Pan-lyssavirus Echtzeit RT-PCR für Tollwut-Diagnose

Zusammenfassung

Diese Echtzeit-RT-PCR mit dsDNA interkalierenden Farbstoff ist geeignet, Lyssavirus-Infektionen zu diagnostizieren. Die Methode beginnt mit RNA, die aus Tollwut-Verdachtsproben für Ante-Mortem- oder Post-Mortem-Proben extrahiert wird, detaillierung der Master-Mix-Vorbereitung, RNA-Addition, Einrichtung der Echtzeitmaschine und korrekte Interpretation der Ergebnisse.

Zusammenfassung

Molekulare Assays sind schnell, empfindlich und spezifisch und sind für die Diagnose von Tollwut zentral geworden. PCR-basierte Assays werden seit Jahrzehnten zur Bestätigung der Tollwutdiagnose verwendet, wurden aber erst vor kurzem vom OIE (World Organisation for Animal Health) als primäre Methode zum Nachweis von Tollwutinfektionen akzeptiert. Echtzeit-RT-PCR-Assays liefern Echtzeitdaten und sind geschlossene Röhrensysteme, wodurch das Risiko einer Kontamination während des Setups minimiert wird. DNA-Intercalating Fluorchrome-Echtzeit-RT-PCR-Assays erfordern keine teuren Sonden, wodurch die Kosten pro Probe minimiert werden, und wenn die Primer in konservierten Regionen entwickelt werden, assays, die spezifisch für Viren sind und nicht nur für ein Virus spezifisch sind. Arten sind möglich. Hier beschreiben wir einen Pan-Lyssavirus SYBR Echtzeit-RT-PCR-Assay, der Lyssaviren in der gesamten Gattung Lyssavirus erkennt, einschließlich der unterschiedlichsten Viren IKOV, WCBV und LLEBV. In Verbindung mit der Dissoziationskurvenanalyse ist dieser Test empfindlich und spezifisch, mit dem Vorteil, alle Lyssavirus-Arten zu detektieren. Der Test wurde in vielen diagnostischen Laboratorien mit qualitätsgesicherten Umgebungen übernommen, was eine robuste, schnelle und sensible Diagnose von Tollwutfällen bei Tieren und Menschen ermöglicht.

Einleitung

Die Diagnose von Tollwut mit molekularen Methoden wurde 2018 vom OIE akzeptiert¹, wobei die Vorteile dieser Techniken bei der Bestätigung von Tollwutfällen, insbesondere in Situationen, in denen die Proben suboptimal sind, oder für die Ante-mortem-Diagnose anerkannt wurden, anerkannt wurden, da es keine Anforderung für lebende Viren oder frische Proben gibt. PCR-Assays für Lyssaviren erfordern eine Reverse-Transkription (RT), bevor PCR beginnen kann, da das Genom RNA ist. RT-PCR-Assays, die die proximale Region 3 des Genoms erkennen, gelten als die empfindlichsten, da transkriptionelle Gradienten während der Lyssavirus-Replikation auftreten. Häufig verwendete RT-PCR-Assays können grob in zwei Kategorien unterteilt werden: Endpunkt (oder Gel-basiert) und Echtzeit. Beide Ansätze sind sensibel und spezifisch; Der Echtzeit-Assay hat jedoch einige zusätzliche Vorteile, wie z. B. die Erzielung von Ergebnissen in "Echtzeit" und die Durchführung in einem vollständig geschlossenen Rohrsystem, wodurch das Potenzial für eine Kontamination durch den Bediener verringert wird. Es gibt zwei Hauptansätze, um Lyssavirus-spezifische Amplicons zu erkennen, die mit Echtzeit-Assays erhalten wurden. Die erste verwendet Hydrolysesonden (wie TaqMan-Sonden), die ein Fluorophor und einen Quencher enthalten. Wenn die Sonde während der Amplifikation an den Zielbereich bindet, führt die Exonukleaseaktivität der Polymerase zu einer Dissoziation von Fluorophor und Quencher, wodurch die resultierende Fluoreszenz gemessen werden kann. Die zweite verwendet einen DNA-Interkalierenden Farbstoff (Fluorchrom wie SYBR Green), der während der Amplifikation an doppelsträngige DNA bindet. Die gebundenen Fluorchrome emittieren Fluoreszenz, die bei jedem Zyklus erkannt wird, was eine Echtzeiterkennung und Quantifizierung des Produkts ermöglicht. Aufgrund der unspezifischen Bindung an jede dsDNA wird eine Dissoziationskurvenanalyse durchgeführt, um die Spezifität der Reaktion zu bestätigen. Echtzeit-RT-PCRs sind schnell aufgrund der kleinen Amplicon-Größen, in der Regel weniger als 200 bp in der Länge; Die Identifizierung geeigneter Regionen für die Auslegung von Primern und Sonden in konservierten Regionen kann sich jedoch als schwierig erweisen, daher ist es ein klarer Vorteil, die Anforderung an eine Sonde zu beseitigen.

Eine Reihe von Echtzeit-RT-PCRs wurden entwickelt, um einzelne Stämme oder Abstammungen von RABV² gezielt zu erkennen und auch Lyssaviren der Gattung^{3,4,5,6, 7,8,9}. Alle Assays haben eine Detektionsgrenze, abhängig davon, wie konserviert die Primer(und gegebenenfalls die Sonde) Sequenzen über die Gattung sind. Tatsächlich können neu auftretende oder neuartige Virusstämme die hochspezifischen sonsischen Assays unwirksam machen. Die Wahl der Echtzeit-Erkennung (Dye vs. Sonde) hängt von der beabsichtigten Anwendung ab. Für ein Labor, das die Überwachung von lokal genutztem Hirnmaterial durchführt und eine hohe Anzahl negativer Proben erwartet, ist die Verwendung des billigeren Interkalierenden Farbstoffs eine sinnvolle Wahl. Der SYBR Green-Ansatz wäre auch bei der Durchführung von Scan-Überwachungen optimal, bei denen das Vorhandensein neuartiger oder divergierender Lyssaviren durch eingeschränktere sondenbasierte Assays unentdeckt bleiben würde.

Alle Mitglieder der Gattung Lyssavirus verursachen die Krankheit Tollwut, die tödlich ist, sobald Symptome auftreten. Die überwiegende Mehrheit der Tollwutfälle bei Mensch und Tier ist auf das Tollwutvirus (RABV) zurückzuführen, das vorherrschende Reservoir ist der Haushund¹⁰. Fledermäuse sind wichtige Wirtsreservoirs für Lyssaviren und alle bis auf zwei lyssavirus Arten gekennzeichnet wurden direkt in Fledermäusen identifiziert — Ikoma lyssavirus (IKOV) und Mokola virus (MOKV) — und von diesen beiden, IKOV wurde spekuliert, um eine Fledermaus Host Reservoir ^{haben 11}. Neben den 16 anerkannten Lyssavirus-Arten¹²gibt es zwei Lyssaviren, die kürzlich beschrieben wurden: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)¹³ und Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)¹⁴. Lyssaviren können genetisch in drei Phylogruppen unterteilt werden, wobei die Mehrheit der Lyssaviren, einschließlich RABV, zur Phylogruppe I gehört. Die unterschiedlichsten Lyssaviren gehören jedoch zur Phylogruppe III und werden wahrscheinlich nicht von RT-PCRs nachgewiesen, die auf RABV- oder Phylogruppe-I-Virussequenzen abzielen.

Der hier beschriebene Assay verwendet das Echtzeit-Primerpaar JW12-N165, das erstmals 2005 beschrieben wurde³. Die Primer wurden als Pan-Lyssavirus entwickelt, obwohl die ursprüngliche Anwendung als TaqMan-Assay mit Sonden zur Differenzierung von Lyssavirus-Arten erfolgte. Spätere Bestätigung, dass das Primer-Paar pan-lyssavirus in Spezifität war erreicht wurde mit einem 2-stufigen SYBR-Echtzeit-Assay auf alle verfügbaren Lyssavirus-Arten einschließlich WCBV¹⁵. Das Primer-Paar wird hier in einem einstufigen RT-PCR-Echtzeittest unter Verwendung eines interkalierenden Fluorchroms beschrieben, das mit Vertretern aller 16 anerkannten Lyssavirus-Arten validiert wird. Dieser einstufige Echtzeit-Assay ist ein schneller, empfindlicher, Lyssavirus-spezifischer Test und zeigt, dass die Robustheit des Primers selbst sehr unterschiedliche Lyssavirus-Arten identifizieren kann.

Protokoll

Proben von diagnostischem Material, das bei APHA nach einer natürlichen Infektion erhalten wurde oder durch Impfung von Mäusen unter Verwendung von Protokollen gewonnen wurde, die vom Ethik- und Statistikausschuss der APHA gemäß den Vorschriften des britischen Innenministeriums unter Lizenz 70/7394 bewertet wurden.

1. Quantifizierung der RNA mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer

1. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen des Spektralphotometers auf RNA eingestellt sind.
2. Verwenden Sie 1-2 l molekularem Wasser, um die Maschine zu initialisieren und eine Basislinie festzulegen.
3. Verwenden Sie 1-2 l jeder Test-RNA-Probe, um die RNA-Menge zu bewerten.
4. Speichern Sie die Messwerte und das Dokument.
5. Passen Sie die RNA bei Bedarf auf 1 g/l an.
   HINWEIS: RNA muss jederzeit auf Eis (oder in einem kühlen Block) gehalten werden. Wenn RNA mit einer Spalte oder einer perlenbasierten Methode erhalten wird, ist die RNA in der Regel kleiner als 1 g/l. In dieser Situation verwenden Sie die RNA ordentlich.

2. Vorbereitung der RNA-Verdünnungsserie zur Bestimmung der Endpunktempfindlichkeit

1. Machen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der RNA.
   1. Etikettenröhren mit der Verdünnungsreihe (z.B. 10^-1, 10^-2,etc.) und den RNA-Details.
   2. Fügen Sie jedem Rohr 45 L wassermolekulares Wasser hinzu.
   3. Fügen Sie 5 l der RNA (zuvor auf 1 g/l) verdünnt und gut mischen.
   4. Pipettespitze in geeignetem Desinfektionsmittel entsorgen und durch eine frische Spitze ersetzen.
   5. Nehmen Sie 5 l aus dem 10^-1 und fügen Sie zu 10^-2 Rohr und gut mischen.
   6. Wiederholen Sie 2.1.3-2.1.5 mit den verbleibenden Verdünnungen.
      HINWEIS: RNA muss jederzeit auf Eis (oder in einem kühlen Block) gehalten werden.

3. Vorbereitung von Echtzeit-RT-PCR-Reaktionen

1. Planen Sie anhand einer Kalkulationstabelle das Plattenlayout nach der Anzahl der Testproben und Kontrollproben, sowohl für die Lyssavirus- als auch für die ß-Actin-Assays.
   HINWEIS: Sollen 4 Proben in doppelter Ausweise mit positiver und negativer Kontrolle getestet werden, entspricht dies 10 Reaktionen für beide Assays.
2. Wischen Sie in einem von der RNA-Vorlage getrennten "Reinraum" oder Bereich die Oberflächen vor der Verwendung mit einem geeigneten Desinfektionsmittel ab oder bereiten Sie eine PCR-Workstation vor (falls verwendet). Zur Vorbereitung des Arbeitsplatzes wischen Sie die Schrankoberfläche mit einer entsprechenden Desinfektion ab und legen Sie die benötigten Gegenstände in den Arbeitsplatz und schließen Sie die Türen. Einschalten des UV-Lichts für 10 Minuten
3. Entfernen Sie Regenten und Primer aus dem Gefrierschrank und tauen (Reagenzien in Tabelle 1 und Primer in Tabelle 2).
   HINWEIS: Der Enzymmix wird in Glycerin gespeichert, so dass kein Auftauen erforderlich ist und muss jederzeit auf Eis (oder in einem kühlen Block) gehalten werden. Alle anderen Reagenzien können bei Raumtemperatur aufgetaut werden.
4. Nach dem Auftauen die Reagenzien und die Zentrifuge kurz mischen, um Flüssigkeit zu sammeln.
   HINWEIS: Wirbeln Sie nicht die Enzymmischung, nur Zentrifuge kurz.
5. Bereiten Sie separate Master-Mischungen für Lyssavirus und ß-Actin vor. Fügen Sie für jede Reaktion 7,55 l molekularem Wasser, 10 l 2x universelles SYBR-Grünreaktionsmix, 0,6 l Vorwärtsprimer, 0,6 l Reverse primer, 0,25 l iTaq RT-Enzymmix hinzu.
   1. Verwenden Sie eine Kalkulationstabelle, um korrekte Volumes zu berechnen, um Fehler bei der manuellen Berechnung zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass genügend Master-Mix vorbereitet ist, um Pipettierfehler zu kompensieren. Wenn also 10 Reaktionen erforderlich sind (siehe ANMERKUNG in 3.1), bereiten Sie 12 Reaktionen vor.
   2. Bereiten Sie den Master-Mix auf Eis (oder in einem kühlen Block) vor und bleiben Sie auf Eis, bis sie in die Echtzeitmaschine gelegt werden.
6. Mischen Sie die vorbereiteten Master-Mixe, zentrifugieren Sie kurz und geben Sie 19 l in die entsprechenden Brunnen von Bandrohren oder eine 96-Well-Platte, die mit der im Einsatz sindden Echtzeitmaschine kompatibel ist.
   HINWEIS: Minimieren Sie die Produktion von Blasen in den Brunnen während des Pipettierens.
7. In einem separaten Raum oder in einem UV-Schrank, wie in 3.2 beschrieben, fügen Sie sorgfältig 1 l der zuvor auf 1 g/l (siehe Schritt 1.5) eingestellten RNA unter die Oberfläche des entsprechenden Master-Mix gut und mischen Sie vorsichtig. Pipettenspitze direkt nach Gebrauch (unter der Oberfläche) in desinfizierend entsorgen.
   1. Fügen Sie die Steuerelemente nach den Testproben hinzu, wobei die Positivsteuerung als nächstes hinzugefügt und die No Template Control (NTC – molekulares Wasser) zuletzt hinzugefügt wurde. Die Menge der verwendeten RNA kann je nach Probentyp und verwendeter RNA-Extraktion verändert werden. Die verwendete Menge muss validiert werden, um sicherzustellen, dass die Reaktion optimiert wird.
8. Dichtungsplatte mit Streifendeckeln oder Versiegelung, die darauf achtet, dass alle Deckel fest verschlossen und ausreichend gekennzeichnet sind, um die Proben zu orientieren. Beschriften Sie den Rand der Platten-/Streifenrohre.
9. Drehen Sie die Proben mit einer Zentrifuge herunter, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Brunnen zu sammeln.
10. Übertragen Sie die Platte auf die Echtzeit-PCR-Maschine, öffnen Sie die Tür und platzieren Sie im Halter, um die korrekte Position/Ausrichtung der Proben entsprechend dem Plattenlayout zu gewährleisten.
    HINWEIS: Wenn Rohrstreifen verwendet werden, stellen Sie sicher, dass der Halter an Ort und Stelle ist.
11. Öffnen Sie das Echtzeit-PCR-Maschinenprogramm und wählen Sie die Option für SYBR-Echtzeitexperiment mit Dissoziationskurve. Programmieren Sie die Echtzeit-PCR-Maschine unter Verwendung der in Tabelle 3angegebenen thermischen Zyklusbedingungen, einschließlich der Datenerfassungspunkte.
12. Wählen Sie SYBR als Fluoreszenzfarbstoff aus, und wählen Sie unbekannt als Beispieltyp aus, und fügen Sie einen Namen in das richtige Beispielnamensfeld ein.
    HINWEIS: Unterscheiden Sie zwischen den Replikationen und auch zwischen dem Lyssavirus und ß-Actin-Brunnen.
13. Wählen Sie einen Dateispeicherort aus, um die experimentellen Daten zu speichern, stellen Sie sicher, dass die Lampe am Ende des Laufs ausgeschaltet wird, und starten Sie dann den Lauf.
    HINWEIS: Da der erste Schritt eine RT-Stufe ist, werden während dieser Zeit keine Daten gesammelt, daher kann dies während der RT-Phase auftreten, wenn die Lampe eine Aufwärmphase erfordert. Die Echtzeitmaschine und Software zeigt die Verstärkungskurven in Echtzeit an, während die Schmelzkurve am Ende des Zyklus erzeugt wird.

4. Datenanalyse

1. Nachdem die Ausführung abgeschlossen ist, führen Sie die Datenanalyse wie folgt durch.
   1. Analysieren Sie zunächst die Amplifikationsdiagrammergebnisse der Testproben zusammen mit den Kontrollproben. Positive Stichproben zeigen exponentielle Rampen an, in der Regel gefolgt von Plateau und einem C t-Wert. Negative Stichproben zeigen flache Amplifikationsdiagramme ohne C t-Werte an (Abbildung 1A). Der C t-Wert wird automatisch von der Software berechnet, obwohl dieser überprüft und bei Bedarf manuell geändert werden sollte.
   2. Zweitens, analysieren Sie die Dissoziationskurvenergebnisse der Testproben zusammen mit den Kontrollproben. Eine positive Probe hat eine Schmelztemperatur (T_m) 77 – 80 °C und überlappt sich mit der Positivkontrolle Abbildung 1B).
   3. Rufen Sie das gesamtdiagnostische Ergebnis ab, indem Sie sicherstellen, dass die Steuerelemente gültig sind. Verwenden Sie Tabelle 4, um die Ergebnisse in Bezug auf die interne ß-Actin-Steuerung zu interpretieren. Wenn die Positivkontrollproben negativ und/oder die negativen Proben positiv sind, sollte der Lauf ignoriert werden.
   4. Notieren Sie die für die Kontroll-RNA erhaltenen C t- und T m-Werte in einer "Kontrollkarte", um Trendanalysen zu ermöglichen und Drifts in der Assayempfindlichkeit zu identifizieren.

Ergebnisse

Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurde die Empfindlichkeit des Panlysavirus RT-PCR anhand einer Verdünnungsreihe des Kontrollstandardvirus (CVS) (Abbildung 1) und eine Reihe anderer Lyssaviren (Abbildung 2undAbbildung 3). SYBR Green I Farbstoff wurde als universelle einstufige RT-PCR verwendet, wo cDNA-Synthese und PCR-Verstärkung in einem einzigen Rohr durchgeführt werden. Wenn die Verstärkung des spezifischen Ziels auftritt, wird mehr Farbstoff gebunden, was zu einer in Echtzeit erhöhten Fluoreszenzmenge führt. Alle Farb-Interkalierenden Echtzeit-Assays müssen in zwei Phasen interpretiert werden: Verstärkung und Dissoziation. Die Amplifikationsphase ist identisch mit jeder Echtzeit-Verstärkung (Abbildung 1A). Es gibt eine lineare "Frühphase" während der frühen Zyklen, in der die DNA-Verstärkung aufgrund unzureichenden Signals im Verhältnis zum Hintergrund nicht berechnet werden kann. Die Länge dieser Ziele hängt in direktem Zusammenhang mit der Menge des Ziels in der Stichprobe zusammen. Anschließend gibt es eine exponentielle Phase, in der die Verdoppelung von DNA-Molekülen erkannt und aufgezeichnet wird. Schließlich ist die Plateauphase erreicht (abgesehen von den stark verdünnten Proben, die diese Phase möglicherweise nicht vor dem Ende des Programms erreichen). In dieser Phase steigt die Fluoreszenzintensität aufgrund der Erschöpfung von Reagenzien aus. Die mit einer 10-fachen seriellen Verdünnung von CVS beobachteten Amplifikationsdiagramme entsprachen den erwarteten Diagrammen (Abbildung 1Ac), in dem der Lyssavirus-Assay eine höhere Empfindlichkeit als der ß-Actin-Assay zeigte. Die Dissoziationskurve wurde nach der Amplifikation berechnet, bei der die dsDNA durch einen inkrementellen Temperaturanstieg in ssDNA dissoziiert und die Fluoreszenz als Funktion der Temperatur überwacht wurde (Abbildung 1B, D-F). Die Schwellentemperatur, bei der sich das spezifische Amplikon in ssDNA auflöst, verursachte eine Fluoreszenzfreisetzung, die von der Thermocycler-Software (T_m). Diese Dissoziationsphase lieferte Daten über die Amplicongröße, so dass der Benutzer das Ergebnis im Vergleich zu einer positiven Kontrolle interpretieren kann, was zu einer vernachlässigbaren Wahrscheinlichkeit falsch-positiver Ergebnisse führt. Das T_mCVS mit dem Panlyssavirus-Assay (Abbildung 1B) und ß-actin-Assay (Abbildung 1D) sind unterschiedlich und haben dem Benutzer die Bestätigung der korrekten Assay-Analyse unter_merhalten (Abbildung 1E). Darüber hinaus ist die C_Tund T_mWerte zwischen Läufen und Betreibern bewertet und als reproduzierbar erwiesen (Tabelle 5). Der Schwellenwert, der zur Berechnung der C-_Tder Wert wurde automatisch von der Software berechnet und ist von vielen Faktoren abhängig, einschließlich des verwendeten Reaktionsmixes oder Instruments. Über die 12 unabhängigen Läufe wird der mittlere C_Twar 20,66 (SD 0,63) für den Lyssavirus-Assay und 27,5 (SD 1,13) für den ß-Actin-Assay. Im Gegensatz dazu ist die im T-_maufgrund des Fehlens externer Einflüsse auf diese Messung deutlich niedriger. Zum Beispiel ist der mittlere T_mCVS-Lyssavirus-Assay betrug 78,92 (SD 0,16) (Tabelle 5), im Vergleich zum Mittelwert aller Lyssaviren 78,81 °C (SD 0,531) (Tabelle 6undAbbildung 1F). Dieser Mangel an Variation in der T_müber die LyssavirusGattung ist vorteilhaft, da die gleiche Kontroll-RNA unabhängig vom Lyssavirus in der Probe verwendet werden kann, jedoch zwischen den Lyssavirus-Arten mit dem T unterscheidend_mist nicht möglich, zumal unterschiedliche RABV-Unterlinien den Bereich der T-_mbeobachtete Werte (Tabelle 6). Unspezifische Amplifikationsdiagramme werden bei diesem Test selten beobachtet; Es sind jedoch spezifische Parameter erforderlich, um ein positives Ergebnis im Vergleich zu einem nicht spezifischen negativen Ergebnis zu definieren. Die bei allen Lyssaviren (0,531) beobachtete SD wurde auf die niedrigste (77,34 - LBVa) und die höchste (79,67 - IKOV) beobachtete T_mwerte, um einen Bereich von 76.8 °C - 80.2 °C für positive spezifische Bänder einzustellen. Daher ist T_mWerte außerhalb dieses Bereichs wurden als unspezifisch und damit als negatives Ergebnis betrachtet. Gelegentlich werden mehrere Spitzen wertet. Wenn der dominante Peak am richtigen T_m(für jede Replikation) wird die Stichprobe als positiv betrachtet. Der häufigste Grund, warum ein unspezifischer Peak beobachtet wird, ist aufgrund von Primer-Dimern, der Assay wurde optimiert, um Primer-Dimere zu minimieren. Primer-Dimere führen in der Regel zu einem Amplicon, das kleiner als der der Zielsequenz ist,_mniedriger als das spezifische Produkt.

Eine 10-fache serielle Verdünnung von drei Lyssavirus-positiven Hirnproben-RNAs, die mit TRIzol extrahiert wurden, wurden parallel ausgeführt und geplottet (Abbildung 2). Die Nachweisgrenze für die drei Lyssaviren variierte, aber keines überstieg C_t 36. Die R2-Koeffizientenwerte für die in Abbildung 2 dargestellten Viren reichten von 0,9637 bis 0,996. Bei allen analysierten Viren (Tabelle 6) lag der Bereich nicht über dieser, außerdem hatten 7 der 29 Lyssaviren R² >0,99 (Daten nicht dargestellt). Unter Berücksichtigung der Berücksichtigung der Herstellung der Verdünnungsreihe aus gesamten RNA-Extraktionen liefert die beobachtete Linearität Einen Beweis dafür, dass der Test robust ist. Schließlich wurde der Nachweis aller Lyssavirus-Arten (insbesondere der vielfältigsten Phylogruppen-III-Viren) mit hilfe einer Gruppe von RNAs untersucht, die alle drei Phylogruppen der Gattung Lyssavirus umfassten. DIE RNA, die entweder von originalen oder experimentell infizierten Mäusen, Hirnmaterial, extrahiert wurde, wurde mit den oben beschriebenen Protokollen verwendet. Die Ergebnisse bestätigen, dass die Primer alle Lyssavirus-Arten verstärken, einschließlich der divergierenden Phylogruppe III-Lyssaviren IKOV, WBCV und LLEBV (Tabelle 6 und Abbildung 3). Ein vielfältiges Gremium von Nicht-Lyssavirus-Rhabdoviren, das ursprünglich antigenetisch¹⁶und in jüngerer Zeit genetisch¹⁷ wurden untersucht und eine No-Cross-Reaktivität festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Primer spezifisch für Mitglieder der Gattung Lyssavirus (Daten werden nicht angezeigt). Der Pan-Lyssavirus-Echtzeit-Assay ist seit 2013 in den Interlaboratoriums-Kompetenzschemata des EURL (EU Reference Laboratory) enthalten und weist eine 100%ige Übereinstimmung mit anderen molekularen Assays wie dem Panlyssavirus TaqMan-Assay und dem konventionellen RT-PCR-Assay zusätzlich zum FAT (Fluorescent Antikörper Test).

Abbildung 1: 10-fache serielle Verdünnung der CVS-Positivkontroll-RNA, auf dem Pan-Lyssavirus RT-PCR-Assay ausgeführt, als Amplifikationsdiagramm (A) visualisiert und Dissoziationskurve (B) und auf dem ß-actin RT-PCR-Assay als Amplifikationsdiagramm (C) visualisiert und Dissoziationskurve (D). NTC = kein Vorlagensteuerelement. Vergleich der CVS-Kontroll-RNA läuft sowohl auf dem Panlyssavirus RT-PCR-Assay (blau) als auch auf dem ß-Actin RT-PCR-Assay (rot), der den Unterschied in Dissoziationskurven (E) zeigt — siehe Tabelle 5 für Mittelwerte; und schließlich Dissoziationskurven für LBVa (blau) und IKOV (rot), die den Bereich der T m-Werte zeigen, die in der Gattung Lyssavirus beobachtet wurden (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: 10-fache serielle Verdünnungen für drei Lyssavirus-Arten: RABV (RV108), DUVV (RV131) und ARAV (RV3379). R² = 0,996, 0,9962 bzw. 0,9637. Die Datenpunkte bei 10^-7 (0,0001 ng/l) erreichten die Nachweisgrenze (bei der ein Wert ermittelt wurde). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative 10-fache serielle Verdünnungsdaten aus der gesamten Gattung Deslyssavirus (siehe einzelne Legenden für die Lyssavirus-Identität und Tabelle 6 für tabellarische Ergebnisse im Vergleich zu anderen Lyssaviren). Die Panels A, C, E, G Amplifikationsdiagramme und B, D, F, H Dissoziationskurven für A, C, E und G. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Reagenz	L/Reaktion
Molekulares Wasser	7,55
2x Universal RT PCR-Reaktionsmix	10
Primer Vorwärts [20 'M]	0,6
Primer-Reverse [20 'M]	0,6
RT-Enzymmix	0,25
Gesamt pro Reaktion	19

Tabelle 1: Panlyssavirus-Echtzeit-RT-PCR-Master-Mix-Reagenzien.

prüfen	Primername	Primer-Rolle	Sequenz 5'-3'	Platz1
Lyssavirus	JW12	RT-PCR	ATG TAA CAC CYC TAC AAT G	53-73
	N165	Pcr	GCA GGG TAY TTR TAC TCA TA	165-146
ß-actin	ß-actin intronic	Pcr	CGA TGA AGA TCA AGA TCA TTG	1051-1072
	ß-actin rückwärts	RT-PCR	AAG CAT TTG CGG TGG AC	1204-1188
Primerpositionen werden in Bezug auf Pasteur-Virussequenz (M13215) und Maus-ß-Actin-Gensequenz (NM_007393) gegeben.

Tabelle 2: Panlyssavirus-Echtzeit-RT-PCR-Primerdetails.

bühne	Zyklen	temperatur	zeit	Datenerfassung
Reverse Transcription	1	50 °C	10 Min.
RT-Inaktivierung/Erstdenaturierung	1	95 °C	5 Min.
erläuterungen	40	95 °C	10 s
		60 °C	30 s	Endpunkt
Dissoziationskurvenanalyse	1	9 °C	1 Min.
		55 °C	1 Min.
		55 - 95 °C	10 s	alle Punkte

Tabelle 3: Panlyssavirus-Echtzeit-RT-PCR-Zyklusbedingungen.

Testergebnis	Interne ß-Actin-Steuerung	Gesamtergebnis
ablehnend	Negativ1	Ungültig. Wiederholungsextraktion und Assay2
ablehnend	positiv	Negatives Ergebnis gemeldet
positiv	positiv	Positives Ergebnis gemeldet
positiv	Negativ1	Wiederholungsextraktion und Assay3
1 Die Verwendung der heterologen externen Kontrolle wäre bei der wiederholten Extraktion von Vorteil.
2 Wenn ein zweites negatives Ergebnis für die interne Kontrolle erzielt wird, wird die Probe durch diesen Test als nicht testbar gemeldet.
3 Wird ein zweites negatives Ergebnis für die interne Kontrolle erzielt, wird neben einem positiven Testergebnis eine sekundäre Tollwut
Diagnosetest durchgeführt werden, um dieses Ergebnis zu bestätigen.

Tabelle 4: Zusammenfassung der Ergebnisse und Gesamtergebnisse für panlyssavirus Echtzeit-RT-PCR. Negativ ist für eine Probe ohne C t-Wert (Verstärkung) und ohne Schmelztemperatur (Dissoziation) oder eine Schmelztemperatur, die außerhalb des T m-Bereichs für positive Lyssaviren (76,8 °C - 80,2 °C) liegt. Positiv ist für eine Probe mit einem C t-Wert (Verstärkung) und einer Schmelztemperatur (Dissoziation) bestimmt, die sich innerhalb des T m-Bereichs für positive Lyssaviren befindet.

	Lyssavirus-Test		ß-actin-Assay
	Ct	Tm	Ct	Tm
knauserig	20,66 Uhr	78,92	27,5	85,26
Sd	0,63	0,16	1.13	0,35
LCL (95%)	19.39 Uhr	78,59	25,23	84,56
UCL (95%)	21,93	79,25 Uhr	29,76	85,96

Tabelle 5: Inter-Run-Analyse der CVS-Positivkontrolle über 12 unabhängige Durchläufe, einschließlich mehrerer Operatoren.

Phylogroup	Spezies	Virus-ID	geschlecht	Nachweisgrenze	Tm
Ⅰ	RABV	RV50	US-Fledermaus	10-5	79,5
Ⅰ	RABV	RV51	US Fox	10-7	77,6
Ⅰ	RABV	RV108	Chile Fledermaus	10-7	78,63
Ⅰ	RABV	RV313	European Fox	10-9	78,53
Ⅰ	RABV	RV437	Europäischer RacDog	10-7	78,09 Uhr
Ⅰ	RABV	RV1237	European Deer	10-8	78,76
Ⅰ	RABV	RV334	Chinesischer Impfstoff	10-8	79,03 Uhr
Ⅰ	RABV	RV102	Afrika 2	10-7	78,58
Ⅰ	RABV	RV995	Afrika 3a	10-8	79,66
Ⅰ	RABV	RV410	Afrika 3b	10-7	79,03 Uhr
Ⅰ	RABV	RV2324	Afrika 4	10-7	79,17
Ⅰ	RABV	RV2417	Sri Lanka Hund	10-9	78,71
Ⅰ	RABV	CVS-11		10-7	79,17
Ⅰ	EBLV-1	RV20	Deutschland	10-6	79,05 Uhr
Ⅰ	EBLV-2	RV1787	Großbritannien	10-7	78,76
Ⅰ	BBLV	RV2507	Deutschland	10-9	78,71
Ⅰ	ABLV	RV634		10-8	78,25 Uhr
Ⅰ	DUVV	RV131		10-5	79,03 Uhr
Ⅰ	GBLV	RV3269		10-7	79,15 Uhr
Ⅰ	ARAV	RV3379		10-7	79,46
Ⅰ	KHUV	RV3380		10-7	78,97
Ⅰ	SHIBV	RV3381		10-7	78,59
Ⅰ	IRKV	RV3382		10-3	78,59
Ⅱ	LBVa	RV767		10-5	77,34
Ⅱ	LBVd	RV3383		10-7	78,59
Ⅱ	MOKV	RV4		10-3	78,81
Ⅲ	IKOV	RV2508		10-5	79,67
Ⅲ	LLEBV	RV3208		10-4	79,15 Uhr
Ⅲ	WCBV	RV3384		10-3	79

Tabelle 6: Zusammenfassung der Panlyssavirus-Echtzeit-RT-PCR-Spezifität, Empfindlichkeit und T_m für repräsentative Lyssaviren in allen drei Phylogruppen. Der mittlere T_m über Lyssaviren betrug 78,81 (SD 0,531).

Diskussion

Der beschriebene Pan-Lyssavirus-Echtzeit-RT-PCR-Assay ist ein geschlossener, einstufiger Assay, der Lyssaviren in allen drei Phylogruppen erkennt. Der Test wurde sowohl für die Tier- als auch für die menschliche Tollwutdiagnose validiert, einschließlich post-mortem Gehirngewebe (optimal Gehirnstamm) und Ante-Mortem-Proben wie Hautbiopsie, seriell gesammelter Speichel oder zerebrale Wirbelsäulenflüssigkeit (CSF). Die in diesem Test verwendeten Primer wurden zuerst für einen sondenbasierten Assay entwickelt und verwendet, um zwischen RABV, EBLV-1 und EBLV-2³zu unterscheiden, die in vielen OIE-Tollwutlaboratorien verwendet wurde und in den EURL-Kompetenzschemata konstant funktioniert. Anschließend wurde die "Panlyssavirus"-Natur dieser Primer mit einem 2-stufigen Echtzeit-Assay¹⁵bestätigt. Der hier beschriebene Assay hat die Primer genutzt, um die RT-PCR in einem einstufigen SYBR-Assay weiter zu optimieren, der ein geschlossenes, schnelles System ermöglicht. Darüber hinaus hat die Ausbildung in tollwutendemischen Ländern, die diesen Test verwenden, die Eignung bestätigt, in jedem Labor mit grundlegenden PSA- und Qualitätssystemen zur Verringerung der Kreuzkontamination und Spurenproben, Einrichtungen zur Lagerung der Reagenzien und einer Echtzeit-Speicherung der Reagenzien und einer Echtzeit-Untersuchung zu implementieren. Maschine mit SYBR-Erkennung. Der Assay ist extrem robust und hat eine 100%ige Korrelation mit der FAT, mit verbesserter Empfindlichkeit für zersetzte Proben³. Einer der Hauptvorteile für einen DNA-Interkalierenden Farbstoff-basierten Assay im Vergleich zu einem sondenbasierten Assay sind die relativen Kosten. Ein weiterer Vorteil ist, dass der Assay nur zwei Primer verwendet, daher besteht ein geringeres Risiko einer fehlgeschlagenen Erkennung aufgrund von Sequenzabweichungen, was eine Schwäche in zuvor veröffentlichten sonsonenbasierten Assays war. Tatsächlich werden Vertreter aller Lyssavirus-Arten (mit Ausnahme von TWBLV und KBLV) mit diesem Test nachgewiesen, und die Sequenzanalyse von TWBLV und KBLV über die Primer-Sites zeigt keine signifikante Divergenz, die darauf hindeutet, dass sie auch mit diese Methode. Der Bereich der Nachweisgrenze, der bei den analysierten Viren beobachtet wird, kann als auf zwei Hauptfaktoren zurückzuführen sein. Die erste ist, dass die RNA aus klinischem Hirnmaterial isoliert wurde, daher ist die Menge der Genomkopien in jeder unverdünnten Probe nicht direkt vergleichbar. Die RNA wurde durch Die Einstellung der gesamten RNA auf 1 g/l "normalisiert"; der Anteil der viralen Genom-RNA innerhalb dieser Probe variiert jedoch. Die zweite ist die Vielfalt der Lyssavirus-Sequenzen, obwohl die Primer-Sites in konservierten Regionen liegen, gibt es weiterhin Positionen der Variation. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Mehrheit der Lyssaviren mit geringerer Empfindlichkeit für den Test Phylogruppe II und III Viren sind. Die Dissoziationskurvenanalyse stellt einen wesentlichen Parameter dar, der ein falsch positives Ergebnis minimiert, das andernfalls durch die Bildung von Primerdimermern oder die Verstärkung einer unspezifischen Region im Wirtsgenom auftreten könnte. In Wirklichkeit ist dies ein seltenes Ereignis und die Dissoziationskurvenanalyse entspricht dem Ausführen eines Agarose-Gels, um herkömmliche RT-PCR-Amplicons in korrekter Größe zu visualisieren. Der Bereich der akzeptablen T m-Werte wurde (77-80 °C) auf der Grundlage der in unserem Labor gesammelten Daten bereitgestellt. Es wird dringend empfohlen, dass einzelne Laboratorien interne Daten sammeln, um sicherzustellen, dass der Bereich übertragbar ist, und entsprechend geändert werden. Die Interpretation der Ergebnisse sowohl aus den Amplifikations- und Dissoziationsdiagrammen, als auch aus den positiven und negativen Kontrollen und den ß-Actin-Ergebnissen, ermöglicht robuste und reproduzierbare diagnostische Ergebnisse.

Außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls ist die RNA-Extraktionsmethode zur Gewinnung hochwertiger RNA. Alle in diesem Protokoll analysierten RNA wurde mit TRIzol erstellt; Es gibt jedoch viele geeignete Guanidium-basierte Extraktions-RNA-Extraktionsprotokolle, einschließlich Säulen- und Perlen-basierte Extraktionskits. Der Umgang mit Lyssavirus-positiven (oder vermuteten positiven) Proben muss sich in lizenzierten Biocontainment-Einrichtungen befinden, die innerhalb des Landes zugelassen sind. Die gesamte extrahierte RNA ist jedoch nicht infektiös und wird daher in Laboratorien mit niedrigem Containment behandelt. Je nach verwendeter Extraktionsmethode müsste die Anforderung zur Quantifizierung und Verdünnung der RNA bewertet werden. Für Phenol-basierte Extraktionen, einschließlich TRIzol, ist dieser Schritt erforderlich und verhindert, dass die Hemmung des Tests gDNA kontaminiert; Spalten- und Perlenextraktionen (insbesondere solche mit einem DNA-Abbaustadium) erfordern jedoch keine Verdünnung vor der Prüfung.

Während des gesamten Protokolls ist es wichtig, dass Sorgfalt und Sorgfalt eingesetzt werden, um Kreuzkontamination und genaue Zugabe von Proben zu den richtigen Brunnen zu verhindern. Eine Kalkulationstabelle mit den Reagenzienberechnungen und dem Plattenlayout steht als Zusatzdatei zum Download zur Verfügung. Gute Laborpraxis, einschließlich sauberer Arbeitsflächen, regelmäßiger Handwechsel, Verwendung von Barrierespitzen und verschiedenen Räumen/UV-Schränken, um jede Stufe zu trennen, minimiert die Gefahr einer Kontamination. Um sicherzustellen, dass der Test mit erwarteten Parametern durchgeführt wird, müssen positive und negative Steuerelemente einbezogen werden, und alle Testbeispiele werden in doppelter Ausführung (oder dreifach) ausgeführt.

Die Einbeziehung von Steuerungen ist ein wesentliches Merkmal jeder PCR, insbesondere für die Diagnose. Positive Control RNA wurde aus CVS (Challenge Virus Standard) infizierten Maushirnen in Chargen hergestellt und validiert und kalibriert, um konsistenzzwischen den Chargen zu gewährleisten. Die Kontroll-RNA wurde quantifiziert und auf 1 g/l verdünnt. RNA, für die ein positives Ergebnis in einer seriellen Verdünnung bis mindestens 10^-4 (entspricht 100 pg/l) erzielt wurde, wurde als zweckdienlich angesehen. Die Positivkontroll-RNA wurde bei -80 °C in 10^-1 Aliquots gespeichert. Bei Bedarf wurde ein Aliquot 1:100 verdünnt, um einen Arbeitsbestand bei 1 ng/l zur Verfügung zu stellen, und bei -80 °C in 5 L Einweg-Aliquots gelagert. Die verdünnte Positivkontroll-RNA wurde verwendet, um positive Proben auf niedrigem Niveau darzustellen und sicherzustellen, dass eine Verringerung der Empfindlichkeit des Assays nachgewiesen wurde. Für jede Steuerung wurde eine "Kontrollkarte" aufbewahrt, um die C t-Werte zu überwachen und Trends zu identifizieren (Tabelle 5). Tabelle 5 zeigte eine gute Inter-Run-Vergleichbarkeit für die CVS-Positivkontrollprobe C_t und T m-Werte über mehrere Tage und Operatoren und gab der Sicherheit, dass der Test robust und reproduzierbar ist. Ergebnisse, die von diesen Messungen abweichen, sollten untersucht und Bei Bedarf Proben wiederholt werden. Molekulares Wasser wurde in jedem Lauf als NTC enthalten, um zu bestätigen, dass die Reagenzien frei von Kontamination mit Lyssavirus-RNA waren und eine negative Probe bestätigen. Um die Wirksamkeit der RNA-Extraktion zu gewährleisten, wurde ß-Actin zusammen mit den Testproben in einem separaten Röhrchen getestet. Die Lyssavirus-Positivkontroll-RNA wurde auch zur ß-Actin-Positivkontrolle eingesetzt. Andere endogene Gene oder heterologe interne Kontrollsysteme können genutzt werden. Die Verwendung dieser Kontrollen stellte sicher, dass alle Schritte unter den gleichen Bedingungen wie die Testproben analysiert wurden. Gelegentlich, wenn die Probe stark abgebaut war oder nicht genügend Wirts-RNA (wie Speichel oder CSF) enthielt, kann das endogene Gen PCR versagen. In diesem Fall, wenn das Lyssavirus-Echtzeit-RT-PCR-Ergebnis positiv war, Bestätigung auf eine unabhängige RNA-Extraktion - eine Kontamination während der RNA-Extraktion auf dem ursprünglichen Test oder durch einen sekundären Test auszuschließen (entweder molekular, wie herkömmliche RT-PCR) oder FAT. Die Verwendung von Tabelle 4 bei der Analyse einer diagnostischen Probe sorgte für die korrekte Interpretation.

Ungeachtet des molekularen Assays zur Bestätigung der Tollwutinfektion sollten folgeuntersuchungen mit Sanger-Sequenzierung zur Bestimmung der Lyssavirus-Arten durchgeführt werden, und klassische Techniken in der Virologie wie FAT oder Virusisolation sollten ebenfalls durchgeführt werden, um weitere Viruscharakterisierung und unterstützen die Meldung positiver Fälle an OIE und WHO.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Art Barrier pipette tips (various sizes)	Thermofisher	various
Centrifuge	Beckman	Allegra 21R	Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8.
Centrifuge (mico)	Sigma
Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL)	Thermofisher	various
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit	Bio-Rad	172-5150	Equivalent kits can be used if validated
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system	Stratagene	N/A	Eqivalent machines can be used if validated
MicroAmp reaction plate base	Any suitable		Used to hold tube strip and plates securely.
Optically clear flat clear strips (8)	ABgene	AB-0866
Perfect fit frame (if using tube strips)	Stratagene	N/A	Specific to machine
Primers: for primer details see Table 2.			Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified.
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted	ABgene	AB-600
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes	ABgene	AB-0452
Vortex machine / Whirlimixer	Fisons Scientific equipment	SGP-202-010J
Unless stated, alternative equipment can be used