הפאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR לאבחון כלבת

Summary

זה בזמן אמת RT-PCR באמצעות הצבע הintercalating מתאים לאבחן זיהומים lyssavirus ירוס. השיטה מתחילה עם רנ א שחולצו מפני חשד כלבת לאחר המוות או דגימות שלאחר המוות, המפרט הכנה לערבב הורים, הוספת RNA, ההתקנה של מכונת בזמן אמת ופרשנות נכונה של תוצאות.

Abstract

הנושא המולקולרי הוא מהיר, רגיש ומדויק, והפכו למרכז לאבחון כלבת. המערכת המבוססת על PCR מבוססת במשך עשורים כדי לאשר אבחון כלבת, אבל רק לאחרונה התקבלה על ידי OIE (הארגון העולמי לבריאות בעלי חיים) כשיטה העיקרית כדי לזהות זיהום בכלבת. בזמן אמת RT-PCR מספק נתונים בזמן אמת, והם מערכות סגורות tube, למזער את הסיכון לזיהום במהלך ההתקנה. DNA intercalating fluorochrome בזמן אמת RT-PCR בחני לא דורשים בדיקות יקרות, למזער את עלות לכל מדגם, וכאשר התחל מתוכננים באזורים שנשמרים, בחני כי הם ספציפיים ברחבי וירוס במקום ספציפי לווירוס אחד בלבד מינים אפשריים. כאן אנו מתארים את הפאן-lyssavirus ירוס SYBR בזמן אמת מזהה RT-PCR המזהה lyssavirus על פני סוג Lyssavirus , כולל וירוסים המפוצלים ביותר ikov, WCBV ו לואלין. בשילוב עם ניתוח עקומת הדיסוציאציה, הטיפול הזה הוא רגיש וספציפי, עם היתרון של זיהוי כל המינים lyssavirus. הבדיקה אומצה במעבדות אבחון רבות ובאיכות סביבה מובטחת, המאפשרת אבחנה איתנה, מהירה ורגישה של בעלי חיים ומקרי כלבת אנושיים.

Introduction

האבחנה של כלבת בשיטות מולקולארית התקבלה על-ידי ה-OIE ב-2018¹, מזהה את היתרונות של טכניקות אלה באימות מקרי כלבת, במיוחד במצבים שבהם הדגימות הן תת-אופטימליות, או לאבחון הנתיחה, כאשר אין דרישה עבור וירוס חי או דגימות טריות. Pcr בחני עבור lyssaviruses דורשים תמלול הפוכה (RT) לפני PCR יכול להתחיל כמו הגנום הוא RNA. RT-PCR בחני אומר כי לזהות את 3 ' האזור האבובי של הגנום נחשבים רגישים ביותר, כמו מעברי הצבע הטרנססקריפט מתרחשים במהלך שכפול lyssavirus. השימוש הנפוץ ב-RT-PCR בחני יכול להיות מחולק בהרחבה לשתי קטגוריות, נקודת קצה (או ג'ל מבוסס) ובזמן אמת. שתי הגישות הן רגישות וספציפיות; עם זאת, בזמן אמת יש כמה יתרונות נוספים כגון קבלת תוצאות ב-' זמן אמת ' והוא מבוצע במערכת שפופרת סגורה לחלוטין, ובכך מפחית את הפוטנציאל לזיהום מפעיל. קיימות שתי גישות עיקריות כדי לזהות הגברה ספציפיים של lyssavirus המתקבלים באמצעות assays בזמן אמת. הראשון מנצל בדיקה הידרוליזה (כגון בדיקה TaqMan) המכילים fluorophore ו מקאורה. כאשר החללית נקשר לאזור היעד במהלך הגברה, את הפעילות האקסאוכירות של הפולימראז התוצאות של הדיסוציאציה של fluorophore ו הקונשר, המאפשר הזריחה והתוצאה להיות נמדד. השני מנצל את הצבע intercalating DNA (fluorochrome כגון SYBR גרין) הנקשר DNA כפול נטוש במהלך הגברה. Fluorochromes מאוגד פולט קרינה פלואורסצנטית כי הוא זיהה בכל מחזור, המאפשר זיהוי בזמן אמת וכימות המוצר. בשל האופי הלא ספציפי של איגוד לכל dsDNA, ניתוח עקומת הדיסוציאציה מבוצעת כדי לאשר את הספציפיות של התגובה. בזמן אמת RT-בדיקות הם מהירים בשל אמפליקון קטן גדלים, בדרך כלל פחות מ 200 bp באורך; עם זאת, זיהוי אזורים מתאימים לעיצוב התחל והבדיקות באזורים שמרו, יכול להוכיח מאתגרת, ולכן הסרת הדרישה לגשוש הוא יתרון ברור.

מספר בזמן אמת RT-בדיקות תוכננו עבור זיהוי באופן ספציפי זנים בודדים או ושלות של rabv² וגם לזהות lyssaviruses על פני סוג^{3,4,5,6, 7,8,9}. כל מאמר יהיה לקבל מגבלה של זיהוי תלוי כיצד שימור התחל (ובמידת הצורך, הבדיקה) רצפים הם על פני הסוג. אכן, זני וירוס המתעוררים או הרומן עשוי להפוך את הבדיקה הספציפית ביותר המבוססת על מבוסס-בדיקה יעיל. הבחירה של זיהוי בזמן אמת (צבען לעומת הבדיקה) יהיה תלוי ביישום מיועד. עבור מעבדה מנהל מעקב על חומר מקומי ממקור המוח ומצפה מספר גבוה של דגימות שליליות, השימוש בצבע intercalating זול הוא בחירה נבונה. הגישה הירוקה SYBR יהיה גם אופטימלי כאשר לנהל מעקב סריקה שבו הנוכחות של הרומן או מפוצלים lyssaviruses יישאר מבלי שיבחינו על ידי בדיקה מוגבלת יותר מבוססי המחקר.

כל חברי הסוג Lyssavirus לגרום כלבת המחלה, אשר קטלנית הסימפטומים פעם מופיעים. הרוב המכריע של המקרים של כלבת האדם והחיה נובע מנגיף הכלבת (RABV), המאגר הדומיננטי שהוא הכלב המקומי¹⁰. עטלפים הם מאגרי מארח חשוב עבור lyssaviruses וכל אלא שני מינים lyssaviruses המאופיינת זוהו ישירות בעטלפים – Ikoma lyssaviruses ירוס (IKOV) וירוס מוקדי (מוקדי) — ושל אלה שני, IKOV העריכו יש מאגר ^{מארח בת 11}. בנוסף ל -16 מינים lyssavirus ירוס¹², ישנם שני lyssavirus שתוארו לאחרונה: העטלף ליסביסוירוס (twblv)¹³ ו kotalahti בת LYSSAVIRUS (kblv)¹⁴. Lyssaviruses יכול להיות מחולק גנטית לשלושה phylogroups, עם הרוב של lyssaviruses, כולל RABV, השייכים לקבוצת phylogroups I. עם זאת, lyssaviruses מפוצלים ביותר שייכים phylogroup III ו צפויים להתגלות על ידי RT-בדיקות שנועד למקד RABV או phylogroup אני וירוס רצפים.

הבקשה המתוארת כאן מנצלת את הזוג JW12-N165 בזמן אמת, שתוארה לראשונה ב-2005³. התחל תוכנן להיות פאן-lyssavirus למרות היישום המקורי היה שיטת TaqMan עם הבדיקות כדי להבדיל מינים lyssavirus. בעקבות האישור כי הזוג הפריימר היה פאן-lyssavirus ביותר הושגה ניצול שיטת 2-step SYBR בזמן אמת על כל מיני lyssavirus זמין כולל WCBV¹⁵. הזוג הפריימר מתואר כאן בתוך צעד אחד RT-PCR בזמן אמת הניצול fluorochrome הintercalating, מאומת באמצעות נציגים מכל 16 מזוהה lyssavirus מינים. זה צעד אחד בזמן אמת שיטת הפעולה היא מהירה, רגיש, שיטת lyssavirus ירוס ספציפי וממחיש כי החוסן של התחל להגדיר לזהות מינים lyssavirus מפוצלים אפילו.

Protocol

דגימות מחומר אבחוני שהתקבל בשנת APHA לאחר זיהום טבעי, או מושגת על ידי עכברים באמצעות פרוטוקולים המוערך על ידי אתיקה APHA והוועדה הסטטיסטית תחת התקנות משרד הבית בבריטניה תחת רישיון 70/7394.

1. כימות ה-RNA באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרו של אמצעי אחסון

1. ודא שההגדרות של הספקטרוסקופיה מוגדרות ל-RNA.
2. השתמש ב-1-2 μL של מים כיתה מולקולריים כדי לאתחל את המחשב ולהגדיר תוכנית בסיסית.
3. השתמש ב-1-2 μL של כל מבחן RNA לדוגמה כדי להעריך את כמות ה-RNA.
4. שמור את הקריאות והמסמכים.
5. להתאים את RNA ל -1 μg/μL, אם נדרש.
   הערה: RNA חייב להישמר בקרח (או בבלוק קריר) בכל עת. אם רנ א מושגת באמצעות עמודה, או מבוסס חרוז שיטה RNA הוא בדרך כלל פחות מ 1 μg/μL. במצב זה להשתמש RNA מסודר.

2. הכנת סדרת דילול RNA לקביעת רגישות לנקודת סיום

1. לעשות דילול טורי 10 קיפול של ה-RNA.
   1. מתייג צינורות עם סדרת דילול (למשל, 10^-1, 10^-2, וכו ') ואת פרטי ה-RNA.
   2. הוסף 45 μL של מים כיתה מולקולרית לכל צינור.
   3. להוסיף 5 μL של RNA (בעבר מדולל ל 1 μg/μL) ומערבבים היטב.
   4. היפטר מעצת פיפטה בחומר חיטוי מתאים והחלף בעצה טרייה.
   5. קח 5 μL מתוך 10^-1 ולהוסיף שפופרת 10^-2 ומערבבים היטב.
   6. חזור על 2.1.3-2.1.5 עם הדילול הנותר.
      הערה: RNA חייב להישמר בקרח (או בבלוק קריר) בכל עת.

3. הכנת התגובות בזמן אמת-PCR

1. באמצעות גיליון אלקטרוני, לתכנן את פריסת צלחת על פי מספר דגימות בדיקה ודגימות בקרה, עבור שניהם lyssavirus ולאחר מכן-actin assays מאמר.
   הערה: אם 4 דגימות יש להיבדק בשכפול עם שליטה חיובית ושלילית, זה שווה ל 10 תגובות עבור שניהם מספר.
2. בחדר נקי או באזור נפרד מתבנית RNA, נגב את המשטחים באמצעות חיטוי מתאים לפני השימוש או הכנת תחנת עבודה של PCR (אם בשימוש). כדי להכין את תחנת העבודה, לנגב את משטח הקבינט עם חיטוי מתאים ולמקם את הפריטים הדרושים לתוך תחנת העבודה ולסגור את הדלתות. . תדליק את האור אולטרא-סגול במשך 10 דקות
3. הסר את ההנהלה ואת התחל מן המקפיא והפשרה (ריאגנטים המפורטים בטבלה 1 והתחל בטבלה 2).
   הערה: תערובת האנזימים מאוחסנת בגליצרול כך שאינה דורשת החלקה ויש לשמור על הקרח (או בבלוק קריר) בכל עת. כל הריאגנטים האחרים ניתן להפשיר בטמפרטורת החדר.
4. פעם להפשיר, לערבב את הריאגנטים ואת צנטריפוגה לזמן קצר כדי לאסוף נוזל.
   הערה: , אל תעשה מערבולת של ערבוב האנזימים. רק צנטריפוגה לזמן קצר
5. הכן תערובות בסיס נפרדות עבור lyssavirus ולאחר מכן-actin. עבור כל תגובה, להוסיף 7.55 μL של מים כיתה מולקולרית, 10 μL של 2x אוניברסלי SYBR שילוב התגובה הירוק, 0.6 μL של קדימה פריימר, 0.6 μL של הפוך פריימר, 0.25 μL של iTaq האנזים ערבוב.
   1. השתמש בגיליון אלקטרוני כדי לחשב אמצעי אחסון נכונים כדי למנוע שגיאות בחישוב ידני. ודא כי מספיק שילוב מאסטר מוכן לפיצוי על שגיאת הליטוף. לכן, אם יש 10 תגובות נדרשים (ראה הערה ב 3.1), להכין 12 תגובות
   2. הכינו את המאסטר-שילוב בקרח (או בבלוק קריר) והישארו על הקרח עד שיוצבו במכונת הזמן האמיתי.
6. מערבבים את המאסטר מוכן תערובות, צנטריפוגה בקצרה ולוותר 19 μL לתוך הבארות הרלוונטיות של צינורות הרצועה או צלחת הבאר 96 תואם עם מכונת בזמן אמת בשימוש.
   הערה: מזער את הייצור של בועות בבארות בזמן הליטוף.
7. בחדר נפרד, או בארון UV הכין כמתואר בשנת 3.2, בזהירות להוסיף 1 μL של ה-RNA שהותאם בעבר ל-1 μg/μL (ראה שלב 1.5) מתחת לפני השטח של היטב מערבב הורים הטוב ולערבב בעדינות. התעלם מעצת הפיפטה לחיטוי ישירות לאחר השימוש (מתחת לפני השטח).
   1. הוסף את הפקדים לאחר דגימות הבדיקה, כאשר הפקד החיובי התווסף לאחר מכן ולא בקרת התבנית (המים המולקולריים) הוספו לאחרונה. כמות ה-RNA שבשימוש ניתן לשינוי בהתאם לסוג המדגם, ו-RNA משמש להפקת. הסכום המשמש חייב להיות מאומת כדי להבטיח שהתגובה ממוטבת.
8. לוחית החותם באמצעות מכסים הרצועה או איטום לטפל כדי להבטיח את כל העפעפיים סגורים היטב מתויג מספיק כדי להתמצא דגימות. סמן את הקצה של שפופרות הלוח/הרצועה.
9. לסובב את הדגימות באמצעות צנטריפוגה לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הבארות.
10. להעביר את הצלחת בזמן אמת מכונת PCR, לפתוח את הדלת ואת המקום במחזיק להבטיח את המיקום הנכון/כיוון הדגימות על פי פריסת הלוח.
    הערה: אם נעשה שימוש ברצועות שפופרת, ודא שהמחזיק נמצא במקומו.
11. פתח את תוכנית המחשב PCR בזמן אמת ובחר את האפשרות להתנסות SYBR בזמן אמת עם עקומת הדיסוציאציה. תכנת את מכונת ה-PCR בזמן אמת באמצעות תנאי הרכיבה התרמיים המצוינים בטבלה 3, כולל נקודות איסוף הנתונים.
12. בחר Sybr כצבע הפלורסנט ובחר לא ידוע כסוג המדגם והוסף שם לתיבה הנכונה שם לדוגמה.
    הערה: להבדיל בין המשכפלת וגם בין ליסביסוירוס לבין בארות-actin.
13. בחר מיקום קובץ כדי לשמור את הנתונים הניסיוניים, לוודא המנורה יהיה כבוי בסוף ההפעלה, ואז להתחיל את הריצה.
    הערה: כצעד הראשון הוא שלב RT, לא נאספים נתונים בזמן זה, לכן, אם המנורה דורשת תקופה חמה זה יכול להתרחש במהלך השלב RT. מכונת בזמן אמת ותוכנה יציג את עקומות הגברה בזמן אמת, בעוד עקומת ההיתוך תיווצר בסוף המחזור.

4. ניתוח נתונים

1. לאחר השלמת ההפעלה לבצע את ניתוח הנתונים כדלקמן.
   1. תחילה לנתח את תוצאות העלילה הגברה של דגימות הבדיקה לצד דגימות הבקרה. דוגמאות חיוביות מציגות רמפות מעריכית, שבדרך כלל מוצגות על-ידי רמה וערך C_t . דגימות שליליות מציגות מגרשי הגברה שטוחים ללא ערכי C_t (איור 1a). ערך C_t מחושב באופן אוטומטי על-ידי התוכנה, למרות שיש לבדוק ולשנות אותה באופן ידני במידת הצורך.
   2. שנית, לנתח את עקומת הדיסוציאציה תוצאות של דגימות הבדיקה לצד דגימות בקרה. לדוגמה חיובית תהיה טמפרטורת התכה (T_m) 77 – 80 ° c, וחפיפה עם איור הבקרה החיובי 1b).
   3. השג את תוצאת האבחון הכוללת על-ידי הבטחת הפקדים תקפים. השתמש בטבלה 4 כדי לפרש את התוצאות ביחס לבקרת הפנימיות-actin הפנימית. אם דגימות הבקרה החיוביות הן שליליות ו/או הדגימות השליליות חיוביות, יש להתעלם מהפעלת ההפעלה.
   4. הקלט את הערכים C_t ו-t_m שהתקבלו עבור RNA הבקרה ב-' כרטיס בקרה ' כדי לאפשר ניתוח מגמות ולעזור לזהות השאיפה של הרגישות.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, הרגישות של הפאן-lyssavirus RT-PCR הוכח בסדרת דילול של וירוס בתקן הבקרה (איור 1) ומגוון של וירוסים אחרים (איור 2ואיור 3). SYBR גרין אני צבען היה מנוצל כצעד אוניברסלי אחד RT-PCR, שבו סינתזה cDNA ו-PCR הגברה מתבצעות בצינור אחד. כמו הגברה של היעד הספציפי מתרחשת, צבע יותר מאוגד, וכתוצאה מכך בזמן אמת רמות גבוהות של זריחה. כל לצבוע intercalating בזמן אמת יש לפרש בשני שלבים: הגברה ודיסוציאציה. שלב הגברה זהה לכל בזמן אמת הגברה (איור 1A). יש ליניארי ' שלב מוקדם ' במהלך מחזורי מוקדם שבו הגברה DNA לא ניתן לחשב עקב אות מספיק ביחס לרקע. אורך זה קשור ישירות לכמות היעד במדגם. לאחר מכן, יש שלב מעריכי שבו ההכפלה של מולקולות DNA הוא זיהה והקליט. לבסוף, מגיע שלב הרמה (מלבד הדגימות המדוללת ביותר שאינן מגיעות לשלב זה לפני סיום התוכנית). בשלב זה, את עוצמת רמות הזריחה החוצה, בשל התשישות של ריאגנטים. חלקות הגברה שנצפו באמצעות דילול טורי של 10 מקפלים של קורות חיים, תאמו את המגרשים הצפויים (איור 1A, ג) שבו שיטת lyssavirus הוכיחה רגישות גבוהה יותר מאשר שיטת למשל-actin. עקומת הדיסוציאציה חושבה לאחר הגברה, שבו dsDNA היה הנתק ל ssDNA על ידי עלייה מצטבר בטמפרטורה ואת הזריחה במעקב כפונקציה של טמפרטורה (איור 1B, D-F). טמפרטורת הסף שבה האמפליקון הספציפי מנתק לתוך ssdna, גרם שחרור של פלואורסצנטית, אשר נמדד על ידי התוכנה התרמוטרטרנר (T_m). שלב זה של דיסוציאציה סיפק נתונים על הגודל אמפליקון, המאפשר למשתמש לפרש את התוצאה בהשוואה לשליטה חיובית, וכתוצאה מכך הסבירות הזניחה של תוצאות שווא-חיוביות. ה-T_mשנצפו על קורות החיים באמצעות התבנית הפאן-ליסביסאווירוס (איור 1B) ושיטת בעלי ממדים (איור 1D) הם ברורים, וסייעו למשתמש לאשר את ניתוח הטיפול הנכון על-ידי הבחנה ב_mהשיגאיור 1E). יתרה מזו, ה-C_tו-T_mהערכים בין הרצפים והאופרטורים העריכו והוכחו כניתנים לאחזור (5 שולחן). הסף המשמש לחישוב ה-C_tערך מחושב באופן אוטומטי על ידי התוכנה ותלוי בגורמים רבים, כולל תערובת התגובה או כלי השימוש. מעבר ל-12 הריצות העצמאיות_tהיה 20.66 (SD 0.63) עבור שיטת lyssavirus ו 27.5 (SD 1.13) עבור השיטת העצמי-actin. לעומת זאת הווריאציה שנצפתה ב-T_mהערכים היו נמוכים במידה ניכרת, עקב חוסר השפעות חיצוניות במדידה זו. לדוגמה, ה-T מתכוון_mלגבי שיטת קורות החיים היתה 78.92 (SD 0.16) (5 שולחן), בהשוואה לממוצע של כל lyssaviruses 78.81 ° צ' (SD 0.531) (. שולחן 6ואיור 1F). זה חוסר וריאציה ב-T_mעל פני ה Lyssavirusסוג הוא יתרון כמו RNA שליטה זהה ניתן להשתמש ללא קשר של lyssavirus במדגם, אולם מבדילים בין מינים lyssavirus באמצעות ה_mאינו אפשרי, במיוחד מאחר ששני מבני משנה של RABV שונים המקיפות את טווח ה-T_mערכים שנצפו (. שולחן 6). שיטת הגברה שאינה ספציפית נצפתה לעתים נדירות באמצעות הקושי הזה; עם זאת, פרמטרים ספציפיים להגדרת תוצאה חיובית לעומת תוצאה שלילית שאינה ספציפית נדרשת. SD נצפתה ברחבי כל lyssaviruses (0.531) הוחל על הנמוך ביותר (77.34-LBVa) והגבוה ביותר (79.67-IKOV) נצפתה T_mערכים לקביעת טווח 76.8 ° צ'-80.2 ° צ' ללהקות מסוימות חיוביות. לכן, T_mערכים הנמצאים מחוץ לטווח זה נחשבו ללא ספציפיים ולכן תוצאה שלילית. מדי פעם מתבוננים מספר פסגות למדגם. אם השיא הדומיננטי הוא להיות מאוד מדוייק_m(עבור כל שכפול) המדגם נחשב חיובי. הסיבה השכיחה ביותר לשיא שאינו ספציפי הוא שנצפו עקב התחל-דימרס, הצורך כבר ממוטב כדי למזער את הדימרס. פריימר דימרס בדרך כלל התוצאה אמפליקון קטן יותר מזו של רצף היעד, ולכן יש_mנמוך יותר מהמוצר הספציפי.

10-מקפלים טורי דילול של שלושה lyssavirus המוח לדוגמה RNAs שחולצו באמצעות TRIzol, היו לפעול במקביל מותווים (איור 2). המגבלה של איתור עבור שלושה lyssaviruses מגוונת, אבל אף אחד לא חרג C_t 36. ערכי מקדם R² עבור וירוסים המותווים באיור 2 נע בין 0.9637 ו 0.996. עבור כל הווירוסים שנותחו (טבלה 6) הטווח לא יעלה על זה, יתר על כן, 7 של 29 lyssavirus היה R² > 0.99 (נתונים לא מוצגים). לקיחת בחשבון כי הכנת סדרת הדילול היא מכלל העקירות RNA, יניאריות נצפתה מספק ראיות כי הטיפול הוא יציב. לבסוף, זיהוי של כל המינים lyssavirus (במיוחד phylogroup III וירוסים המגוונים) נחקר באמצעות פאנל של RNAs הפורש כל שלושת הפילולוהקות בסוג Lyssavirus . RNA שהופק משני עכברים נגועים או מקוריים, חומר מוחי, נוצל באמצעות הפרוטוקולים המתוארים לעיל. התוצאות מאשרות כי התחל להגביר את כל המינים lyssavirus, כולל מפוצלים הקבוצה השלישית lyssavirus וירוסים IKOV, WBCV ו לואלין (שולחן 6 ואיור 3). פאנל מגוון של וירוסים שאינם ליבססאווירוס, שנאסף במקור וניתח¹⁶, ולאחרונה גנטית¹⁷ הוקרן והוא לא חוצה פעילות מחדש זוהה, המציין כי התחל הם ספציפיים חברים בסוג Lyssavirus (הנתונים אינם מוצגים). The פאן-lyssavirus וירוס בזמן אמת נכלל ב-eurl (מעבדה התייחסות האיחוד האירופי) מיומנות בין-מעבדתית מערכות מאז 2013, הוכחת 100% קונקורדנציה עם בחני מולקולרית אחרים כגון התבנית הפאן-lysוירוס taqman וה שיטת ה-RT המקובלת בנוסף ל-FAT (בדיקת נוגדן פלורסנט).

איור 1:10-מקפלים לדילול סדרתי של קורות החיים בקרה חיובית, לרוץ על התבנית הפאן-lyssavirus RT-PCR, דמיינו את העלילה הגברה (א), ואת עקומת הדיסוציאציה (ב), ולהפעיל על הקבוע-actin RT-PCR הנתונים דמיינו כעלילה הגברה (C), ו עקומת הדיסוציאציה (D). NTC = אין בקרת תבנית. השוואה של שליטה באמצעות ה-RNA של קורות החיים על התבנית הפאן-lyssavirus ירוס RT-PCR (כחול) ושיטת השינוי (האדום) הממחיש את ההפרש בעקומות הדיסוציאציה (E) — ראה טבלה 5 עבור ערכים ממוצע; ובסופו של דבר עקומות הדיסוציאציה עבור LBVa (כחול) ו IKOV (אדום) הדגמת טווח של ערכי T_m נצפתה ברחבי סוג Lyssavirus (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2:10 מדלל סידוריים מתקפל עבור שלושה מינים lyssavirus: RABV (RV108), DUVV (RV131) ו-ARAV (RV3379). R² = 0.996, 0.9962 ו 0.9637 בהתאמה. נקודות נתונים ב^-10-7 (0.0001 Ng/μl) הגיעו למגבלת הזיהוי (כאשר התקבל ערך). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הנציג 10-מקפל סדרתי נתונים מעבר לסוג lyssavirus (ראה אגדות בודדות עבור זהות lyssavirus ושולחן 6 עבור התוצאות הטבתיות בהשוואה lyssavirus אחרים). פאנלים a, c, E, מגרשים הגברה G ו -B, D, F, המשך שעות הדיסוציאציה עבור A, c, E, ו-G בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ריאגנט	μL/תגובה
מי כיתה מולקולרית	7.55
2x התגובה האוניברסלית לערבב PCR	10
פריימר קדימה [20 μM]	0.6
פריימר הפוכה [20 μM]	0.6
מיקס אנזימים	0.25
סה כ לכל תגובה	19

טבלה 1: פאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR מומחה לערבב ריאגנטים.

Assay	שם תחל	תפקיד פריימר	רצף 5 ' -3	מיקום1
ליסביסאוירוס	JW12	משורות-המשך	ATG TAA CAC מג טק	53-73
	N165	PCR	GCA GGG טאי טיי טק	165-146
בעלי-אקטין	בעלי-אקטין אינטרוניק	PCR	המנון בייג	1051-1072
	הפוך	משורות-המשך	חתול AAG מזגן	1204-1188
משרות פריימר ניתנות ביחס לרצף פסטר וירוס (M13215) ועכבר-actin רצף גנים (NM_007393)

שולחן 2: וירוס בזמן אמת-RT-PCR לפרטים.

שלב	מחזורי	טמפרטורה	זמן	איסוף נתונים
תמלול הפוכה	1	50 ° c	10 דקות
הפעלת הפעלה/הסטה ראשונית	1	95 ° c	5 דקות
גברה	40	95 ° c	עשרה מנות
		60 ° c	שלושים בנות	נקודת קצה
ניתוח עקומת דיסוציאציה	1	9 ° c	1 דקות
		55 ° c	1 דקות
		55-95 ° c	עשרה מנות	כל הנקודות

שולחן 3: הפאן-lyssavirus בזמן אמת התנאים של אופניים RT-PCR.

תוצאת בדיקה	בקרת שליטה פנימית	תוצאה כוללת
שלילי	שלילי1	לא חוקי. הוצאה ושיטת חזרה2
שלילי	חיובי	דווח על תוצאה שלילית
חיובי	חיובי	דווח על תוצאה חיובית
חיובי	שלילי1	חזרה על החילוץ והשיטת3
מיכל בן שימוש בשליטה חיצונית הטרוולוגי יהיה מועיל במהלך חילוץ חוזר.
מיכל השני אם מתקבלת תוצאה שלילית שניה עבור הפקד הפנימי, המדגם ידווח כבלתי-יציב על-ידי שיטת הפעולה.
מיכל שלוש אם מתקבלת תוצאה שלילית שניה עבור הפקד הפנימי, לצד בדיקה חיובית המתקבלת כלבת משנית
בדיקת האבחון צריכה להתבצע כדי לאשר תוצאה זו.

טבלה 4: סיכום של תוצאות התוצאות הכלליות עבור פאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR. שלילי מיועדת למדגם ללא ערך C_t (הגברה) ולא להמיס טמפרטורה (דיסוציאציה), או להמיס טמפרטורה הנמצאת מחוץ לטווח t_m עבור וירוסים חיוביים (76.8 ° c-80.2 ° c). חיובי הוא מיועד למדגם עם ערך C_t (הגברה) ו להמיס טמפרטורה (דיסוציאציה) אשר נמצא בתוך טווח t_m עבור lyssaviruses חיוביים.

	שיטת lyssavirus		שיטת ברירת
	Ct	Tm	Ct	Tm
תכוון	20.66	78.92	27.5	85.26
SD	0.63	0.16	1.13	0.35
LCL (95%)	19.39	78.59	25.23	84.56
UCL (95%)	21.93	79.25	29.76	85.96

שולחן 5: ניתוח הפעלה בין-מפעילי של בקרה חיובית של קורות חיים על פני 12 מסלולים עצמאיים כולל אופרטורים מרובים.

פילולוגרופ	ינים	מזהה וירוס	יוחסין	הגבלת זיהוי	Tm
אני	הרב שלמה לייב	RV50	מחבט אמריקאי	10-5	79.5
אני	הרב שלמה לייב	RV51	ארה ב פוקס	10-7	77.6
אני	הרב שלמה לייב	RV108	צ'ילה	10-7	78.63
אני	הרב שלמה לייב	RV313	שועל אירופי	10-9	78.53
אני	הרב שלמה לייב	RV437	כלבים אירופאיים	10-7	78.09
אני	הרב שלמה לייב	RV1237	הצבי האירופאי	10-8	78.76
אני	הרב שלמה לייב	RV334	החיסון הסיני	10-8	79.03
אני	הרב שלמה לייב	RV102	אפריקה 2	10-7	78.58
אני	הרב שלמה לייב	RV995	אפריקה 3a	10-8	79.66
אני	הרב שלמה לייב	RV410	אפריקה 3b	10-7	79.03
אני	הרב שלמה לייב	RV2324	אפריקה 4	10-7	79.17
אני	הרב שלמה לייב	RV2417	כלב סרי לנקה	10-9	78.71
אני	הרב שלמה לייב	קורות חיים 11		10-7	79.17
אני	EBLV-1	RV20	גרמניה	10-6	79.05
אני	בלייב-2	RV1787	בריטניה	10-7	78.76
אני	מיכל בלייב	RV2507	גרמניה	10-9	78.71
אני	מיכל שהרבני	RV634		10-8	78.25
אני	DUVV	RV131		10-5	79.03
אני	מיכל בלייב	RV3269		10-7	79.15
אני	הרב	RV3379		10-7	79.46
אני	ח'מוב	RV3380		10-7	78.97
אני	שיBV	RV3381		10-7	78.59
אני	מיכל בע	RV3382		10-3	78.59
השני	ליבבה	RV767		10-5	77.34
השני	. אני מבין	RV3383		10-7	78.59
השני	מוקדי המבקרים	RV4		10-3	78.81
השלישי	מיכל הייקוב	RV2508		10-5	79.67
השלישי	מיכל בע	RV3208		10-4	79.15
השלישי	מיכל בע	RV3384		10-3	79

טבלה 6: סיכום של הפאן-lyssavirus בזמן אמת-PCR, רגישות ו-T_m עבור נציג lyssavirus בכל שלושת הפיללוהקות. ממוצע T_m על פני lyssaviruses היה 78.81 (SD 0.531).

Discussion

התבנית הפאן-lyssavirus בזמן אמת מתוארת שיטת הפעולה המתוארת היא שפופרת סגור, שיטת צעד אחת המזהה את הווירוסים ברחבי שלושת הפיללוהקות. הבחינה מאומתת עבור אבחון בעלי חיים וכלבת אנושית, כולל רקמת מוח שלאחר המוות (גזע מוחי אופטימלי), ודגימות לאחר המוות כגון ביופסיה לעור, שנאספו בצורה סדרתית, או נוזל שדרתי מוחי (שדרתי). התחל השימוש במערכת זו תוכנן לראשונה ונוצל לצורך בדיקה על בסיס המכשיר להבדיל בין RABV, EBLV-1 ו-EBLV-2³, אשר נעשה בו שימוש במעבדות מעבדות רבות של כלבת ומבצעת בעקביות ב-eurl מיומנות המזימות. לאחר מכן, הטבע של ' פאן-lyssavirus ' של התחל האלה אושר באמצעות שיטת בזמן אמת של 2 שלבים¹⁵. הבקשה המתוארת כאן הייתה בשימוש בצבעי היסוד כדי למטב עוד יותר את ה-RT-PCR בשיטת SYBR בעלת שלב אחד, המאפשרת מערכת שפופרת סגורה ומהירה. יתר על כן, הכשרה במדינות כלבת אנדמיים באמצעות השיטה הזאת אישרה התאמה ליישם בכל מעבדה עם PPE בסיסי מערכות איכות כדי להפחית זיהום הצלב דגימות מעקב, מתקנים לאחסן את הריאגנטים ואת בזמן אמת מחשב עם זיהוי SYBR. ה100 הינו עמיד ביותר, ויש לו מתאם% עם השומן, עם רגישות משופרת לדגימות מפורקת³. אחד היתרונות העיקריים עבור שיטת ה-DNA לצבוע מבוסס צבען בהשוואה לחישוב מבוסס הבדיקה הוא העלות היחסית. יתרון נוסף הוא שהסטייה משתמשת רק בשתי התחל, ולכן יש פחות סיכון לגילוי כישלון בשל התפצלות רצף, אשר כבר חולשה במחקר שפורסם בעבר על ידי החוקרת. אכן, נציגי כל מיני וירוס lyssavirus (מלבד TWBLV ו KBLV) מזוהים באמצעות הטיפול הזה, וניתוח רצף של TWBLV ו KBLV על פני האתרים פריימר לא חושף סטייה משמעותית רומז כי הם יזוהו גם באמצעות שיטה זו. טווח הגבלת הזיהוי הנצפה על פני וירוסים שנותחו, יכול להיחשב כתוצאה משני גורמים עיקריים. הראשון הוא ש-RNA היה מבודד מחומר המוח הקליני, ולכן כמות עותקי הגנום בכל מדגם שלא מדולל אינו בדיוק המקבילה. RNA היה ' מנורמל ' על-ידי התאמת ה-RNA הכולל ל-1 μg/μL; עם זאת, שיעור של הגנום הנגיפי RNA בתוך המדגם הזה יהיה שונה. השני הוא המגוון של רצפי lyssavirus, למרות האתרים הפריימר להיות ממוקם באזורים שמרו, שם יישארו עמדות של וריאציה. לכן, זה לא מפתיע כי הרוב של lyssaviruses עם רגישות נמוכה יותר עבור השיטת הם phylogroup II ווירוסים III. ניתוח עקומת הדיסוציאציה מייצג פרמטר חיוני, מזעור תוצאה חיובית שקרית אשר יכול להתרחש באופן אחר בשל היווצרות של מבקיעות, או הגברה של אזור לא ספציפי הגנום המארח. במציאות, זהו מקרה נדיר וניתוח עקומת הדיסוציאציה הוא שווה ערך להפעלת ג'ל agarose כדי להמחיש בגודל הנכון של הגברה המקובלת RT-PCR. מגוון ערכי T_m מקובלים סופק (77-80 ° c), בהתבסס על הנתונים שנאספו במעבדה שלנו. מומלץ מאוד כי מעבדות בודדות לאסוף נתונים בתוך הבית כדי להבטיח את הטווח מועבר ולתקן בהתאם. פענוח התוצאות הן מחלקות הגברה והן מתווה הדיסוציאציה, לצד הפקדים החיוביים והשליליים ותוצאות ה-actin, מאפשר תוצאות אבחון איתנות ועמידות.

מחוץ לטווח של פרוטוקול זה היא שיטת החילוץ RNA המשמש להשגת באיכות גבוהה RNA. כל RNA שנותח בפרוטוקול זה הוכן באמצעות TRIzol; עם זאת, יש הרבה מתאימים guanidium מבוססי מבוסס בסיס RNA פרוטוקולים החילוץ זמין, כולל עמודה ומבוסס חרוז ערכות החילוץ. טיפול של lyssavirus חיובי (או חשד חיובי) דגימות חייב להיות בתוך מתקני biocontainment מורשה אישר בתוך המדינה. עם זאת, RNA הכולל שחולצו הוא לא זיהומיות, ולכן טיפל במעבדות לבלימה נמוכה. בהתאם לשיטת החילוץ בשימוש, הדרישה לכמת ולדלל את ה-RNA צריך להיות מוערך. עבור העקירות מבוססי פנול, כולל TRIzol, שלב זה נדרש ומונע עיכוב של הדרישה מזיהום gDNA; עם זאת, טור ו מבוסס חרוז (במיוחד אלה עם המחסור DNA הבמה) אינם דורשים דילול לפני בדיקות.

במהלך הפרוטוקול, חיוני כי טיפול וחריצות משמשים כדי למנוע זיהום צולב ותוספת מדויקת של דגימה לבארות הנכון. גיליון אלקטרוני עם חישובים מגיב ופריסת צלחות זמינים להורדה כקובץ משלים. אימון טוב במעבדה, כולל משטחי עבודה נקיים, שינויים קבועים של כפפות, שימוש בתיאורי מכשול וחדרים שונים/ארונות UV כדי להפריד כל שלב יהיה למזער את הסיכוי לזיהום. כדי לוודא שהבדיקה מופיעה עם פרמטרים צפויים, יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים, וכל דגימות הבדיקה פועלות בכפולות (או בטרילקאט).

הכללת הפקדים היא תכונה חיונית של כל ה-PCR, במיוחד לאבחון. שליטה חיובית RNA הוכנו מ-קורות חיים (האתגר תקן וירוס) נגוע מוחות העכבר בקבוצות מאומת מכויל כדי להבטיח עקביות בין קבוצות. RNA הבקרה היה ככמת ו מדולל 1 μg/μL. RNA שעבורו תוצאה חיובית הושגה בדילול סדרתי לפחות 10^-4 (שווה ל 100 Pg/μl) נחשב כמתאים למטרה. ה-RNA החיובי היה מאוחסן ב-80 ° c ב -10^-1 . כאשר נדרש, סדרת מחלקים היה מדולל 1:100 כדי לספק מניות עבודה ב 1 ng/μl ומאוחסן ב-80 ° צ' ב 5 μl שימוש יחיד סדרת מחלקים. בקרת מדולל חיובי RNA שימש לייצוג דגימות חיוביות ברמה נמוכה, כדי להבטיח כי כל הפחתה ברגישות של המנה זוהתה. הוחזק ' כרטיס בקרה ' עבור כל פקד כדי לנטר את ערכי ה-_t ולזהות מגמות (טבלה 5). טבלה 5 הפגינו טוב בין הפעלה בין השוואת היכולת של בקרת קורות החיים C_T ו-t_m באמצעות מספר ימים ואופרטורים, מתן ביטחון כי הכדאיות היא איתנה ומוכחת. יש לחקור תוצאות הסטות ממידות אלה ולבדוק דגימות חוזרות במידת הצורך. מים כיתה מולקולרית נכלל בכל ריצה כמו NTC כדי לאשר את הריאגנטים היו ללא זיהום עם RNA lyssavirus ולאשר דגימה שלילית. יתר על כן, כדי להבטיח את היעילות של החילוץ RNA, בדקו במקביל את דגימות הבדיקה בצינור נפרד. בקרת lyssavirus שליטה חיובית היה גם בשימוש עבור שליטה חיובית-actin. גנים אנדוגניים אחרים או מערכות בקרה פנימית הטרוולוגי יכולים להיות מנוצלים. השימוש בפקדים אלה מבטיח שכל הצעדים נותחו תחת אותם תנאים כמו דגימות הבדיקה. מדי פעם, אם המדגם היה מושפל מאוד או לא להכיל מספיק RNA מארח (כגון רוק או שדרתי), ה-PCR גן אנדוסוגני יכול להיכשל. במקרה זה, כאשר lyssavirus בזמן אמת התוצאה RT-PCR היה חיובי, אישור על שאיבת RNA עצמאית-כדי לשלול זיהום במהלך חילוץ RNA על המבחן המקורי או על ידי בדיקה משנית (או מולקולרית, כגון המקובלת RT-PCR) , או FAT. השימוש בטבלה 4 במהלך ניתוח מדגם אבחוני הבטיח את הפרשנות הנכונה.

ללא קשר לשיטה המולקולרית המשמשת לאישור זיהום כלבת, מעקב אחר חקירות באמצעות רצף שומנים כדי לקבוע את מיני הווירוסים וטכניקות קלאסיות בוירולוגיה כגון בידוד FAT או וירוס, יש לבצע גם כדי לאפשר עוד מאפיין וירוס ותמיכה הודעה של מקרים חיוביים ל-OIE ומי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Art Barrier pipette tips (various sizes)	Thermofisher	various
Centrifuge	Beckman	Allegra 21R	Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8.
Centrifuge (mico)	Sigma
Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL)	Thermofisher	various
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit	Bio-Rad	172-5150	Equivalent kits can be used if validated
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system	Stratagene	N/A	Eqivalent machines can be used if validated
MicroAmp reaction plate base	Any suitable		Used to hold tube strip and plates securely.
Optically clear flat clear strips (8)	ABgene	AB-0866
Perfect fit frame (if using tube strips)	Stratagene	N/A	Specific to machine
Primers: for primer details see Table 2.			Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified.
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted	ABgene	AB-600
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes	ABgene	AB-0452
Vortex machine / Whirlimixer	Fisons Scientific equipment	SGP-202-010J
Unless stated, alternative equipment can be used