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  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour humain isolement des cellules souches pulpe dentaire et propagation afin d’évaluer l’expression de la protéine prion au cours du processus de différenciation neuronale.

Résumé

Les enjeux éthiques associés à la manipulation des cellules souches embryonnaires ont entravé les progrès dans le domaine de la recherche médicale. Pour cette raison, il est très important d’obtenir des cellules souches adultes de différents tissus tels que les tissus adipeux, cordon ombilical, la moelle osseuse et le sang. Parmi les sources possibles, la pulpe dentaire est particulièrement intéressant parce qu’il est facile d’obtenir en ce qui concerne les considérations bioéthiques. En effet, Dental Pulp des cellules souches humaines (hDPSCs) sont un type de cellules souches adultes capables de se différencier en cellules neuronales semblables et peuvent provenir de la troisième molaire des patients en bonne santé (âgés de 13 à 19). En particulier, la pulpe dentaire a été enlevée avec une excavatrice, coupée en petites tranches, traitée par collagénase IV et cultivée dans un ballon jaugé. Pour induire la différenciation neuronale, hDPSCs ont été stimulées avec EGF/bFGF pendant 2 semaines. Auparavant, nous avons démontré qu’au cours du processus de différenciation de prion cellulaire protéine (PrPC) en hDPSCs augmenté. L’analyse cytofluorométrique ont montré une expression précoce de la PrPC qui a augmenté après le processus de différenciation neuronale. Ablation de la PrPC de siARN PrP a empêché la différenciation neuronale induite par l’EGF/bFGF. Dans cet article, Nous illustrons que que nous avons amélioré l’isolement, de séparation et de méthodes de culture in vitro de hDPSCs avec plusieurs opérations simples, les clones de cellules plus efficaces étaient expansion obtenue et à grande échelle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) a été observée. Nous montrons aussi comment les hDPSCs, obtenues avec les méthodes décrites dans le protocole, sont un excellent modèle expérimental pour étudier le processus de différenciation neuronale de MSCs et procédés cellulaires et moléculaires.

Introduction

Cellules souches mésenchymateuses ont été isolées de divers tissus, y compris la moelle osseuse, sang de cordon ombilical, pulpe dentaire humain, le tissu adipeux et sang1,2,3,4,5 , 6. comme indiqué par plusieurs auteurs, hDPSCs montrent une adhésion en plastique, une morphologie typique des fibroblastes. Il s’agit d’une population très hétérogène avec des clones distincts et les différences dans la capacité de prolifération et de différenciation7,8. hDPSCs expriment des marqueurs spécifiques des cellules souches mésenchymateuses (CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), ils sont négatifs pour certains marqueurs hématopoïétiques (comme CD14 et CD19) et sont capables de différenciation multilignée in vitro9, 10,11.

Plusieurs auteurs ont montré que ces cellules sont capables de se différencier en cellules de neurone comme utilisant des protocoles différents, qui comprennent l’ajout de NGF, bFGF, EGF en combinaison avec le spécifique médias et suppléments7,12. En outre, beaucoup de protéines est impliquées au cours du processus de différenciation neuronale et, parmi ceux-ci, plusieurs journaux montre un rôle pertinent et une expression significative de la protéine prion cellulaire (PrPC), aussi bien dans les cellules souches embryonnaires et adultes13, 14. PrPC représente une molécule pléiotrope capable de remplir des fonctions différentes à l’intérieur de cellules dans le métabolisme du cuivre, l’apoptose, et résistance à l’oxydation stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

Dans notre précédente du livre23, nous avons examiné le rôle de la PrPC dans le processus de différenciation neuronale hDPSCs. En fait, hDPSCs exprimer précocement PrPC et, après la différenciation neuronale, il était possible d’observer une augmentation supplémentaire. D’autres auteurs l’hypothèse d’un rôle possible de la PrPC dans les processus de différenciation neuronale de cellules souches. En effet, PrPC entraîne la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines dans les neurones, les astrocytes et oligodendrocytes24. Le but de cette étude était de mettre l’accent sur la méthodologie pour l’obtention de cellules souches de la pulpe dentaire, ses processus de différenciation et le rôle de la PrPC au cours de la différenciation neuronale.

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Protocole

Troisièmes molaires utilisés dans l’étude ont été excisés de patients (13-19 ans) avec aucun antécédent de consommation d’alcool ou de drogue, toutes non-fumeurs et avec une bonne hygiène buccale. Le jour de l’explication, au département de Science dentaire et maxillo-faciale de l’Université « La Sapienza » de Rome, le consentement éclairé a été obtenu depuis les patients ou les parents. Le consentement éclairé a été obtenu basée sur des considérations éthiques et à l’approbation du comité d’éthique.

1. dents et Extraction de la pulpe dentaire

  1. Préparation du support approprié pour la conservation ou le transport.
    1. Préparer moyen faible concentration de l’aigle de la modification de Dulbecco de glucose (DMEM-L) en L-glutamine (494,5 mL).
    2. Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %) et 0,5 mL d’amphotéricine (0,1 %).
  2. Extrait le patient de la troisième molaire, rapidement, rincez-le avec du PBS, mis dans un tube de 15 mL avec le milieu et transférez-le au laboratoire en moins de 2 h.
  3. Sous une hotte de biohazard, ouvrir la dent avec un cutter en passe d’usinage coronale parallèle et tangent à travers le toit de la chambre pulpaire.
  4. Doucement, retirer la pulpe avec une petite pelle et placez-le dans un tube à essai.
  5. Laver trois fois, avec du PBS et centrifuger à 2 500 g pendant 10 min à température ambiante.

2. le traitement de la pulpe dentaire et la libération de cellules souches

  1. Retirez le surnageant, resuspendre le culot dans une solution de Hank et placez-le dans une boîte de pétri. Incuber pendant 2 h à 37 ° C à 5 % de CO2.
  2. Préparation de solutions IV collagénase de type.
    1. Préparation de 0,8 mL de DMEM-L.
    2. Faire fondre 1 mg de collagénase IV type de 0,8 mL de DMEM-L et vortexer pendant plusieurs minutes.
    3. Ajouter DMEM-L à 1 mL d’avoir une concentration finale de 1 mg/mL.
    4. Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 µM.
  3. Enlever la solution de Hank par centrifugation à 2 500 g pendant 10 min à la droite et diviser la pâte en petites tranches approximativement 1 mm chacun avec un scalpel jetable.
  4. Déposer les tranches de pâte dans un plat de Pétri et incuber 1 ml de collagénase de type IV pendant 15 min à 37 ° C à 5 % de CO2.
  5. Préparation de culture moyenne (500 mL).
    1. À 445 mL de DMEM-L en L-glutamine.
    2. Ajouter 50 mL de sérum fœtal (SVF) (10 %).
    3. Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %).
  6. Centrifuger l’échantillon à 2 500 g pendant 10 min à ta, retirez le surnageant, resuspendre le culot dans le milieu (étape 2.5) et la culture dans ballon T25 spécifique des cellules souches à 37 ° C à 5 % de CO2.

3. propagation et Culture cellules souches

  1. Chaque jour vérifier la culture et, après 3 jours de croissance, observer différents clones de cellules adhérentes dans la fiole.
  2. Tous les 3 jours changer le milieu de culture.
  3. Entre 7 et 12 jours, une fois que les cellules adhérentes ont portée confluence, détacher en traitant les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou doucement en utilisant un grattoir de cellules.
  4. Ajouter 4 ml (ratio 1:5) bouillon de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 6 min à 259 x g, éliminer le surnageant et placer les cellules dans une fiole de T25 pour se propager.
    Remarque : Tous les 3 jours les cellules atteignent la confluence.
  6. Propager les cellules jusqu'à 21 ou 28 jours (environ 6 à 8 passages) afin d’éviter la présence de souches non-comme des cellules dans la culture.
  7. Détacher les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou en grattant doucement. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 6 min à 259 x g.
  8. Retirez le surnageant et tester les cellules pour analyse cytofluorométrique (étape 6).

4. transitoire PrPC arreter de siARN

  1. Culture les plaques 6 puits de hDPSCsin (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5) pendant 24 h.
  2. Le lendemain, préparer des siARN PrP milieu (400 µL).
    1. Dans un tube à essais stérile, ajouter µL 384 DMEM-L.
    2. Ajouter 1 µL pour chaque type de siARN PrP à DMEM-L afin d’obtenir une concentration finale de 5 nM (4 siARN PrP ont été utilisés et vérifiés par le fournisseur pour garantir une efficacité défiant ≥70 %).
    3. Ajouter 12 µL de transfectionreagent à DMEM-L.
    4. Le mélange de vortex et incuber pendant 10 min à RT pour permettre la formation de complexes de transfection.
  3. Ajouter 400 μL de siARN PrP moyen dans chaque échantillon et incuber pendant 6 h à 37 ° C.
  4. Sans jeter le siARN PrP moyen, ajouter 1,6 mL (ratio de 1 à 5) du milieu de culture (étape 2.5).
  5. Laissez les cellules pendant 72 h à 37 ° C.
  6. Éliminer le surnageant et laver 3 fois avec 2 mL de PBS à température ambiante.
  7. Ajouter 2 mL de milieu de culture neuronale pendant 7 ou 14 jours (étape 5.1).
  8. Changer le milieu de culture neuronal tous les 3 jours.
    Remarque : Remplacer le siARN PrP solution chaque remplacement de temps le milieu de culture neuronal.
  9. À la fin de l’époque, laver 3 fois avec 2 mL de PBS à ta et tester des antigènes de surface neuronales à l’analyse Western Blot.

5. neuronale processus d’Induction de hDPSCs

  1. Préparation du milieu de culture neuronale (500 mL).
    1. Préparer 444,7 mL de milieu de base formulés aux cellules neuronales.
    2. Au milieu, ajouter 50 mL de supplément sans sérum utilisé pour soutenir la viabilité à long terme des adultes et embryonnaires cellules souches neuronales (10 %).
    3. Ajouter 200 µL de basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (concentration finale de 40 ng/mL) et 100 µL de facteur de croissance épidermique (EGF) au milieu (concentration finale 20 ng/mL).
    4. Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %) dans le milieu.
  2. La culture hDPSCs à plaques 6 puits (2 x 105 cellules/mL) jusqu'à 28 jours de la séparation de la pulpe et de les stimuler avec 2 mL de milieu de culture neuronale.
  3. Tous les 3 jours jeter le surnageant, laver 3 fois avec 2 mL de PBS à RT et remplacer 2 mL de milieu de culture neuronal.
  4. Après 7 ou 14 jours, détacher les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou délicatement avec une spatule.
  5. Ajouter 4 mL (ratio 1:5) du milieu de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine.
  6. Tester la présence d’antigènes de surface neuronales (étape 6) ou l’expression de la protéine prion (étape 7) par analyse en cytométrie en flux.

6. caractérisation des hDPSCs par cytométrie en flux

  1. Sélectionnez stromal mésenchymateuse (CSM)-les antigènes de surface spécifiques ou neuronales.
  2. Culture de la hDPSCs en plaques 6 puits (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5).
  3. Détacher les hDPSCs à 28 jours de séparation de la pulpe dentaire ou après 14 jours de milieu de culture neuronale (étape 5.1) avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou doucement un grattoir.
  4. ajouter 4 ml (ratio 1:5) du milieu de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine et centrifuger à 259 x g pendant 6 min à température ambiante. laver l’autre 2 fois avec 2 mL de PBS à température ambiante.
  5. Difficulté la hDPSCs ou traités avec du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant 10 min à 4 ° C.
  6. Permeabilize hDPSCS avec surfactant non ionique de 0,1 % (v/v) dans du PBS supplémentaires 10 min à température ambiante.
  7. Effectuer le blocage avec 5 % lait écrémé en poudre dans 1 mL de PBS pendant 1 h à température ambiante.
  8. Laver 3 fois avec 1 mL de PBS et incuber les cellules avec anti-CD105 (1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD44 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-STRO-1 (1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD90 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD73 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-β3-tubuline (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-NFH (au 1/100 / 5 x 105 cellules) et anti-GAP43 (au 1/100 / 5 x 105 cellules) mAb pendant 1 h à température ambiante.
  9. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS et incuber avec anti-souris PE (01:50 / 5 x 105 cellules) ou anti-lapin CY5 (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb supplémentaires 1 h à température ambiante.
  10. Utiliser les anticorps secondaires pour blocage des cellules immunopositifs (anti-souris PE ou anti-lapin CY5 mAb) et d’analyser tous les échantillons avec un cytomètre en flux et acquérir au moins 20 000 événements.

7. évaluation de l’Expression de la PrPC en hDPSCs par Flow Cytometry analyse

  1. Culture les plaques 6 puits de hDPSCsin (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5).
  2. Détacher des hDPSCs 21 et 28 jours de séparation de la pulpe dentaire et après 7 ou 14 jours avec milieu de culture neuronal (étape 5.1) avec 1 mL de trypsine-EDTA et arrêter l’action de la trypsine, comme indiqué au point 6.4. Difficulté les spécimens avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 10 min à 4 ° C.
  3. Permeabilize avec 0,1 % (v/v) non ionique surfactantin PBS pendant 10 min à RT. Retirez le surnageant et tacher les cellules avec lapin anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb pendant 1 h à RT. incuber avec anti-lapin CY5 (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb pour supplémentaire 1 h à température ambiante.
  4. Analyser tous les échantillons avec un cytomètre de flux et d’acquérir au moins 20 000 événements.

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Résultats

Les procédures d’isolement et de séparation de hDPSCs de la pulpe dentaire, obtenue à partir de la troisième molaire, sont des processus complexes dans lesquels petits changements peuvent entraîner un résultat ruineux. Dans cet article, nous utilisons le protocole de Arthur et al. 12 avec plusieurs améliorations. Un schéma représentatif de procédures est illustré à la Figure 1.

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Discussion

Dans ce travail, nous nous sommes concentrés sur les méthodes d’isolement et de la différenciation neuronale de hDPSCs ; en outre, nous avons évalué le rôle de la PrPC dans ce processus. Il y a plusieurs méthodes pour isoler et différencier hDPSCs en cellules semblables à des neurones et des étapes critiques au cours du processus. hDPSCs sont capables de se différencier en plusieurs lignées comme chondroblastes, adipocytes, ostéoblastes et neurones. Dans notre document, nous avons étudié les ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la « Fondazione Varrone » et Rieti Université Hub « Sabina Universitas » de Vincenzo Mattei.

La figure 5 (A, B) reproduit avec la permission de l’éditeur Taylor & Francis Ltd du : complexe multimoléculaire de rôle de Prion protein-EGFR durant la différenciation neuronale des humains cellules souches issues de pulpe dentaires. Mekki, S., Manganelli V., C. Santacroce, Santilli F., L. Piccoli, Sorice M. Mattei V. Prion. Le 4 mars 2018. Taylor & Francis Ltd.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin B solutionSigma-AldrichA2942It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulinCell Signaling Technology #4466One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulPositive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73 Cell Signaling Technology 13160CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulPositive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43 Cell Signaling Technology #8945Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE Abcamab7003Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH Cell Signaling Technology #2836Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5 Abcamab6564Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulPositive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTSGibco by life technologiesA14867-01B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer BD BiosciencesAC6531180187Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software BD BiosciencesControls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGFPeproThec, DBA100-18Bbasic Fibroblast Growth Factor 
Centrifuge CL30RTermo fisher Scientific11210908it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541Termo fisher Scientific317527-185it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV Life Technologies17104019Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel Swann-Morton501It is use to cut tissues
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGFPeproThec, DBAAF-100-15Epidermal Growth Factor 
Fetal Bovine SerumGibco by life technologies10270-106FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filterSarstedt831,823,101it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNPQiagenGS56214 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1xGibco by life technologies240200083The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent Qiagen301705HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A Gibco by life technologies10888022Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons 
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin EurocloneECB3001D It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS)EurocloneECB4004LX10 PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,FSarstedt833,920,300It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented CapSarstedt833,910,302Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA EurocloneECB3052D Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
TubeSarstedt62,554,502Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted MicroscopeZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.

Références

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