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要約

ここでプリオン蛋白発現神経細胞の分化過程を評価するために人間の歯髄幹細胞の分離と伝搬するためのプロトコルを提案する.

要約

胚性幹細胞の操作に関連する生命倫理の問題は、医学研究の分野での進歩を妨げています。このため、脂肪、臍帯、骨髄血などさまざまな組織から成体幹細胞を得ることが非常に重要です。可能なソースの間で倫理的配慮に関して入手が容易だから、歯髄は特に興味深いです。確かに、ひと歯髄幹細胞 (hDPSCs) は成体幹細胞の神経様細胞に区別することの一種で、健康な患者 (13-19 歳) の第 3 大臼歯から取得することができます。特に、歯髄除去掘削機と、小さなスライスにカット、IV コラゲナーゼで処理し、フラスコで培養します。神経細胞の分化を誘導して、2 週間 hDPSCs EGF/bFGF と刺激を受けました。以前は、その分化過程プリオンの内容 hDPSCs の蛋白質 (PrPC) 増加を確認しました。Cytofluorimetric 分析は、神経細胞の分化プロセス後に増加した PrPCの早期発現を示した。SiRNA による prpCアブレーション PrP EGF/bfgf 投与による神経細胞の分化を防止しました。本稿で我々 は分離、分離およびいくつかの簡単な手順で hDPSCs 栽培体外を強化より効率的な細胞クローンされた間葉系幹細胞 (MSCs) の取得と大規模な拡大を説明します。観察されました。また、どのプロトコルでは、詳細な方法で得られた、hDPSCs、MSCs の神経分化過程とその後の細胞および分子プロセスを研究する優秀な実験モデルを示す.

概要

間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、歯髄、脂肪組織、血液1,2,3,4,5など、いくつかの組織から分離されています。,6。 hDPSCs がプラスチック付着、典型的な線維芽細胞様形態を示す何人かの著者によって報告されるようです。これらは異なるクローン増殖と分化能力7,8の違いと非常に異種の人口を表しています。hDPSCs 間葉系幹細胞 (すなわち CD44、CD90、CD73, CD105、STRO 1) 特定のマーカーの表現、(CD14 CD19 など) いくつかの造血のマーカーは陰性、血液分化9、ことができる10,11。

何人かの著者は、これらの細胞は神経成長因子、bFGF、特定メディアとサプリメント7,12との組み合わせで EGF を添加し、異なるプロトコルを使用して神経細胞のような細胞に分化することが示されています。また、神経細胞の分化のプロセス中に多くのタンパク質が関与しているし、これらのうち、いくつかの論文を表示関連する役割と重要な発現細胞プリオンタンパク質 (PrPC)、胎児および成体幹細胞13,の両方14., 分子として銅代謝、アポトーシス、細胞内の異なる機能を実行できるを表し、耐酸化ストレス15,16,17 PrPC,18,19,20,21,22。

私たち以前紙23、hDPSCs 神経分化過程における PrPCの役割を検討しました。実際には、hDPSCs エクスプレス早熟 PrPCと、神経細胞の分化後追加の増加を観察することが可能だった。他の著者は、幹細胞の神経分化過程における PrPCの可能な役割を仮定しました。確かに、PrPCはアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、ニューロンの24にヒト胚性幹細胞の分化をドライブします。本研究の目的は、神経細胞の分化の間に歯髄、その分化過程と PrPCの役割から幹細胞を得るための方法論を強調していた。

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プロトコル

研究で使用されている第三大臼歯 (13-19 歳) 薬剤またはアルコールの消費のない前の歴史、すべて禁煙と適切な口腔衛生の患者から摘出し.科学歯科で「サピエンツァ」ローマ大学の顎顔面の説明の日に患者または両親からインフォームド コンセントを得た。倫理的な考察、倫理委員会の承認に基づくインフォームド コンセントを得た。

1. 歯や歯髄の抽出

  1. 保全または交通機関のための適切な媒体の準備。
    1. ダルベッコ変更されたワシの中低濃度 L-グルタミン (494.5 mL) とグルコース (DMEM L) を準備します。
    2. ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。0.5 mL アムホテリシン (0.1%)。
  2. 患者から第 3 大臼歯を抽出、すぐに PBS で洗い、培地 15 mL の試験管に入れ、2 時間未満で研究室にそれを転送します。
  3. バイオハザード フード カッターでコロナ カットパスの並列と歯髄腔の屋根を接線によって歯を開きます。
  4. 優しく小さなショベルとパルプを削除し、テスト チューブ内に配置します。
  5. 3 回 PBS で洗浄し、室温 10 分 2,500 × gで遠心分離

2. 歯髄幹細胞の処理

  1. 上澄みを除去、ハンクのソリューションでペレットを再懸濁します、ペトリ皿に配置。5% CO2の 37 ° C で 2 時間インキュベートします。
  2. IV コラゲナーゼ溶液製剤を入力します。
    1. DMEM L の 0.8 mL を準備します。
    2. DMEM L といくつかの分の渦の 0.8 mL のタイプ IV コラゲナーゼの 1 mg を溶かします。
    3. DMEM L を追加最終濃度を持っているまで 1 mL 1 mg/mL。
    4. 0.22 μ M のフィルターでソリューションをフィルター処理します。
  3. 常温 10 分 2,500 × gで遠心分離によってハンクのソリューションを削除し、使い捨てメスと approximatively 1 mm の小さなスライスにパルプを分割します。
  4. ペトリ皿で果肉のスライスを配置し、1 ml 5% CO2の 37 ° C で 15 分間タイプ IV コラゲナーゼの間加温します。
  5. 培準備 (500 mL)。
    1. 445 ml と L グルタミン DMEM L。
    2. ウシ胎児血清 (FBS) (10%) の 50 mL を追加します。
    3. ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。
  6. 2,500 x gで RT 10 分のサンプルを遠心、上清を削除、5% CO2の 37 ° c (ステップ 2.5) 中ペレットと T25 フラスコ幹細胞の特定の文化を再懸濁します。

3. 幹細胞文化および伝搬

  1. 毎日文化を確認し、成長の 3 日後、フラスコ内の付着性のセルの異なるクローンを観察します。
  2. 培を 3 日おきに変更します。
  3. 7 と 12 日間付着性のセルがリーチの合流点にしたら、それらをデタッチ 1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C で 3 分間のセルを扱うか優しく細胞スクレーパーを使用しています。
  4. トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 ml (比率 1:5) を追加します。
  5. 259 × gで 6 分の細胞懸濁液を遠心分離機、上澄みを除去し、伝達する T25 フラスコにセルを配置します。
    注:3 日おき、電池が合流点に達する。
  6. 21 または 28 日間 (約 6-8 通路)、培養細胞のような非幹の存在を避けるためにまでセルを反映します。
  7. 1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C または優しくこするで 3 分のための細胞をデタッチします。259 × gで 6 分の細胞懸濁液を遠心します。
  8. 上澄みを除去し、cytofluorimetric 分析 (手順 6) のセルをテストします。

4. 過渡 PrPCサイレンシング siRNA

  1. 2 ml の培養液 (ステップ 2.5) 24 時間 hDPSCsin 6 ウェル プレート (2 x 105セル/mL) の文化します。
  2. 翌日、siRNA PrP メディア (400 μ L) の準備します。
    1. 滅菌試験管に 384 μ L を追加 DMEM l.
    2. 5 の最終濃度を持っている DMEM L に siRNA PrP の種類ごとに 1 μ L を追加 nM (4 siRNA PrP された使用、ノックダウン効率 70% を保証する製造業者によって確認しました)。
    3. DMEM l. に transfectionreagent の 12 μ L を追加します。
    4. 渦混合物、トランスフェクションの複合体の形成を許可する RT で 10 分間インキュベートします。
  3. 各サンプルに siRNA PrP 中の 400 μ L を追加し、37 ° C で 6 時間インキュベート
  4. SiRNA PrP 媒体を破棄せず培 (ステップ 2.5) の 1.6 mL (1 ~ 5 の比) を追加します。
  5. 37 ° C で 72 時間細胞を残す
  6. 上澄みを除去し、2 mL の PBS 室温で 3 回洗浄
  7. 7/14 日 (ステップ 5.1) の神経細胞培養培地 2 mL を追加します。
  8. 神経細胞の培養液を 3 日ごとに変更します。
    注:置換 siRNA PrP ソリューション各時間神経細胞培養培地。
  9. 時間の終わりに、2 mL の PBS 常温で 3 回洗って、西部のしみの分析による神経細胞の表面抗原のテストします。

5. 神経誘導過程 hDPSCs

  1. 神経細胞培養培地の調製 (500 mL)。
    1. 神経細胞に作り出される基底メディア 444.7 mL を準備します。
    2. 媒体無血清サプリメント胎児および成体の神経幹細胞 (10%) の長期的な存続を支援するために使用の 50 mL を追加します。
    3. メディア (最終濃度 20 ng/mL) に 200 μ L の塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF) (最終濃度 40 ng/mL) と 100 μ L の表皮成長因子 (EGF) を追加します。
    4. ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。[中]。
  2. 6 ウェル プレート (2 x 105セル/mL) の文化 hDPSCs パルプ分離から 28 日まで、神経細胞培養培地 2 mL にそれらを刺激します。
  3. 上澄みを廃棄するごとに 3 日間、2 mL の PBS 常温で 3 回洗浄し、交換神経細胞培養培地 2 mL。
  4. 7 および 14 日後に、1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C で 3 分のためのまたは軽くスクレーパーとセルをデタッチします。
  5. トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 mL (比率 1:5) を追加します。
  6. フローサイトメトリー法によるプリオン蛋白質の表現 (ステップ 7) または神経細胞表面抗原 (手順 6) の存在をテストします。

6. フローサイトメトリーによる hDPSCs の評価

  1. 間葉系間質 (MSC) を選択- または特定の神経細胞表面抗原。
  2. 6 ウェル プレート (2 x 105セル/mL) 2 ml の培養液 (ステップ 2.5) で hDPSCs の文化.
  3. 歯髄の分離または 37 ° C または優しくスクレーパーで 3 分の 1 ml のトリプシン-EDTA の神経細胞の培養液 (ステップ 5.1) 14 日後 28 日目に hDPSCs をデタッチします。
  4. トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 ml (比率 1:5) を追加し、259 x centrifugate g室温 6 分別 2 回洗浄 2 ml の PBS の室温
  5. 4 ° C で 10 分間の PBS で 4% パラホルムアルデヒドで未処理または処理の hDPSCs を修正します。
  6. 室温でさらに 10 分の PBS で 0.1% (v/v) 非イオン性界面活性剤 hDPSCS を permeabilize します。
  7. 5% 脱脂粉乳室温 1 時間 1 mL の PBS でブロックを実行します
  8. 1 mL の PBS で 3 回洗浄し、反 CD105 とセルを孵化させなさい (1: 100/5 x 105セル)、抗 CD44 (1: 100/5 x 105セル)、反 STRO 1 (1: 100/5 x 105セル)、アンチ CD90 (1: 100/5 x 105セル)、アンチ CD73 (1: 100/5 x 105細胞)、β3-チューブリン アンチ (1: 100/5 x 105セル)、反フォッカー (1: 100/5 x 105セル) と反 GAP43 (1: 100/5 x 105セル) 室温 1 時間 mAb
  9. 3 回で 1 mL の PBS セルを洗浄し、抗マウス PE (1:50/5 x 10 の5セル) または抗家兎 CY5 と孵化室温追加 1 時間 (1:50/5 x 10 の5セル) モノクローナル抗体
  10. 免疫陽性細胞 (抗マウス PE または抗家兎 CY5 mAb) をゲートの二次抗体を使用し流れの cytometer ですべてのサンプルを分析し、少なくとも 20,000 のイベント。

7. 流れ Cytometry による hDPSCs の PrPC式の評価

  1. 2 ml の培養液 (ステップ 2.5) hDPSCsin 6 ウェル プレート (2 x 105セル/mL) の文化します。
  2. 21 と 28 日歯髄分離から、神経細胞培養培地 1 ml のトリプシン-EDTA の (手順 5.1) で 7 および 14 日後に hDPSCs を外し、手順 6.4 トリプシン アクションを停止します。4 ° C で 10 分間の PBS で 4% パラホルムアルデヒドで試料を固定します。
  3. 0.1% (v/v) 非イオン性 surfactantin PBS で 10 分間でルート削除と上澄みを permeabilize し、ウサギ抗 PrP mAb EP1802Y (1:50/5 x 10 の5細胞) 細胞を染色抗家兎 CY5 とした加温 (1:50/5 x 10 の5セル) で 1 時間の mAb の mAbさらに 1 時間室温
  4. 流れの cytometer ですべてのサンプルを分析し、少なくとも 20,000 のイベントを取得します。

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結果

第 3 大臼歯から得られる歯髄から hDPSCs の分離と分離のプロシージャは、小さな変化が破滅的な結果を導くことができる複雑なプロセスです。本稿でのアーサー et al.プロトコルを使用してください。12いくつかの改善をします。プロシージャの代表的な方式を図 1に示します。

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ディスカッション

この作品での分離と hDPSCs; 神経分化の方法論に着目さらに、このプロセスで PrPCの役割を評価しました。分離し、プロセス中に神経細胞のような細胞で重要なステップ hDPSCs を区別するいくつかの方法があります。hDPSCs は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞などいくつかの系統に区別することができます。私たちの論文では神経細胞の分化のメカニズムと PrPCの存在?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、「Fondazione Varrone」と Rieti 大学ハブ ヴィンチェンツォ ・ マッテイを"サビーナ大学」によって支持されました。

テイラー & フランシス ・株式会社から、図 5 (a, B) は出版社の許可を得て転載: 人間歯科パルプ由来幹細胞の神経分化の間に役割のプリオン蛋白質 EGFR multimolecular 複合体。Martellucci、s.、マンジャネッリ V. マッテイ V.プリオンSorice m ・ ピコリ L. Santilli F. Santacroce C.。2018 3 月 4日。テイラー ・ フランシス (株)

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin B solutionSigma-AldrichA2942It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulinCell Signaling Technology #4466One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulPositive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73 Cell Signaling Technology 13160CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulPositive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43 Cell Signaling Technology #8945Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE Abcamab7003Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH Cell Signaling Technology #2836Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5 Abcamab6564Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulPositive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTSGibco by life technologiesA14867-01B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer BD BiosciencesAC6531180187Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software BD BiosciencesControls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGFPeproThec, DBA100-18Bbasic Fibroblast Growth Factor 
Centrifuge CL30RTermo fisher Scientific11210908it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541Termo fisher Scientific317527-185it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV Life Technologies17104019Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel Swann-Morton501It is use to cut tissues
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGFPeproThec, DBAAF-100-15Epidermal Growth Factor 
Fetal Bovine SerumGibco by life technologies10270-106FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filterSarstedt831,823,101it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNPQiagenGS56214 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1xGibco by life technologies240200083The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent Qiagen301705HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A Gibco by life technologies10888022Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons 
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin EurocloneECB3001D It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS)EurocloneECB4004LX10 PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,FSarstedt833,920,300It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented CapSarstedt833,910,302Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA EurocloneECB3052D Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
TubeSarstedt62,554,502Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted MicroscopeZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.

参考文献

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