmek için kullanılan ^1,27.

Tartışmalar

Biz kopya kır genler. numara yazarak kolaylaştırır qKAT olarak adlandırılan bir roman yarı otomatik yüksek üretilen iş yöntemi, açıklanan Düşük işlem hacmi ve yalnızca son derece Polimorfik bu genlerin olup belirtebilirsiniz geleneksel yöntemler üzerinde SSP-PCR gibi bir gelişme yöntemidir.

Elde edilen kopya sayı verilerin doğruluğunu kalite ve konsantrasyon-homojenlik reaktifleri kalite ve gDNA örnekleri de dahil olmak üzere birden fazla etkene bağlıdır. Konsantrasyon plaka arasında farklılığı kopya numarası hesaplama hataları neden olabilir beri kalitesini ve doğruluğunu gDNA örnekler bir plaka üzerindeki son derece önemlidir. Deneyleri Avrupa kökenli örnek kümesi'ni kullanma doğrulanmış beri tabur dünyanın diğer bölgelerinden gelen verileri daha kapsamlı denetimler gerektirir. Bu formda çıkarma veya non-spesifik astar/sonda bağlama örneklerini kopya numarası varyasyon yanlış yorumlandığını değil sağlamaktır.

Deneyleri tasarlanmış ve üretilen yüksek-iş çalıştırmak için en iyi duruma getirilmiş olsa da, daha az numunelerinin çalışılabilmesi için değiştirilebilir. Güven metrik kopya numara analiz yazılımı olarak daha az örnekleri analiz ederken etkilenir ama bu kontrol genomik DNA örnekleri ile bilinen bir kır Gen kopya numarası plaka üzerinde bulunan ve ek örnek çoğaltır geliştirilebilir dahil.

Laboratuarlar sıvı/plaka-taşıma robotlar olmadan için ana mix çok kanallı Pipetler kullanarak reçete ve plakaları el ile qPCR araç yüklenebilir.

QKAT gelişimi arkasındaki temel amacı bir basit, yüksek performans, yüksek çözünürlüklü ve maliyet-etkin yöntem genotip KIRs hastalığı için dernek çalışmaları yaratmaktı. QKAT kır rolde bulaşıcı hastalıklar, otoimmün koşullar ve gebelik bozuklukları^4, bir dizi de dahil olmak üzere birçok büyük hastalığı Derneği araştırma soruşturma istihdam beri bu başarıyla sağlandı ^{24 , 25 , 26}.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Oligonucleotides	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit	Bioline	BIO-86020	−
MilliQ water	−	−	−
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor	Eppendorf(or equivalent)	Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
OR
QuBit Fluorometer	Life Technologies	Q33216
Matrix Hydra	Thermo Scientific	109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well	Roche	05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour)	Caliper Life Sciences	204135
Vortex mixer	Biosan	BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL)	Gilson(or equivalent)	F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL)	Starlab (or equivalent)	S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL	STARLAB	E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube	STARLAB	E1450-0200
96-well deep well plate	Fisher Scientific	12194162
LC480 384 Multi-well plates	Roche	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04729757001
Name	Company	Catalog Number	Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1			https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier			http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/