qKAT: キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子の定量的半自動化された入力

Jyothi Jayaraman; Vitalina Kirgizova; Da Di; Christopher Johnson; Wei Jiang; James A. Traherne

doi:10.3791/58646

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要約

定量のキラー細胞免疫グロブリン様受容体 (KIR) 半自動入力 (qKAT) は、人口と病気の関連研究での応用数型KIRの遺伝子をコピーする簡単な高スループット、およびコスト効率の高い方法です。

要約

キラー細胞免疫グロブリン様受容体 (KIRs)、ナチュラルキラー (NK) と 19 番染色体上の遺伝子の多形クラスターによって符号化される T 細胞の抑制、活性化の免疫受容体のセットです。最も特徴付けられるリガンドは染色体 6 の主要な組織適合性の複雑な (MHC) 軌跡内にエンコードされている人間の白血球の抗原 (HLA) 分子。免疫・再生・移植、遺伝子型を正確にできる技術を持っている重要なことで重要な役割を果たしているという相当な証拠があるそれら。ただし、高配列相同性と同様、対立およびコピー数変化を難しく正確にすることができます設計手法と効率的に遺伝子型すべてKIRの遺伝子。従来の方法は、得られたデータの解像度、スループット、費用対効果、およびセットアップと実験の実行に要する時間通常制限されます。定量的なキール半自動入力 (qKAT) と呼ばれる手法について述べるキール軌跡のすべての遺伝子の遺伝子のコピー数を決定することができます高速多重リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応法であります。qKAT は、データを提供できる高解像度キールコピー数、それらを包含構造多型のハプロタイプの変化を推論するさらに使用できる単純な高スループット方法です。このコピーの数とハプロタイプのデータを式とキールとHLAとの間の機能的相互作用に関する調査と同様に大規模病協会、集団遺伝学の研究のために有益にすることができます。

概要

人間、キラー免疫グロブリン様受容体の(キール)、白血球受容体複合体 (LRC) 内 19 番染色体の長腕に遺伝子座が割り当てられています。この軌跡は、長さ約 150 kb で 15 KIR遺伝子配置頭にテールが含まれています。現在知られているKIRの遺伝子座がKIR2DL1、 KIR2DL2/KIR2DL3、 KIR2DL4、 KIR2DL5A、 KIR2DL5B KIR2DS1 5、 KIR3DL1/KIR3DS1 KIR3DL2-32 つの的偽遺伝子、 KIR2DP1 、 KIR3DP1。KIR遺伝子は二次元 (2 D) のエンコードと短い (S; 活性化) と 3次元 (3 D) 免疫グロブリン様ドメイン受容体または長い (L; 抑制) 細胞質尾、ナチュラルキラー (NK) 細胞と T のサブセットで表されるセルです。コピー数変異キール軌跡フォーム内で変数遺伝子コンテンツ¹多様なハプロタイプを展示しました。近くに頭-尾の遺伝子配列と高い相同によって促進される非対立遺伝子相同組換え (NAHR) は、haplotypic 変動を担当する提案メカニズムです。100 以上の異なるハプロタイプは、人口世界中¹^,²^,³^,⁴で報告されています。すべてのこれらのハプロタイプは、2 つの主要なグループに分けることができる: A と B のハプロタイプ。A ハプロタイプには 7 KIRの遺伝子が含まれています: KIR3DL3、 KIR2DL1、 KIR2DL3、 KIR2DL4、 KIR3DL1、 KIR3DL2、抑制のKIR遺伝子と活性化キール遺伝子KIR2DS4。ただしをキールのホモは、ヨーロッパ起源の人の 70% にハプロタイプは専ら運ぶKIR2DS4⁵^,⁶の非機能的な「削除」フォーム。すべての他のKIRの遺伝子の組み合わせを形成グループ B ハプロタイプ、特定のKIR遺伝子KIR2DS1の少なくとも 1 つを含むKIR2DS2、 KIR2DS3、 KIR2DS5、 KIR3DS1、 KIR2DL2、KIR2DL5と通常 2 つ以上の活性化KIR遺伝子が含まれます。

HLA のクラス I の分子特定抑制性受容体 (KIR2DL1、 KIR2DL2、 KIR2DL3とKIR3DL1) 活性化受容体 (KIR2DS1、 KIR2DS2、 KIR2DS4の配位子として識別されています。KIR2DS5、およびKIR3DS1)、 KIR2DL4は他の抑制のキールの受容器のような長い細胞質尾が含まれていますが、共通である細胞外ドメインに近い正荷電残基がありますユニークなキールとその他の活性化のキールの受容体の機能。KIR 遺伝子と HLA 遺伝子の変異の組み合わせは、その図形潜在的な NK 細胞応答性個々レベル⁷^、⁸時を受容体リガンド相互作用に影響します。遺伝的関連研究からの証拠はキールが (例えば.、ひと免疫不全ウイルス [HIV]⁹ C 型肝炎ウイルス [c 型肝炎]¹⁰) ウイルスの抵抗の役割を果たしていることを示している^{の移植の成功11}、妊娠障害と繁殖成功¹²^,¹³、同種造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植)¹⁴^,¹⁵^{後、再発に対する保護のリスク} ¹⁶、および癌の¹⁷のリスク。

高配列相同性の対立遺伝子の組み合わせと haplotypic の多様性は、正確なジェノタイピングKIRの遺伝子の作業の課題を提示。KIR遺伝子を入力する従来の方法は、シーケンス特定のプライマー (SSP) ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)¹⁸^,¹⁹^、²⁰、シーケンス固有オリゴヌクレオチドプローブ (SSOP) PCR²¹とマトリックス支援レーザ脱イオン化-時間の飛行質量分析法 (MALDI-TOF MS)²²。これらの手法の欠点は、一方、実行する骨の折れるだけ個人の遺伝子型に部分的な洞察力を提供すること。最近特にキール軌跡を入力する次世代シーケンサー (NGS) が適用されています。このメソッドは非常に強力なそれは、実行する高価なことができます、詳細な解析やデータのチェックを行う時間がかかる。

qKAT は、高スループットの定量的 PCR 法です。従来の方法は手間と時間のかかる、このメソッドは 5 日間で約 1,000 のゲノム DNA (gDNA) のサンプルを実行することが可能になり、 KIR遺伝子と同様の遺伝子コピー数を与えます。qKAT から成っているそれぞれの目標 2 つのキール座位 10 の多重反応と、 KIRの遺伝子の相対的な定量化のため使用されるゲノム (STAT6) の固定コピー数の 1 つの参照の遺伝子コピー数²³。この試金は遺伝的提供し同様、人口パネルや 1 型糖尿病のような自己免疫疾患、c 型肝炎などの感染症、妊娠中毒症などの妊娠障害疾患コホート研究で正常に使用されていますNK ・細胞機能¹^,⁴^,²⁴^,²⁵^,²⁶を理解することを目的とした研究を支えます。

プロトコル

1. 準備と DNA からめっき

吸光光度または蛍光器具を使用して gDNA 濃度を正確に測定します。
DNA を深井戸 96 ウェルプレートの 4 ng/μ L に希釈します。知られているコピー数と少なくとも 1 つの gDNA サンプルおよび 1 つの非テンプレートコントロールが含まれます。
2 分の 450 x gで 96 ウェルのプレートを遠心します。
各ウェルに 10、qPCR 384 ウェルプレートに 4 連の各サンプルを調剤リキッドハンドリング装置を用いて DNA の ng (2.5 μ L/ウェル)。少なくとも 10 の 384 ウェルプレートを各 qKAT の反作用のための 1 つを準備します。
GDNA は 1 つ以上の 96 ウェルプレートから調剤されて場合は、2% の漂白剤と純水 gDNA サンプルの各 96 ウェルプレート間のシステムの処理液の針をきれいにフルボリューム洗浄を実行します。
少なくとも 24 時間室温で清潔で 384 ウェルプレートの孵化によって DNA を風乾します。

2. プライマーおよびプローブの準備

注: qKAT は 10 の多重反応で構成されています。各反応には、プライマーの 3 つのペアと 2 つのKIR遺伝子と 1 つの参照の遺伝子を増幅する具体的には 3 つの蛍光標識プローブが含まれています。江ら²⁷に掲載されたプローブは、オリゴヌクレオチドが今付けられて ATTO 色素改善光安定性と長い信号の有効期間を提供するので、変更されました。前検体プライマーの組み合わせは、市販 (材料の表を参照してください)。

表1 希釈に従って各反作用のためのプライマー組み合わせを準備します。
表 1に従って各反作用のためのプローブの組み合わせを準備します。組み合わせを行う前に各それぞれのプローブをテストします。

3. マスターミックスの準備

メモ下記のボリュームは、10 x 384 ウェルプレートのセットに qKAT 反応の 1 つを実行するため。

384 ウェルプレートにメッキ gDNA サンプルが完全に乾燥を確認します。氷の上のすべての手順を行い、蛍光標識プローブが写真と熱敏感なので可能な限り、光への暴露から覆われて試薬を維持します。
QPCR バッファー、プライマーおよびプローブ 4 ° C で因数を解凍します。
氷の上 18.86 mL 純水 20 mL、qPCR バッファー、作り置きのプライマー組み合わせの 1,000 μ L 作り置きプローブの組み合わせ (表 2) の 180 μ L を追加することによって 10 x 384 ウェルプレート用マスターミックスを調製します。
415 μ L を分注を各ウェルに、マルチチャンネルピペットを使用して深い 96 well プレートにマスターミックスを均等に分散します。このプレートを光から覆われているアイスボックスにしてください。
液体処理機器を使用して、乾燥された gDNA を 384 ウェルプレートの各ウェルにマスターミックスの 9.5 μ L を調剤します。箔押しの入ったプレートをシール、すぐに 4 ° C で液体処理システムの針が各プレートの間に水で洗っていることを確認、残りの板は、このプロセスを繰り返します。
3 分の 450 x g で 384 ウェルプレートを遠心し、4 ° c 夜間、または 6-12 h に DNA を再懸濁します、空気の泡を放散する間、それらを孵化させなさい。

4. qPCR 測定

一晩インキュベート後残り空気の泡を放散する 3 分の 450 × gで遠心分離機します。
自動化のために、qPCR マシン (例えば、LightCycler 480) をマイクロプレートハンドラーに接続 (材料の表を参照してください)。プログラムは、光から保護冷却貯蔵ドックから qPCR マシンにプレートを配置するマイクロプレートハンドラー。
注法、理論的で動作するはず他の qPCR のマシンに互換性のある光設定。
次のサイクリング条件を使用: 95 ° C、5 分が 95 ° C の 40 のサイクルが続く 15 s の 66 ° C、50 秒、66 ° C でデータ収集を
実行が完了したら、一度、qPCR マシンからプレートを収集し、破棄ドックのロボットを持っています。

5. 実行後の分析

増幅後 qPCR マシンのソフトウェアで、2 番目の派生最大メソッドまたはフィット点メソッドを使用して定量化サイクル (Cq) 値を計算 (材料の表を参照)、以下の手順します。
QPCR ソフトウェアを開き、1 つのプレートの保存された反応実験ファイルナビゲーターのタブで開きます。
2 番目の派生最大法を用いた解析、[分析] タブを選択し、Abs Quant/Second 誘導体 Max メソッドを使用して新しい分析を作成します。
1. 作成新しい解析] ウィンドウで、[解析タイプを選択: Abs Quant/Second 誘導体 Max メソッドサブセット:すべてのサンプルプログラム:増幅名前: Rx DFO ( xは反応数)。
2. フィルター櫛とヴィック/六角/Yellow555 (533-580)を選択します。これにより、 STAT6で収集されたデータが選択されています。
3. VIC/HEX/Yellow555(533-580)のカラー補正を選択します。計算をクリックします。ファム (465-510) と Cy5/Cy5.5(618-660) のため、この手順を繰り返します。ファイルを保存をクリックします。
フィット点法を用いた解析、解析タブで Abs クオンツ/フィット点を選択します。
1. 作成新しい解析] ウィンドウで、[解析タイプを選択: Abs クオンツ/フィット点法サブセット:すべてのサンプルプログラム:増幅名前: RxF DFO ( xは反応数)。
2. 適切なフィルターとSTAT6と各KIR遺伝子 (ファム/cy5 の組合せ) のカラー補正を選択します。[ Noiseband ] タブでバックグラウンドノイズを除外するノイズ・バンドを設定します。
3. [分析] タブで、フィット点を3に設定し、ショーのフィット点を選択します。計算をクリックします。ファイルを保存をクリックします。

6. 結果のエクスポート

QPCR ソフトウェアでナビゲーターを開きます結果バッチ書き出し」タブを選択します。
実験ファイルが保存、ウィンドウの右側にあるセクションに、ファイルを転送するフォルダーを開きます。[次へ] をクリックします。名前とエクスポートファイルの場所を選択します。
Abs Quant/Second 誘導体 Max メソッドまたはAbs クオンツ/フィット点の解析タイプを選択します。[次へ] をクリックします。ファイル、エクスポートフォルダー、および解析のタイプの名前が正しいことと、次のエクスポートプロセスを開始するをクリックを確認します。
エクスポートのステータス]が[ok]になるまで待ちます。画面は、次のステップに自動的に移動します。選択したすべてのファイルが正常にエクスポートされましたを確認して失敗したファイルの数 = 0。完了をクリックします。
各プレートの個々の反作用にエクスポートされた板を分割するのにスクリプト split_file.pl と roche2sds.pl を使用します。
注スクリプトが要求/GitHub 上で提供されます。

7. コピー数の計算

コピー数解析ソフトウェア (例えば、CopyCaller) を開きます。リアルタイム PCR の結果ファイルのインポートを選択し、 roche2sds.plで作成したテキストファイルをロードします。
分析を選択し、いずれか選択する知られているコピー数と校正サンプルまたは最も頻繁にコピーの番号を選択して、分析を実施します。通常ヨーロッパ起源の集団で観察されたKIR遺伝子の最も頻繁なコピー数の表 5を参照してください。

8. データの品質をチェックします。

R スクリプトKIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 を使用します。Rすべての板からコピー数データをスプレッドシートに結合します。
注スクリプトが要求/GitHub 上で提供されます。
KIR遺伝子 (表 6) 知られている連鎖不平衡 (LD) に準拠していないサンプルのコピー数解析ソフトウェア上の raw データを再確認します。

結果

コピー数解析は ΔΔCq 法に基づく予測と推定されるコピー数を示しますコピー数解析ソフトウェアにファイルをエクスポートすることによって実施することができます。

コピー数は、コントロール DNA サンプルプレートまたは最も頻繁に遺伝子コピー数 (表 5) を入力することで知られているコピー数に基づいて予測できます。図 1に示しますKIR2DL4 KIR3DS1、参照の遺伝子を対象とする反応のプレートの結果STAT6 。KIR3DS1、活性化遺伝子の最も頻繁なコピー数は 1 つのコピーに対し、 KIR2DL4、 キール軌跡のフレームワーク遺伝子の最も頻繁なコピー数は 2 つのコピーです。図の結果は、qPCR ソフトウェアと qPCR データから生成されたコピー数データで観測された PCR の拡大のプロットを表示します。示すように、アッセイは 0、1、2、3、および 4 のKIR遺伝子のコピー数を区別することができます。コピー数解析ソフトウェアが円グラフまたは棒グラフとして板全体コピー数の分布を表示できます。コピー数予測の有効性が低い高コピー数とサンプルです。

反応、gDNA、バッファー、プライマーおよびプローブで使用されるすべての材料の品質は、得られる結果の精度に影響を与えます。ただし、結果の不一致はプレート間で DNA の濃度の変動に起因する可能性が高いです。260/280 と 260 を使用して測定することができます抽出された gDNA の純度/230 比が品質に及ぼす影響を持つことができます。2 2.2 1.8 2、260/230 比の 260/280 の比率が望ましいです。プレート間で不均一な範囲の DNA 濃度高い可変性しきい値サイクル (C_t) サンプルと推定されるコピー数の範囲における不一致の可能性があります。図 2の結果は、効果を示すプレート間で C_t値間の格差はコピー数の予測の精度を持つことができます。赤い線はサンプル推定コピー数の範囲を示し、理想的には、可能な限り整数に近いする必要があります。

数値データをコピーするには、一度、分析は、96 ウェルフォーマットでスプレッドシートファイルとしてエクスポートできます。R スクリプト (要リクエスト) を使って 1 つのワークシートにセットとして実行されるすべての 10 皿のコピー番号データを結合です。ほとんどヨーロッパ起源集団からKIRsについて公開されたデータキール複雑な¹に様々な遺伝子との間に存在する LD ルールの予測ができます。これらの予測を使用して、コピー数結果 (表 6) に下流のチェックを実施します。異常な多態性や haplotypic の構造変化、遺伝子間予測の LD に準拠していないサンプルが含まれます。プロトコルを記述するフローチャートを図 3に示します。

キールのハプロタイプの識別子 (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) と呼ばれるツールは、データセットからハプロタイプの補完を容易にするために開発されました。帰属は、ヨーロッパ起源の人口¹に見られた参照ハプロタイプのリストに基づいて動作します。ただし、代わりに使用する、ツールは参照ハプロタイプのカスタムセットにもできます。3 つのファイルが生成されます。最初のファイルは、サンプルのすべてのハプロタイプの組み合わせを一覧表示、2 番目のファイルを提供しています最高の結合された周波数を持つハプロタイプの組み合わせのトリム一覧、3 番目のファイルはハプロタイプを割り当てることができないサンプルを示します。ハプロタイプの非割り当ては新規ハプロタイプのインジケーターとして使用できます。

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図 1: 反応プレートの代表の結果数 5 。(A) このパネルショー増幅プロット。(B) このパネルを示していますコピー数をプロットします。(C) このパネルは、コピー数の分布を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2659
図 2: 反応変数 DNA 濃度を有する平板の代表の結果数 5 。(A) このパネルショー増幅プロット。(B) このパネルを示していますコピー数をプロットします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-3064
図 3: qKAT プロトコルのフローチャート。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

アッセイ	遺伝子	前方のプライマー	濃度 (nM)	逆のプライマー	濃度 (nM)	プローブ	濃度 (nM)
いいえ 1	*3DP1*	A4F	250	A5R	250	P4a	150
	*2 DL 2*	2DL2F4	400	C3R2	600	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
なし 2	*2DS2*	A4F	400	A6R	400	P4a	200
	*2 DL 3*	D1F	400	D1R	400	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
いいえ 3	*3 DL 3*	A8F	500	A8R	500	P4a	150
	*2DS4Del*	2DS4Del	250	2DS4R2	250	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
いいえ 4	*3DL1e4*	B1F	250	B1R	125	P4b	150
	*3DL1e9*	D4F	250	D4R2	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
いいえ 5	*3DS1*	地下 2 階	250	B1R	250	P4b	150
	*2 DL 4*	C1F	200	C1R	200	P5b-2 DL 4	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
いいえ 6	*2 DL 1*	B3F	500	B3R	125	P4b	150
	*2DP1*	D3F	250	D3R	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
いいえ 7	*2DS1*	B4F	500	B4R	250	P4b	150
	*2 DL 5*	D2F	500	D2R	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
いいえ 8	*2DS3*	B5F	250	B5R	250	P4b	150
	*3DL2e9*	D4F	250	D5R	125	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
いいえ 9	*3DL2e4*	A1F	200	A1R	200	P4a	150
	*2DS4FL*	2DS4FL	250	2DS4R2	500	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
いいえ 10	*2DS5*	B6F2	200	B6R3	200	P4b	150
	*2DS4*	C5F	250	C5R	250	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150

表 1: 組み合わせとプライマーおよびプローブの各 qKAT の反作用で使用される濃度²⁷.

反応					プライマー因数 (μ L)				プローブ因数 (μ L)
R1	3DP1	A4F	A5R	2DL2F4	C3R2	水	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2 DL 2	100	100	160	240	200	80	80	60	60	60
R2	2DS2	A2F	A6R	D1F	D1R	水	STAT6F	STAT6R	P4A	P9	PSTAT6
	2 DL 3	160	160	160	160	160	80	80	80	60	60
									注: 必要が少ない、マスターミックスで水 20 μ L
R3	3 DL 3	A8F A8FB	A8R	2DS4DELF	2DS4R2	水	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4DEL	100 100	200	100	100	200	80	80	60	60	60
R4	3DL1E4	B1F	B1R	D4F	D4R2	水	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL1E9	100	50	100	200	350	80	80	60	60	60
R5	3DS1	地下 2 階	B1R	C1F	C1R	水	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B-2 L 4	PSTAT6
	2 DL 4	100	100	80	80	440	80	80	60	60	60
R6	2 DL 1	B3F	B3R	D3F	D3R	水	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DP1	200	50	100	200	250	80	80	60	60	60
R7	2DS1	B4F	B4R	D2F	D2R	水	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2 DL 5	200	100	200	200	100	80	80	60	60	60
R8	2DS3	B5F	B5R	D4F	D5R	水	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL2E9	100	100	100	50	450	80	80	60	60	60
R9	3DL2E4	A1F	A1R	2DS4WTF	2DS4R2	水	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4WT	80	80	100	200	340	80	80	60	60	60
R10	2DS5	B6F2	B6R3	C5F	C5R	水	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B	PSTAT6
	2DS4TOTAL	80	80	100	100	440	80	80	60	60	60

表 2: ボリューム (μ L) 100 μ M プライマー・プローブ溶液のプライマーし、プローブの組み合わせ因数。

名	方向	5´ 変更	3´ 変更	シーケンス (5' →3')	長さ	Tm	GC %	エクソン	位置
P4a	感覚	ファム	BHQ 1	TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA	27	60	44.4	4	425 451
P4b	アンチセンス	ファム	BHQ 1	AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T	28	62	50	4	576-603
P5b	感覚	ATTO647N	BHQ 2	AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG	25	60	52	5	828-852
P5b-2 DL 4	感覚	ATTO647N	BHQ 2	AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG	25	61	56	5	828-852
P9	感覚	ATTO647N	BHQ 2	CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC	24	60	62.5	9	1246-1269
PSTAT6		ATTO550	BHQ 2	CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT	26	62	50

テーブル 3: qKAT で使用されているプローブのリスト ¹^, ²⁷. ATTO 色素にオリゴプローブ P5b、P5b-2 DL 4、P9、および PSTAT6 の 5' 端に使用される蛍光染料が変更されました。

遺伝子	プライマー	方向	シーケンス (5´-3´)	長さ	Tm	GC %	エクソン	位置	私アンプリコン (bp)	対立遺伝子が失われる可能性が
3DL2e4	A1F	フォワード	GCCCCTGCTGAA ATCAGG	18	52	61.1	4	399-416	179	3 DL 2 * 008 * 021 * 027、* 038。
	A1R	逆	CTGCAAGGACAG GCATCAA	19	53	52.6		559-577		3 DL 2 * 048
3DP1	A4F	フォワード	GTCCCCTGGTGA AATCAGA	19	49	52.6	4	398 416	112	どれも
	A5R	逆	GTGAGGCGCAAA GTGTCA	18	52	55.6		492-509		どれも
2DS2	A2F	フォワード	GTCGCCTGGTGA AATCAGA	19	49	52.6	4	398 416	111	どれも
	A6R	逆	TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT	21	51	42.9		488-508		どれも
3 DL 3	A8Fa	フォワード	GTGAAATCGGGA GAGACG	18	50	55.6	4	406-423	139	どれも
	A8Fb	フォワード	GGTGAAATCAGG AGAGACG	19	50	52.6		405 423		3 DL 3 * 054 3 DL 3 * 00905。
	A8R	逆	AGTTGACCTGGG AACCCG	18	51	61.1		526-543		どれも
3DL1e4	B1F	フォワード	CATCGGTCCCAT GATGCT	18	51	55.6	4	549-566	85	3 DL 3 DL 1 * 006 3 DL 1 * 054 3 DL 3 DL 1 * 089 1 * 086 1 * 00505
	B1R	逆	GGGAGCTGACAA CTGATAGG	20	52	55		614-633		3 DL 1 * 00502
3DS1	地下 2 階	フォワード	CATCGGTTCCAT GATGCG	18	51	55.6	4	549-566	85	3DS1 * 047;3 DL 1 * 054 を拾うことがあります。
	B1R	逆	GGGAGCTGACAA CTGATAGG	20	52	55		614-633		どれも
2 DL 1	B3F	フォワード	TTCTCCATCAGT CGCATGAC	20	52	50	4	544-563	96	2 DL 2 DL 1 * 028 1 * 020
	B3R	逆	GTCACTGGGAGC TGACAC	18	50	61.1		622-639		2 DL 2 DL 1 * 030 2 DL 1 * 029 1 * 023
2DS1	B4F	フォワード	TCTCCATCAGTC GCATGAA	19	51	47.4	4	545-563	96	2DS1 * 001
	B4R	逆	GGTCACTGGGAG CTGAC	17	49	64.7		624-640		どれも
2DS3	B5F	フォワード	CTCCATCGGTCG CATGAG	18	53	61.1	4	546 563	96	どれも
	B5R	逆	GGGTCACTGGGA GCTGAA	18	51	61.1		624-641		どれも
2DS5	B6F2	フォワード	AGAGAGGGGACG TTTAACC	19	50	52.6	4	475-493	173	どれも
	B6R3	逆	TCCAGAGGGTCA CTGGGC	18	53	66.7		630-647		2DS5 * 003
2 DL 4	C1F	フォワード	GCAGTGCCCAGC ATCAAT	18	52	55.6	5	808 825	83	どれも
	C1R	逆	CCGAAGCATCTG TAGGTCT	19	52	52.6		872-890		2 DL 2 DL 4 * 019 4 * 018
2 DL 2	2DL2F4	フォワード	GAGGTGGAGGCC CATGAAT	19	52	57.9	5	778-796	151	2 DL 2 * 009;782 G を A に変更
	C3R2	逆	TCGAGTTTGACC ACTCGTAT	20	51	45		909-928		どれも
2DS4	C5F	フォワード	TCCCTGCAGTGC GCAGC	17	57	70.6	5	803-819	120	どれも
	C5R	逆	TTGACCACTCGT AGGGAGC	19	52	57.9		904-922		2DS4 * 013
2DS4Del	2DS4Del	フォワード	CCTTGTCCTGCA GCTCCAT	19	54	57.9	5	750-768	203	どれも
	2DS4R2	逆	TGACGGAAACAA GCAGTGGA	20	53	50		933-952		どれも
2DS4FL	2DS4FL	フォワード	CCGGAGCTCCTA TGACATG	19	53	57.9	5	744-762	209	どれも
	2DS4R2	逆	TGACGGAAACAA GCAGTGGA	20	53	50		933-952		どれも
2 DL 3	D1F	フォワード	AGACCCTCAGGA GGTGA	17	48	58.8	9	1180-1196	156	どれも
	D1R	逆	CAGGAGACAACT TTGGATCA	20	50	45		1316-1335		3 * 01802 2 DL 2 DL 3 * 01801、2 DL 3 * 017 2 DL 3 * 010
2 DL 5	D2F	フォワード	CACTGCGTTTTC ACACAGAC	20	52	50	9	1214-1233	120	2DL5B * 011 と 2DL5B * 020
	D2R	逆	GGCAGGAGACAA TGATCTT	19	49	47.4		1315-1333		どれも
2DP1	D3F	フォワード	CCTCAGGAGGTG ACATACGT	20	53	55	9	1184-1203	121	どれも
	D3R	逆	TTGGAAGTTCCG TGTACACT	20	50	45		1285-1304		どれも
3DL1e9	D4F	フォワード	CACAGTTGGATC ACTGCGT	19	52	52.6	9	1203-1221	93	3 DL 3 DL 1 * 068 1 * 061
	D4R2	逆	CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA	23	53	43.5		1273 1295		3 DL 3 DL 1 * 05902 3 DL 1 * 060 3 DL 3 DL 1 * 065, 3 DL 1 * 094N 3 DL 1 * 098 3 DL 1 * 064 1 * 061 1 * 05901
3DL2e9	D4F	フォワード	CACAGTTGGATC ACTGCGT	19	52	52.6	9	1203-1221	156	どれも
	D5R	逆	GACCTGACTGTG GTGCTCG	19	54	63.2		1340-1358		どれも
STAT6	STAT6F	フォワード	CCAGATGCCTAC CATGGTGC	20	54	60			129
	STAT6R	逆	CCATCTGCACAG ACCACTCC	20	54	60

表 4: qKAT で使用されるプライマーのシーケンス ¹^, ²⁷ 。

**キール遺伝子**		3 DL 3	2DS2	2 DL 2	2 DL 3	2DP1	2 DL 1	3DP1	2 DL 4	3 DL 1 EX9	3 DL 1 EX9	3DS1	2 DL 5	2DS3	2DS5	2DS1	2DS4 合計	2DS4 フロリダ	2DS4 デル	3 DL 2 ex4	3 DL 2 EX9
最も頻繁なコピー数		2	1	1	2	2	2	2	2	2	2	1	1	1	1	1	2	1	1	2	2

表 5:ための最も頻繁なコピー数キールヨーロッパ起源のサンプルで一般的に観察される遺伝子。

	不均衡のリンケージの規則 qKAT のヨーロッパの人口に基づく	コピーの番号の確認
1	KIR3DL3、KIR3DP1、KIR2DL4 、 KIR3DL2は、フレームワーク遺伝子両方のハプロタイプの存在です。	KIR3DL3、KIR3DP1、KIR2DL4 、 KIR3DL2 = 2
2	お互いに LD、 KIR2DS2 、 KIR2DL2	2DS2=2 DL 2
3	KIR2DL2とKIR2DL3が同じ遺伝子の対立遺伝子です。	2 DL 2+2 DL 3= 2
4	お互いに LD、 KIR2DP1とKIR2DL1	2DP1=2 DL 1
5	KIR3DL1とKIR3DL2の exon 4 それぞれエクソン 9 KIR3DL1とKIR3DL2のと同じです。	3DL1ex4=3DL1ex9 、 3DL2ex4=3DL2ex9
6	対立遺伝子は、 KIR3DS1 KIR3DL1	3 DL 1+3DS1= 2
7	KIR2DS3とKIR2DS5は、 KIR2DL5と LD	2DS3+2DS5=2 DL 5
8	KIR3DS1とKIR2DS1は、LD	3DS1=2DS1
9	KIR2DS1とKIR2DS4Tの計の存在は相互に排他的なハプロタイプ	2DS1+2DS4TOTAL= 2
10	KIR2DS4FLとKIR2DS4delは、 KIR2DS4TOTALの亜種	2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

表 6: 間の連鎖不平衡キール一般的にヨーロッパ起源の人口で観察される遺伝子コピー数データを確認する使用できます。 ¹^,²⁷ 。

ディスカッション

KIR遺伝子.のコピー数の入力を容易にする qKAT と呼ばれる新規半自動化されたハイスループット法について述べるメソッドは、低スループットおよびこれらの非常に多型の遺伝子の有無を示すことができますのみ SSP PCR のような従来の方法と比べて改善。

得られた数値データをコピーの精度が品質と gDNA サンプルおよび試薬の品質の均一性の濃度を含む複数の要因に依存しています。品質とプレート間で gDNA サンプルの精度は、プレート間の濃度の変化は、コピー数の計算でエラーが発生するので非常に重要です。以来、法は、ヨーロッパ起源のサンプルセットを使用して検証された、世界の他の部分からのコホートからデータはより徹底的にチェックを必要です。これは、対立遺伝子ドロップアウトまたは非特異的プライマー・プローブバインディングのインスタンスが誤ってコピー数変異として解釈されないことを確保するためです。

法は、設計され、高スループットとして実行するために最適化された、間は、以下のサンプルを実行する変更できます。少ないサンプルを分析する際、コピー数解析ソフトウェアで信頼の指標が影響を受けるが、プレートに知られているKIR遺伝子コピー数と制御ゲノム DNA のサンプルが含まれ、その他のサンプルの複製がある場合、これは向上させることが含まれています。

液体/プレート-ハンドリングロボットなし所マルチチャンネルピペットの使用のマスターの組合せを分配することができます、プレートは qPCR 測定器に手動で読み込むことができます。

QKAT の開発の後ろの主な目的は、メソッドを作成する単純な高スループット、高解像度、およびコスト効率の高い遺伝子KIRs病協会研究。QKAT は、感染症、自己免疫疾患、妊娠障害⁴^,の範囲を含むいくつかの大きい疾患関連研究におけるキールの役割の調査に採用されているので、これは正常に達成されました。²⁴^,²⁵^,²⁶。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

医療研究評議会 (MRC)、欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム (グラント契約号 695551) の下で欧州研究会議 (ERC)、国立衛生研究所 (NIH) ケンブリッジからの資金援助を受けたプロジェクト生物医学の研究センターと NIH 研究血液・移植研究ユニット (NIHR BTRU) 臓器提供とケンブリッジ大学の移植および NHS の血および移植 (NHSBT) とのパートナーシップ。見解では、これらの者とは必ずしもこれらの NHS、NIHR、保健省や、NHSBT。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Oligonucleotides	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit	Bioline	BIO-86020	−
MilliQ water	−	−	−
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor	Eppendorf(or equivalent)	Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
OR
QuBit Fluorometer	Life Technologies	Q33216
Matrix Hydra	Thermo Scientific	109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well	Roche	05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour)	Caliper Life Sciences	204135
Vortex mixer	Biosan	BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL)	Gilson(or equivalent)	F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL)	Starlab (or equivalent)	S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL	STARLAB	E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube	STARLAB	E1450-0200
96-well deep well plate	Fisher Scientific	12194162
LC480 384 Multi-well plates	Roche	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04729757001
Name	Company	Catalog Number	Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1			https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier			http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

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