בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים

Summary

כאן אנו מציגים עבור בידוד תאי גזע זולה שיניים האנושי והתפשטות פרוטוקול על מנת להעריך את הביטוי חלבון פריאון בתהליך בידול עצביים.

Abstract

Bioethical נושאים הקשורים המניפולציה של תאי גזע עובריים יש הפריע ההתקדמות בתחום המחקר הרפואי. מסיבה זו, חשוב מאוד לקבל בתאי גזע בוגרים רקמות שונות כמו שומן, חבל הטבור, מח עצם ודם. בין מקורות אפשריים, עיסת שיניים הוא מעניין במיוחד כי זה קל להשיג בגין שיקולים bioethical. אכן, שיניים זולה תאי גזע אנושי (hDPSCs) הם סוג של תאי גזע בוגרים מסוגלים להבדיל תאים עצביים כמו, ניתן להשיג את השן הטוחנת השלישית של מטופלים בריאים (גילאי 13-19). בפרט, הציפה שיניים היה להסיר עם החופר, וחותכים לפרוסות, שטופלו collagenase הרביעי ותרבותית בבקבוקון. כדי לעודד את הבידול עצביים, hDPSCs היו מגורה עם EGF/bFGF 2 שבועות. בעבר, הראו כי במהלך תהליך התמיינות התוכן של פריון הסלולר חלבון (PrP^C) hDPSCs מוגבר. הניתוח cytofluorimetric הראה ביטוי מוקדם PrP^C זה גדל לאחר תהליך התמיינות עצביים. אבלציה של PrP^C על ידי siRNA PrP מנעו בידול עצביים שנגזרות EGF/bFGF. בנייר זה, אנו ממחישים כי כפי שאנחנו משופרת של בידוד, ההפרדה ושיטות במבחנה הטיפוח של hDPSCs עם מספר הליכים קל, יעיל יותר תא שיבוטים היו הרחבת שהושג, בקנה מידה גדול גזע mesenchymal (MSCs) נצפתה. אנו גם מראים hDPSCs, שהושג עם שיטות מפורטות בפרוטוקול, מה שלומך. מדגם ניסיוני מצוינת ללמוד את תהליך התמיינות עצביים של MSCs ותהליכים תאית ומולקולרית עוקבות.

Introduction

גזע mesenchymal היה מבודד מספר רקמות, כולל מח עצם, דם טבורי, אנושית זולה שיניים, רקמת שומן, דם^{1,2,3,4,5 , 6}. כפי שדווח על ידי מספר סופרים, hDPSCs להראות הדבקות מפלסטיק, מורפולוגיה פיברובלסט דמוי טיפוסי. אלה מייצגים אוכלוסיה הטרוגנית מאוד עם שיבוטים נפרדות וההבדלים המקדימות, המבדילים קיבולת^7,8. hDPSCs אקספרס סמנים ספציפי עבור גזע mesenchymal (קרי CD44, CD90, CD73, CD105, כלי קשת-1), הם שליליים עבור כמה סמנים hematopoietic (כגון CD14 ו- CD19), מסוגלים במבחנה בידול multilineage^{9, 10,11}.

מספר סופרים הראו כי תאים אלה הם מסוגלים להבדיל לתוך נוירון כמו תאים באמצעות פרוטוקולים שונים, כולל התוספת של גורם הגדילה העצבי, bFGF, EGF בשילוב עם ספציפי מדיה ותוספי^7,12. בנוסף, חלבונים רבים מעורבים בתהליך בידול עצביים ולהראות, בקרב אלו, בכמה עיתונים תפקידים רלוונטיים ושניהם ביטוי משמעותי של חלבון פריאון הסלולר (PrP^C), תאי גזע עובריים והוא בוגר^{13, 14}. PrP^C מייצג מולקולה pleiotropic המסוגלים לבצע פונקציות שונות בתוך תאים כמו מטבוליזם נחושת, אפופטוזיס, ואת התנגדות חימצוני מתח^{15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}.

שלנו הקודם נייר²³, חקרנו את התפקיד של PrP^C בתהליך בידול עצביים hDPSCs. למעשה, hDPSCs אקספרס precociously PrP^C וזה, אחרי בידול עצביים, היה ניתן לצפות להגדלה נוספת. מחברים אחרים שיערו תפקיד אפשרי של PrP^C בתהליכים עצביים התמיינות של תאי גזע. אכן, PrP^C מניע את הבידול של תאי גזע עובריים לתוך הנוירונים oligodendrocytes להפוך, האסטרוציטים²⁴. מטרתו של מחקר זה היה כדי להדגיש את המתודולוגיה להשגת בתאי גזע של שיניים זולה, תהליך הבידול שלו ואת התפקיד של PrP^C במהלך התמיינות עצביים.

Protocol

השן הטוחנת השלישית השתמשו במחקר היו טוחנות מחולים (בן 13-19 שנים) ללא היסטוריה קודמת של סמים או צריכת אלכוהול, עישון כל ועם היגיינת הפה המתאים. ביום של הסבר, מחלקת המדע לרפואת שיניים, Maxillofacial של "ספיאנצה"-אוניברסיטת רומא, הסכמה מדעת הושג המטופלים או ההורים. הסכמה מדעת הושג בהתבסס על שיקולים אתיים ואישור של ועדת האתיקה.

1. השן והפקת זולה שיניים

1. הכנת בינונית המתאימה עבור שימור או תחבורה.
   1. הכנת ריכוז נמוך בינוני ששינה הנשר של Dulbecco של גלוקוז (DMEM-L) עם L-גלוטמין (494.5 מ"ל).
   2. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%) 0.5 מיליליטר שהוא גוסס (0.1%).
2. לחלץ את השן הטוחנת השלישית של המטופל, לשטוף אותו עם PBS, הכניסו למבחנה 15 מ"ל עם המדיום ובמהירות להעביר אותו למעבדה פחות מ 2 h.
3. ברדס חומרים מסוכנים, לפתוח את השן בחותך עוברים חיתוך הילתית מקבילים, המשיק דרך הגג לשכת זולה.
4. בעדינות להסיר הציפה עם מחפר קטנה ומניחים אותו במבחנה.
5. לשטוף עם PBS שלוש פעמים, צנטריפוגה ב 2,500 x g 10 דקות ב- RT.

2. עיבוד של עיסת שיניים ושחרור תאי גזע

1. הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בפתרון של האנק ולמקם אותו בצלחת פטרי. תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO₂.
2. הקלד הרביעי collagenase פתרון הכנה.
   1. להכין 0.8 מ של DMEM-ל'
   2. ממיסים 1 מ ג של סוג collagenase הרביעי ב- 0.8 מ של DMEM-L ו מערבולת למשך מספר דקות.
   3. הוספת DMEM-L עד 1 מ"ל יש ריכוז סופי 1 מ"ג/מ"ל.
   4. לסנן את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
3. להסיר את הפתרון של האנק על ידי צנטריפוגה ב x 2,500 g 10 דקות ב RT, לחלק את הציפה לפרוסות שנהנתם 1 מ"מ כל אחד באזמל חד פעמיות.
4. מניחים את פרוסות זולה בצלחת פטרי, דגירה עם 1 מ"ל של הסוג הרביעי collagenase למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO₂.
5. הכנה תרבות בינוני (500 mL).
   1. 445 מ של DMEM-L עם L-גלוטמין.
   2. להוסיף 50 מ של סרום שור עוברית (FBS) (10%).
   3. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%).
6. Centrifuge הדגימה ב x 2,500 g 10 דקות ב RT, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בטווח הבינוני (שלב 2.5) ותרבות T25 הבקבוק ספציפיות עבור תאי גזע-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO₂.

3. תאי גזע התרבות והתפשטות

1. כל יום לבדוק את התרבות ולבחון, לאחר 3 ימים של צמיחה, שיבוטים שונים של תאים חסיד בתוך הבקבוק.
2. כל 3 ימים לשנות המדיום תרבות.
3. בין 7 ל 12 יום, ברגע תאים חסיד שיש להגיע למפגש, לנתק אותם לטיפול תאי עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 ° C או בעדינות באמצעות המגרד של התא.
4. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של המדיום תרבות (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין.
5. Centrifuge התליה תא במשך 6 דקות ב x 259 גרם, להסיר את תגובת שיקוע ולמקם את התאים בבקבוקון T25 להפיץ.
   הערה: כל 3 ימים התאים להגיע למפגש.
6. הפצת התאים עד 21-28 ימים (כ 6-8 קטעים) כדי למנוע הנוכחות של אי-גזע כמו תאים בתרבות.
7. ניתוק התאים עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות 37 ° C או גירוד בעדינות. Centrifuge התליה תא במשך 6 דקות ב x 259 גרם.
8. הוצא את תגובת שיקוע ובדוק את התאים לניתוח cytofluorimetric (שלב 6).

4. Silencing PrP^C ארעי על-ידי siRNA

1. תרבות צלחות 6-טוב hDPSCsin (2 x 10⁵ תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5) במשך 24 שעות ביממה.
2. יום אחרי, להכין siRNA PrP בינוני (400 µL).
   1. כדי מבחנה סטרילית, להוסיף 384 µL DMEM-ל'
   2. להוסיף 1 µL עבור כל סוג של siRNA PrP DMEM-L יש ריכוז הסופי של 5 nM (siRNA 4 PrP היו בשימוש ונבדקו על-ידי הספק כדי להבטיח של % ≥70 יעילות תמונות ציפורים).
   3. להוסיף 12 µL של transfectionreagent DMEM-ל'
   4. מערבולת התערובת דגירה 10 דקות ב RT כדי לאפשר הקמת מתחמי תרביות תאים.
3. להוסיף μL 400 siRNA PrP בינוני כל דגימה, תקופת דגירה של 6-אייץ '-37 מעלות צלזיוס.
4. ללא השמטת siRNA PrP בינונית, להוסיף 1.6 מ ל (יחס של 1 עד 5) של תרבות בינוני (שלב 2.5).
5. להשאיר את התאים עבור 72 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
6. הסר את תגובת שיקוע ולשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT.
7. להוסיף 2 מיליליטר עצביים תרבות בינוני 7 ו/או 14 ימים (שלב 5.1).
8. לשנות את המדיום תרבות עצביים כל 3 ימים.
   הערה: החלף siRNA PrP פתרון כל הזמן להחליף המדיום תרבות עצביים.
9. בסוף הזמן, לשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT ולבדוק עבור עצביים אנטיגנים משטח על ידי ניתוח המערבי כתם.

5. העצבית תהליך אינדוקציה של hDPSCs

1. הכנה עצביים תרבות בינוני (500 mL).
   1. להכין 444.7 מ של מדיה הבזליים שניסח תאים עצביים.
   2. למדיום להוסיף 50 מ של סרום ללא תוספת משמש לתמיכה הכדאיות לטווח ארוך של עובריים והוא בוגר גזע תאים עצביים (10%).
   3. להוסיף 200 µL של בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF) (הריכוז הסופי 40 ng/mL) ו- 100 µL של גורם גדילה עוריות (EGF) המדיום (ריכוז סופי 20 ng/mL).
   4. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%) למדיום.
2. תרבות hDPSCs ב 6-ובכן צלחות (2 x 10⁵ תא/mL) עד 28 ימים מן ההפרדה זולה ולעורר אותם עם 2 מ"ל של מדיום תרבות עצביים.
3. כל 3 ימים למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT ולהחליף 2 מ"ל של המדיום תרבות עצביים.
4. אחרי 7 ו/או 14 ימים, ניתוק התאים עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 ° C או בעדינות עם מגרד.
5. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של תרבות בינוני (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין.
6. מבחן הנוכחות של אנטיגנים משטח עצביים (שלב 6) או לביטוי חלבון פריאון (שלב 7) על ידי ניתוח cytometry זרימה.

6. אפיון של hDPSCs מאת Flow Cytometry

1. בחר mesenchymal סטרומה (MSC)-אנטיגנים משטח ספציפי או עצביים.
2. תרבות של hDPSCs ב 6-ובכן צלחות (2 x 10⁵ תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5).
3. ניתוק hDPSCs ב- 28 ימים עיסת שיניים ההפרדה או לאחר 14 ימים של תרבות עצביים בינוני (שלב 5.1) עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות 37 ° C או בעדינות המגרד.
4. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של תרבות בינוני (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין ולשטוף centrifugate-259 x g עבור 6 דקות ב RT. עוד 2 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT.
5. לתקן את hDPSCs אינו מטופל או מטופלים עם paraformaldehyde 4% ב- PBS 10 דקות ב 4 º C.
6. Permeabilize hDPSCS עם 0.1% (v/v) ללא יונית חומרים פעילי שטח ב- PBS נוספים 10 דקות ב- RT.
7. לבצע חסימת עם 5% שומן חלב יבשים 1 מ"ל של PBS עבור h 1-RT.
8. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS, דגירה התאים עם אנטי-CD105 (בטחונות / 5 x 10⁵ תאים), אנטי-CD44 (בטחונות / 5 x 10⁵ תאים), אנטי-לתזמורת כלי קשת-1 (בטחונות / 5 x 10⁵ תאים), אנטי-CD90 (מטריים / 5 x 10⁵ תאים), אנטי-CD73 (מטריים / 5 10x⁵ תאים), אנטי β3-טובולין (בטחונות / 5 x 10⁵ תאים), אנטי-NFH (בטחונות / 5 x 10⁵ תאים) ו- anti-GAP43 (בטחונות / 5 x 10⁵ תאים) mAb עבור 1 h RT.
9. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS, דגירה עם אנטי-העכבר PE (1:50 / 5 x 10⁵ תאים) או ארנב אנטי CY5 (1:50 / 5 x 10⁵ תאים) mAb לשעה נוספים ב- RT.
10. להשתמש נוגדנים משניים עבור gating התאים immunopositive (אנטי-העכבר PE או ארנב אנטי CY5 mAb) לנתח כל הדגימות עם cytometer זרימה, לרכוש לפחות 20,000 אירועים.

7. הערכת ביטוי PrP^C hDPSCs על ידי ניתוח Cytometry זרימה

1. תרבות צלחות 6-טוב hDPSCsin (2 x 10⁵ תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5).
2. ניתוק hDPSCs ב 21 ו 28 ימים עיסת שיניים ההפרדה, אחרי 7 ו/או 14 ימים בינונית תרבות עצביים (שלב 5.1) עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA ולהפסיק את הפעולה טריפסין כפי שמתואר בשלב 6.4. לתקן את דגימות עם paraformaldehyde 4% ב- PBS 10 דקות ב 4 º C.
3. Permeabilize עם 0.1% (v/v) ללא יונית surfactantin PBS 10 דקות ב RT. להסיר את תגובת שיקוע, מכתים את התאים עם הארנב אנטי-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 10⁵ תאים) mAb עבור h 1 RT. Incubate עם הארנב אנטי CY5 (1:50 / 5 x 10⁵ תאים) mAb עבור h 1 נוספים ב- RT.
4. לנתח כל הדגימות עם cytometer זרימה ולרכוש אירועים לפחות 20,000.

תוצאות

ההליכים בידוד והפרדה של hDPSCs מ שיניים זולה, המתקבל טוחנת שלישית, הם תהליכים מורכבים בהם שינויים קטנים יכולים להוביל תוצאה הרסניות. בנייר זה, אנו משתמשים בפרוטוקול של ארתור et al. ¹² עם מספר שיפורים. ערכה הנציג של נהלים מוצג באיור1.

Discussion

בעבודה זאת, התמקדנו מתודולוגיה בידוד ובידול עצביים של hDPSCs; יתר על כן, הערכנו את התפקיד של PrP^C בתהליך זה. ישנן מספר שיטות כדי לבודד, להבדיל hDPSCs תאים דמויי נוירון, שלבים קריטיים בתהליך. hDPSCs מסוגלים להבדיל ב מספר שושלות כגון chondroblasts, adipocytes, תאי העצם נוירונים. בעיתון שלנו, חקרנו את המנגנונים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942	It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulin	Cell Signaling Technology	#4466	One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105	BD Biosciences	611314	Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44	Millipore	CBL154-20ul	Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73	Cell Signaling Technology	13160	CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90	Millipore	CBL415-20ul	Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43	Cell Signaling Technology	#8945	Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE	Abcam	ab7003	Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH	Cell Signaling Technology	#2836	Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y	Abcam	ab52604	Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5	Abcam	ab6564	Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1	Millipore	MAB4315-20ul	Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTS	Gibco by life technologies	A14867-01	B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer	BD Biosciences	AC6531180187	Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software	BD Biosciences		Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGF	PeproThec, DBA	100-18B	basic Fibroblast Growth Factor
Centrifuge CL30R	Termo fisher Scientific	11210908	it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541	Termo fisher Scientific	317527-185	it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV	Life Technologies	17104019	Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel	Swann-Morton	501	It is use to cut tissues
DMEM-L	Euroclone	ECM0060L	Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGF	PeproThec, DBA	AF-100-15	Epidermal Growth Factor
Fetal Bovine Serum	Gibco by life technologies	10270-106	FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter	Sarstedt	831,823,101	it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNP	Qiagen	GS5621	4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1x	Gibco by life technologies	240200083	The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent	Qiagen	301705	HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A	Gibco by life technologies	10888022	Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin	Euroclone	ECB3001D	It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS)	Euroclone	ECB4004LX10	PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,F	Sarstedt	833,920,300	It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap	Sarstedt	833,910,302	Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA	Euroclone	ECB3052D	Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
Tube	Sarstedt	62,554,502	Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 Compact	Steril	ST-003009000	Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope	Zeiss	3849000962	ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.