Method Article
יצירת סוגי תאים הבדיל מתאי גזע האדם הרב עוצמה (hPSCs) מחזיק הבטחה טיפולית גדולה אך נשאר מאתגר. PSCs לעתים קרובות מפגין חוסר יכולת מובנית להבדיל גם כאשר מגורה עם קבוצה נאותה של אותות. מתוארים כאן הוא כלי פשוט כדי לשפר בידול רב היוחסין על פני מגוון של קווי PSC.
למרות השימוש הגוברת של תאי גזע pluriפוטנטי (PSCs), אתגרים ביעילות מבדילים עובריים ומושרה בתאי גזע pluriפוטנטי (ESCs ו-iPSCs) ברחבי ליננים שונים להישאר. פרוטוקולים רבים של בידול פותחו, אך השונות באמצעות קווי התאים ושיעורי בידול נמוכים להקנות אתגרים בהצלחה יישום פרוטוקולים אלה. המתואר כאן הוא אמצעי קל וזול כדי לשפר את יכולת הבידול של PSCs. זה כבר הוכח כי טיפול בתאי גזע עם ריכוז נמוך של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) מגביר באופן משמעותי את הנטייה של מגוון רחב של PSCs להבדיל בין סוגי תאים שונים לאחר בידול מכוון. טכניקה זו הוכח כעת להיות יעיל על פני מינים שונים (למשל, העכבר, הפרימטים, והאנושי) לתוך מספר רב של הגילאים, החל נוירונים והרורואידים הקליפת הגוף תאים שרירים חלקה והפטציטים. טרום טיפול DMSO משפר PSC בידול על ידי ויסות מחזור התא לקרקע התאים גזע להיות מגיב יותר אותות בידול. בתנאי כאן הוא מתודולוגיה מפורטת לשימוש בכלי זה פשוט כאמצעי הניתן ליישום והחלים נרחב כדי להבדיל ביתר יעילות PSCs לכל השושלת של בחירה.
השימוש בתאי גזע פלאוריטי הוביל התקדמויות רבות במחקר ביו, כולל שדות של רפואה רגנרטיבית ו-תא גזע טיפולים מבוססי, דוגמנות מחלות, והקרנת סמים. זה גם הוביל לאפשרות הכללית של מחקר לתרגום יותר ורפואה אישית. הופעתו של תא גזע המושרה pluripotent (iPSC) הטכנולוגיה לפני 20 שנה הרשו לחוקרים לפתח תאים גזע pluriפוטנטי מרקמות סומטיים ולהבדיל אותם לתוך סוגי תאים פונקציונליים ללמוד מגוון של פתווגיות, כולל מחלות לב וכלי דם, נוירולוגיות ואימונולוגיים. למרות צעדים משמעותיים נעשו בטכנולוגיית גזע תא בידול, אתגרים ביעילות מבדילים בתאי גזע האדם העובריים (hESCs) ו iPSCs עדיין להתמיד, הגבלת השימוש הנרחב של הטכנולוגיה תא גזע על פני שונים תוכניות מחקר. השונות הטבועה בין קווי תאים שונים ושיבוטים ממשיכה להציב מכשולים להבדיל קווי גזע התאים הרצוי לינינים1. יתר על כן, הנובעות בוגרת, תאים פונקציונליים מובחנים סופני מ hPSCs נשאר תהליך מייגע ובלתי יעיל על פני ליננים רבים. למעשה, תאים הבדיל מ hPSCs לעתים קרובות להיכשל סופני להבדיל תאים פונקציונליים2. ב הנעה נוספת מבוססי תא גזע טיפולים להשתמש בחולים, יש צורך לשפר ולהבטיח את היעילות של תאים הנוצרים מ hPSCs.
המעבדה שלנו הקימה כלי מהיר, זול כדי לשפר באופן משמעותי את היעילות של ההבחנה הן iPSCs ו ESCs לתוך סוגי תאים בוגרים. מצאנו כי טרום טיפול של hiPSCs ו hESCs עם מאוד נפוץ diמתיל סולפוקסיד (DMSO) עבור 24 h כדי 48 h לפני בימוי תוצאות בידול בשיפור מסומן ביכולת בידול תא גזע. טיפול עם DMSO מגביר את הפרופורציה של hiPSCs ו hESCs בשלב מוקדם G1 של מחזור התא ומפעילה את חלבון retinנובלסטומה (Rb)3, וסת קריטי של התפשטות התא, הישרדות, ובידול4. בעבודה יותר לאחרונה, זה נמצא כי Rb ואת בני משפחתה נדרשים עבור השפעות פרו בידול של DMSO, כגון הפעלה ארעית של Rb מדכאת את ההשפעות של DMSO, בעוד הפעלה חוקתית של Rb באופן ארעי מגביר . ההשפעות של DMSO5 מקביל למחזור התאים במהלך פיתוח עובריים, מחזור התא של escs ו-iPSCs מאופיין בשלב מקוצר של G1 המקדם התחדשות עצמית6,7,8. שלב זה מקוצר G1 מאפשר התפשטות בלתי מוגבלת יותר, אך מגביל את הפוטנציאל לבידול4,9. על-ידי קידום מעצר גדילה ב-G1 והפעלת פקדי מחסום במחזור התא של hESCs ו iPSCs, התאים הראשוניים DMSO הטיפול עבור שינויי הגורל התא בעקבות בידול מכוון.
עד כה, dmso טרום טיפול הוכח לשפר את יכולת הבידול לכל שלוש שכבות הנבט ביותר מ 30 שליטה ומחלות ספציפיים האדם ESC ו ipsc קווי התא3,5 , כמו גם את הבידול של תאי גזע ואחרים קווי תאים למגוון סוגים אחרים של תאים בוגרים במחקרים הבאים10,11,12,13,14,15,16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , 28 (טבלה 1). יתר על כן, הטיפול dmso הוכח להיות יעיל בשיפור הבידול של תאים ראשוניים לא אנושיים21,23 (למשל, עכבר, פרימטים, ארנב), מציע מנגנונים משותפים על פני מינים. לבסוף, הטיפול הקדם DMSO הורחב גם לטכנולוגיה לעריכת גנים, עם מחקר אחד מסוים מראה כי 24 h DMSO טרום טיפול של hESCs/iPSCs הגדילה באופן משמעותי את היכולת של אשכולות קבועים מקובצים באופן קבוע Interinggspic הקצר (קריספאר) /כריסטין הקשורה חלבון-9 (Cas9)-תיווך עריכת יעילות של DNA שאינו קידוד מבלי לשלב מוטציות לא מכוונות29. בתנאי כאן היא מתודולוגיה מפורטת של טרום הטיפול DMSO של hESCs ו iPSCs עבור יישומים בביולוגיה תא גזע ובידול מכוון.
1. תחזוקת תאי גזע
הערה: פרוטוקול תחזוקת התאים המתוארים להלן חל על תאי גזע בעלי עוצמה (PSCs) המתוחזקים בתוך מונאולייר חסיד. מדיה, ריאגנטים אחרים, ותרבות התא לוחות המשמשים לפני הטיפול DMSO ניתן לכוונן לפי הצורך. עבור כל הפרוטוקולים הבאים בכתב יד זה, יש לטפל בתאים תחת ארון בטיחות ביולוגי.
2. DMSO טרום טיפול
הערה: בעת ציפוי תאים עבור DMSO טרום טיפול לפני בידול, צפיפות התא התחלתי ציפוי צריך להיות ממוטב עם התחשבות שיעור הצמיחה אופייני של קו הגזע, כמו גם את הפרוטוקול בידול בשימוש. לאמת את העוצמה באמצעות סמנים קונבנציונליים, לפי הצורך. תאים צריכים להיות מיושנים לפחות 1x-2x אחרי הפשרה הראשונית לפני בידול.
3. בידול שכבות הנבט הראשי
הערה: השיטות הבאות מתוארות כיעילות במעבדה שלנו עבור PSCs גדל במונאולייר על 6 צלחות היטב. יש להשתמש בכל אחד מפרוטוקולי הבידול של הבחירה לאחר טיפול DMSO כדי לקדם בידול לתוך הדורות הרצויים. הסר פתרון DMSO לאחר טיפול 24-48 h ולהמשיך עם בידול בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.
4. בידול לסוגי תאים מחולל קדמון
להלן תיאור שיטות שהוצג בעבר להיות יעיל במעבדה שלנו עבור PSCs גדל בתרבויות 2D או 3D. יש להשתמש בכל אחד מפרוטוקולי הבידול של הבחירה לאחר טיפול DMSO כדי לקדם בידול לתוך הדורות הרצויים. הסר פתרון DMSO לאחר טיפול 24-48 h ולהמשיך עם בידול בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.
5. ואלידציה של בידול באמצעות אימונוציטוטוזאור
הערה: השיטות הבאות מתארות פרוטוקול אימונוציטוטוכימי כללי שניתן להתאימו לפי הצורך. נוגדנים ראשוניים הם אלה שאומתו בעבר במעבדה שלנו. טכניקות אחרות עבור אימות של בידול יכול לשמש גם (למשל, הזרמת הזרימה, qPCR, רצפי RNA, בלוק מערבי, מאמר פונקציונלי, וכו ').
מורפולוגיה של DMSO התייחסו iPSCs
האדם iPSCs נגזר הנושאים שליטה היו מתורבתים או במונאולייר 2D חסיד או בתחומי תא תלת-ממד בהשעיה. כ 24 שעות לאחר ציפוי ראשוני, התאים טופלו עם אחד 1% או 2% DMSO עבור 24 h במדיום תחזוקה. נציג תמונות ברייטפילד לאחר טיפול DMSO מוצגים באיור 1. בהתאם לדיווחים הקודמים עבור iPSCs שנשמר במונאולייר3, dmso טרום טיפול הביא ירידה במינון ארעי תלוי בשיעור הצמיחה לעומת התאים שאינם dmso מטופלים (איור 1א). התפשטות זו משויכת לעלייה באיש הקשר לתא אל התא, אשר מבוטא במיוחד ב 2% DMSO מטופלים תאים המציגים היווצרות מוגברת של מושבות תאים מקובצים באשכולות יותר. בסוגים אחרים של תאים, מעצר DMSO-המושרה G1 הוכח להיות משויך עם ביטוי מוגבר של חלבונים המעורבים אינטראקציות תא תא התומכות בעיכוב המושרה מעצר גדילה36. ב iPSCs שמרו כתחומי תא תלת-ממדיים, הטיפול DMSO הגדיל באופן דומה את מספר כדורי התאים (איור 1B). יתר על כן, טיפול DMSO גם הביא פחות משתנה בגדלים 3D כדור, אשר הוכח בעבר להיות מעיד על קיבולת בידול משופר של התאים37. חשוב מכך, לא 1% או 2% DMSO הביא לרעילות תאים, כפי שנמדד על ידי ספירות הכדאיות (n = 3; 2D תרבות% חיים = שליטה: 80 ± 1.3; 1% DMSO: 82 ± 3.7, 2%: 81 ± 2.7; 3D התרבות% live = שליטה: 81 ± 4.3; 1% DMSO: 82 ± 6.7, 2%: 82 ± 2.7). בסך הכל, תוצאות אלה הן עקביות עם הרעיון כי הטיפול DMSO משנה את מחזור התא דפוסי הצמיחה בתאי גזע תרבותי. השפעות אלה על עיכוב הגדילה הם הפיך כאשר DMSO מוסר מן המדיום, כפי שהוצג בעבר3.
טיפול DMSO משפר את הבידול של ESCs לשכבות הנבט הראשי
HUES6 hESCs הופרה על צלחות מצופות 24 שעות ואחריו טיפול עם 2% DMSO עבור 24 h במדיום תחזוקה. תאים הובלו לתוך שלוש שכבות הנבט הראשיות בעקבות הטיפול בתבניות המוצגות באיור 2A30,31,32. תאים הבדיל היו אז תוקנו ומוכתם לוגית לסמנים פרוטותמית של כל שכבת נבט בהתאמה (SOX17 עבור אנדועור, ברכירים עבור מזועור, ו SOX1 עבור ectoderm). כפי שמוצג באיור 2B, 24 h של טרום טיפול עם 2% dmso גדל את הפרופורציה של תאים המבטאים כל סמן שכבת נבט בהתאמה. זה עקבי עם הדיווחים הקודמים מהמעבדה שלנו מראה מוגברת הפעילות החיסונית, ביטוי גנטי, כמו גם מספר מוחלט של תאים הבדיל לקראת כל שכבות הנבט בתאי גזע שטופלו dmso3,5. HUES6 הוא קו hESC עם נטייה נמוכה מאוד לבידול בכל שורות הזמן1, ובכל זאת הטיפול dmso משפר באופן משמעותי את יכולתו להבדיל בכל שכבות הנבט.
טיפול DMSO משפר את הבידול לסוגי תאים מחולל קדמון
כדי לחקור את ההשפעה של DMSO על בידול לסוגי תא של מערכת העצבים, iPSCs האדם הובחנה לתאי קדמון עצביים (NPCs) או אוליגודנדרוציטים בתאי הקדמון (OPCs). כדי ליצור NPCs, תאים טופלו מראש עם 2% DMSO עבור 24 h במדיום תחזוקה ואחריו 12 ימים של בידול בבימויו33 (איור 3א). כפי שמוצג באיור 3B, 2% dmso טרום טיפול הגדילה את הביטוי של NPC סמן PAX6 לעומת שליטה. שימוש בפרוטוקול אחר שאומת בעבר34 (איור 3ג), iPSCs במשך 12 יום ל-opcs. דומה npcs, opcs נגזר iPSCs וללות עם 2% dmso עבור 24 הפגינו הגדלת הפרופורציה של התאים ביטוי opcs סמנים OLIG2 (איור 3ד).
הטיפול הראשוני DMSO ממשיך לשפר את הבידול לתוך סוגי תאים בוגרים
כדי לחקור את ההשפעה של DMSO על בשלבים האחרונים של פרוטוקול בידול, HUES8 hESCs היו מטופלים עבור 24 שעות עם 2% DMSO לפני בידול לתאים β בעקבות 20 יום מונחה פרוטוקול בידול המתואר באיור 4a 35. HUES8 שימשו כפי שהם הוכחו בעבר יש נטייה גבוהה יותר לכיוון השושלת האנדובית1,38. בשלב הקבוע ביותר של עור, התאים הבדיל לבטא SOX17 ו FOXA2, מסופי אנדועור (DE) סמנים ספציפיים. עם בידול נוסף לתוך ושלתי הלבלב (PP1) הבמה, הבדיל תאים PDX1 ו FOXA2, סמנים אופייני לתאי מחולל הלבלב. בשלבים אלה של בידול תא הלבלב, את היעילות של אינדוקציה לתוך DE ולאחר מכן לתוך PP1 היו גבוהים עבור שליטה שניהם dmso-מטופלים hESCs הבדיל לתוך כל שלבים אלה (איור 4B, שלבים 1 ו 3). למרות קו התא HUES8 כבר ציין יש נטייה מוגברת כדי להבדיל לתוך השושלת האנדובית, כמו בידול הוא המושרה עוד לתוך סוגי התא מיוחדים יותר בשלבים הטרמינל הhESCs DMSO מטופלים הרבה יותר עשוי לייצר בוגרת תאים האנדוקרינית הלבלב. היעילות של יצירת PDX1/NKX 6.1 + מחולל כדוריות הלבלב, Neurogenin 3 + תאים אנדוקריניים, ו NKX 6.1/C-פפטיד + SC-β תאים היו גבוהים באופן משמעותי ב-DMSO-מטופלים hESCs (איור 4B, שלבים 4 ו-5). תוצאות אלה הן בקנה אחד עם NPC ו OPC בידול מראה כי DMSO משפר את הפוטנציאל בידול לסוגי תאים מחולל קדמון וגם מוכיח כי ההשפעה של DMSO הוא מתמשך ביצירת סוגי תאים מיוחדים יותר. זה עקבי עם העבודה הקודמת, שם הראינו כי הראשונית 24 h dmso הטיפול מגביר את הבידול לתוך סוגי תא מסופים על פני שכבות נבט, כולל לתוך תאים עצביים, כמו גם הכאת קרדיוציטים31,39 בקווי התא עם נטיות גבוה או עני לבידול3.
הטיפול הראשוני DMSO משפר את פונקציית התא הנגזר hESC בעקבות השתלת vivo
בעבר, הדגמנו את האפקטיביות של טיפול DMSO בשיפור הבידול של hESCs לתוך תאי מחולל הלבלב פונקציונלי מאוחר יותר להראות שיפור מסומן הפרשת אינסולין ב vivo3. שימוש בפרוטוקולים שפורסמו בעבר3,30,40, HUES8 hESCs טופלו עם 1% dmso עבור 24 h, הבדיל לתוך תאים מחולל הלבלב, ו מושתלים לתוך החיסונית scid-בז ' להעריך פונקציונליות (למשל, הפרשת אינסולין בתגובה לאתגר גלוקוז או לגירוי KCl) (איור 5א). בעוד היעילות של הבידול לתוך FOXA2 + (~ 90%) ו-PDX1 + (~ 75%) ושלתי הלבלב היו דומים בין השליטה DMSO מטופלים hESCs (איור 5B) עבור הקו HUES8 hesc, התאים הבדיל בין hESCs בעקבות 24 h 1% dmso הטיפול השתפר התגובה לגלוקוז ו kcl גירוי בעקבות השתלת vivo. שיפורים בפונקציונליות היו ברור בתוך 2 שבועות לאחר ההשתלה (איור 5ג) והתעקש לפחות 16 שבועות לאחר ההשתלה (איור 5ד). ביחד, תוצאות אלה מצביעים על כך pretreatment טרום טיפול לא רק מגביר את היעילות בידול לשכבות נבט, בתאי מחולל, וסוגי תאים בוגרים יותר, אבל גם כי הוא ממשיך לשפר את הפונקציונליות של התאים הבדיל ב vivo.
סוג תא מובחנים | מתחיל סוג תא | % DMSO | אורך של טיפול DMSO | אורך של טיפול DMSO |
תאי הכבד | ESC קו הטלפון של הפאגומה ESC ESC תאי גזע מסנמצ'אל iPSCs ESC ESC קו הטלפון של הפאגומה ESC | 1.0 1.0 1.0 0.5 0.1-2.0 1.0 1.0 0.5 1.0 0.6 | 8 ימים מספר ימים שבעה ימים 10-14 ימים 7-21 ימים שבעה ימים 4 ימים חמישה ימים 2-21 ימים ברחבי | בסמה ואח ', 2008 קנבראט ואנדרסון, 2008 חציר ואח ', 2009 דואן ואח ', 2010 לשבח ואח ', 2014 Kondo ואח ', 2014 סקולניניק ואח ', 2014 שוויץ ואח ', 2015 ניקולאמו ואח ', 2016 ואנהוב ואח ', 2016 |
שכבות הנבט הראשיות | ESCs ו-iPSCs הייסק הייסק | 0.1-2.0 0.5 0.1-2.0 | . עשרים וארבע שעות . עשרים וארבע שעות . עשרים וארבע שעות | צ'שטי ואח ', 2013 צ'שטי ואח ', 2015 לי ואח ', 2018 |
תאי לב | ESCs ו-iPSCs תאים P19 ESCs ו-iPSCs כדוריות הגזע העוברי | 0.1-2.0 1.0 1.0-2.0 0.8-1.0 | . עשרים וארבע שעות 4 ימים 24-30 שעות . עשרים וארבע שעות | צ'שטי ואח ', 2013 צ'וי ואח ', 2014 ואן דן ברג ואח ', 2016 דנג ואח אל, 2017 |
הלבלב תאים | ESCs ו-iPSCs הייסק | 0.1-2.0 0.5 | . עשרים וארבע שעות . עשרים וארבע שעות | צ'שטי ואח ', 2013 צ'שטי ואח ', 2015 |
תאים שרירים חלקים | תאים P19 | 1.0 | 4 ימים | צ'וי ואח ', 2014 |
תאים אנדותל | תאים P19 | 1.0 | 4 ימים | צ'וי ואח ', 2014 |
בנוציטים | iPSCs | 0-1.6 | 4 ימים | Ogaki et al, 2015 |
אפיתל המעי | iPSCs | 0-1.6 | 4 ימים | Ogaki et al, 2015 |
תאים עצביים | מרמוסט iPSC | 0.05-2.0 | . עשרים וארבע שעות | Qiu et al, 2015 |
נויטרופילים | קו התאים של לוקמיה | 1.25 | 6-8 ימים | טאימורינה ומודלו, 2016 |
מיופופרות השלד | iPSCs | 1.5 | . עשרים וארבע שעות | שוורץ ואח ', 2016 |
אורגנואיד | hiPSCs | 1.0 | . עשרים וארבע שעות | יון ואח ', 2018 |
טבלה 1: סיכום העבודה שפורסמה בעבר להפגין את ההשפעות המועילה של טיפול DMSO על בידול.
S1 | S2 | S3 | S5 | |
MCDB131 (L) | 1 | 1 | 1 | 1 |
גלוקוז (גר') | 0.44 | 0.44 | 0.44 | 3.6 |
NaHCO3 (גר') | 2.46 | 1.23 | 1.23 | 1.754 |
FAF-BSA (גר') | 20 | 20 | 20 | 20 |
שלה-X (mL) | 0.02 | 0.02 | מיכל 5 | מיכל 5 |
גלוטמקס (mL) | 10 | 10 | 10 | 10 |
ויטמין C (מ ג) | 44 | 44 | 44 | 44 |
הפארין (מ ג) | 0 | 0 | 0 | 10 |
P/S (mL) | 10 | 10 | 10 | 10 |
שולחן 2: רכיבי התא האנדוקרינית מחולל מדיום בסיס.
איור 1 : הטיפול Dmso משנה את התפתחותם של hPSCs. (א) הנציג ברייטפילד תמונות של hiPSCs מצופה במונאולייר לאחר קבלת שום טיפול (בקרה) או טיפול עם 1% או 2% dmso עבור 24 h. DMSO מקדם את עיכוב זמני הצמיחה תלויי מינון ארעי של iPSCs. (ב) נציג ברייטפילד תמונות של hiPSCs מצופה על לוחות מצורף נמוך כדי לאפשר היווצרות כדור תלת-ממד לאחר קבלת שום טיפול (שליטה) או טיפול עם 1% או 2% dmso עבור 24 h. dmso תוצאות הטיפול משתנה פחות כדור תלת-ממד המערך בהשוואה לשליטה. סרגל קנה מידה = 500 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : הטיפול Dmso משפר את הבידול של hPSCs לשכבות הנבט הראשי. (א) סכמטי של פרוטוקולי בידול המשמשים להפקת שלוש שכבות הנבט הראשיות. (ב) תמונות מייצגות של הבדיל HUES6 hESCs immunolabeled SOX17 (העור), ברכוריה (מזועור), ו SOX1 (כעור). טיפול מקדים עם 2% DMSO עבור 24 h הגביר את יעילות הבידול בכל שלוש שכבות הנבט. אחוזים של תאים המבדילים לתוך SOX17 + העור, Brachyury (Brachy) + מזועורי, או SOX1 + תאים ectodermal עור בעקבות בידול מופנה לכל שכבת הנבט של שליטה ו DMSO-מטופלים hESCs הם ציינו עם SEM של שלושה משכפל ביולוגי . מבחן t הניתן לשיוך: אנדועור p = 0.0003; מזועור p = 0.047; מיכל עור p = 0.015. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : טיפול Dmso משפר את הבידול לסוגי תא מחולל קדמון. (א) סכמטי של פרוטוקול בידול המשמש להפקת תאים מחולל קדמון (npcs). (ב) תמונות מייצגות של iPSCs האדם הבדיל לתוך npcs אימונויניום עבור Pax6. 24 שעות של טיפול מקדים עם 2% DMSO הגדילה את מספר PAX6 תאים חיוביים. אחוזים של תאים המבדילים לתוך Pax6 + NPCs בעקבות הבידול בבימויו של השליטה ו-DMSO התייחס האדם iPSCs הם ציינו עם SEM של שלושה משכפל ביולוגי. לא מזווג t-test: p = 0.0225. סרגל קנה מידה = 200 μm. (C) סכמטי של פרוטוקול בידול המשמש להפקת תאים אוליגודנדרוציטים קדמון (opcs). (ד) תמונות מייצגות של iPSCs אנושיים הבדיל לתוך אימונוcs החיסונית של סמנים Olig2. 24 שעות של טיפול מקדים עם 2% DMSO הגדילו את הביטוי של שני סמני OPC בהשוואה לשליטה. אחוזים של תאים המבדילים לתוך Olig2 + OPCs בעקבות הבידול המכוון של שליטה ו-DMSO התייחסו iPSCs האדם הם עם SEM של ארבעה משכפל ביולוגי. לא מזווג t-test: p = 0.0466. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : הטיפול Dmso משפר את הפוטנציאל בידול הטרמינל של hPSCs. (A) סכימטי של ~ 20 יום בבימויו של הבידול HUES8 hESCs לתוך התאים האנדוקרינית הלבלב הבדיל. (ב) חיסוני לסמנים שצוינו בכל שלב של בידול בעקבות הבידול בבימויו של תאים בקרה ללא טיפול ותאים שטופלו מראש עם 2% dmso עבור 24 h. הטיפול הראשוני DMSO ממשיך להגדיל את הבידול לתוך סוגי תאים האנדוקרינית מסוף בשלבים האחרונים של בידול מופנה. אחוזי התאים המבדילים בין הסמנים המצוינים בכל שלב של בידול בעקבות הבחנה מכוונת של שליטה ו-DMSO-hESCs שטופלו מצוינים עם SEM של שניים עד ארבעה משכפל ביולוגי. סרגל קנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : טיפול DMSO הראשונית של hPSCs משפר את התגובה גלוקוז לאחר השתלת של תאים מחולל קדמון בvivo. (A) סכמטי של בידול מכוון (~ 15 ימים) של HUES8 hESCs לתוך תאים מחולל הלבלב (PP2) בעקבות טיפול לא (שליטה) או 24 h 1% טיפול dmso השתלת הבאים (5,000,000 תאים) לתוך החיסוני עכברים מבוססי SCID-בז '. (ב) אחוז התאים המבדילים לתוך PDX1 + ו FOXA2 + בתאי מחולל הלבלב בעקבות הבידול בימוי חוץ גופית של השליטה dmso-טופלו hESCs מיד לפני ההשתלה (n = 1). (ג) מתכוון אליסה מדידות של אינסולין אנושי מתוך סרום של עכברים בעקבות נמוך (2.5 מ"מ) או גבוה (15 מ"מ) האתגר גלוקוז או אשלגן כלוריד (kcl) גירוי ב (ג) 2 שבועות ו (ד) 16 שבועות לאחר השתלת הלבלב תאים מחולל קדמון הבדיל מהפקד ו-DMSO-מטופלים hESCs (קווי שגיאה = SEM; n = 3 ב 2 שבועות ו -16 שבועות עבור שליטה; n = 2 ב 2 שבועות ו -16 שבועות עבור DMSO). 2-way ANOVA: p = 0.0051 עבור שליטה vs. DMSO ב 2 שבועות; p = 0.0116 לבקרת לעומת DMSO במהלך 16 שבועות. העכברים למדו בנקודות זמן שונות שונים. תוצאות מותאמים מצ ואח '3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי פשוט וזול כדי לשפר את יכולת הבידול של תאי גזע רב עוצמה (PSCs) לכל שכבות הנבט הראשי, סוגים שונים של תאים מיוחדים המתמחה, ואפילו סוגי תאים בוגרים פונקציונלי ב מבחנה ובהגדרות vivo. מומחשים הם פרוטוקולי בידול ספציפיים אשר שוחזרו ביעילות במעבדה שלנו, כמו גם אחרים, אבל כל פרוטוקול הבחנה של בחירה ניתן להשתמש בעקבות הטיפול DMSO. כפי שמוצג בטבלה 1, מספר מעבדות הפגינו גם שיפור של בידול PSC לאחר הטיפול הארעי dmso באמצעות תבניות שונות כדי ליצור סוגים שונים של תאים מסופים אחרים. יתר על כן, למרות השיטות כאן לתאר את השימוש האנושי PSCs, pretreatment טרום טיפול יכול להיות מנוצל על פני מינים, הוכח להיות יעיל בעכבר, ארנב, ו פרימטים PSCs.
למרות מינונים גבוהים יותר של DMSO ידועים להיות ציטוטוקסיני, המינון הנמוך המשמש בשיטה זו (1%-2%) לתוצאה של תקופה ארעית במוות תאים מינימלי. בעוד מספרי התאים הכוללים מיד לאחר טיפול DMSO עלול לרדת בשל הקידום DMSO של מעצר מחזור התא בשלב G1 של מחזור התא, מחקרים קודמים מראים כי התאים מסוגלים להגיע לאותה רמה של שליטה כמו תרבויות בקרה לאחר ההסרה של . היחידה3
האחוז והמשך של טיפול מקדים DMSO צריך להיות ממוטב עבור קו התא. יש לכוונן את זמן הטיפול בהתחשב בזמן הרכיבה וההכפלה של התאים. לדוגמה, העכבר PSCs בדרך כלל יש זמני אופניים קצרים הרבה יותר של כ 15 h; לכן, טיפול DMSO עבור 15 h עבור תאים אלה הוא מספיק. מעבדות מסוימות מצאו גם את הטיפול DMSO להיות מועילים כאשר המשך במהלך הליך בידול או בריכוזים נמוכים (ראה שולחן 1). יש לציין כי כמה קווי PSC יותר amendable לבידול לקווים ספציפיים. לדוגמה, תאים HUES6 הוכחו להיות מתירני פחות כדי בידול ולכן היה מסומן שיפור עם טיפול DMSO (איור 2). לחילופין, HUES8 תאים בשימוש באיור 4 איור 5 הוכחו יש נטייה גבוהה יותר לכיוון בידול אנדועורי; כך, פחות הבדלים הוכחו בין שליטה ו DMSO לבידול בשלבים הראשוניים לכיוון האנדובית מוחלט. עם זאת, השיפור של טרום הטיפול DMSO הוא נצפתה בשלבים מאוחרים יותר של בידול קו זה (איור 4ב). הטיפול DMSO הוא גם רב-תכליתי בכך שהוא יעיל הן 2D ו-3D מערכות תרבויות תא, זה יכול לשמש עם סוגים שונים של חומר ציפוי על לוחות תרבות התא, וזה עובד בסוגים שונים של מדיום תחזוקה לקדם צמיחה והתרחבות של hPSCs (למשל, mTeSR, E8, מדיה ממוזג MEF, וכו ').
באופן כללי יותר, תוצאות אלה מראים כי המצב ההתחלתי של תאים גזע pluripotent יש השפעה חזקה על הנטייה לבידול הראשונית, כמו גם בידול מסוף לתוך סוגי תאים פונקציונליים. הצגנו בעבר כי הטיפול dmso פונקציות דרך Rb ב hPSCs3,5. Rb משחק תפקיד חשוב בקידום בידול מסוף, הישרדות התא, ואת היציבות הגנטית של תאים41,42,43,44, ולכן זה יכול להסביר את ההשפעות המתמדת על תאים הובחנים מ-DMSO-מטופלים hPSCs. מיקוד אלה מצבים מוקדמים של רגולציה עשוי למקם hPSCs על מסלול טוב יותר עבור בידול ובסופו של דבר לשפר את השירות שלהם לרפואה רגנרטיבית.
. למחברים אין מה לגלות
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מאוניברסיטת סטנפורד בית הספר לרפואה ומלגת חברת Siebel הוענק ל-S. C.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353046 | |
9-Position stir plate | Chemglass | CLS-4100 | |
Accutase | Gibco | 11105-01 | |
Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
Advanced RPMI | Gibco | 12633012 | |
Alk5i II | Axxora | ALX-270-445 | |
all-trans retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
anti-Brachyury | R&D Systems | AF2085 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-C-peptide | Developmental Studies Hybridoma Bank | GN-ID4 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-FoxA2 | Millipore | 07-633 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Nkx2.2 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Nkx6.1 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank; | F55A12-supernatant | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Olig2 | EMD Millipore | MABN50 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Pax-6 | Biolegend | 901301 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Pdx1 | R&D Systems | AF2419 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-SOX1 | R&D Systems | AF3369 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | No variablity observed across different lot numbers |
B-27 Supplement, minus Vitamin A | Gibco | 12587010 | |
basic fibroblast growth factor | Gibco | PHG0264 | |
Betacellulin | Thermo Fisher Scientific | 50932345 | |
Chir99021 | Stemgent | 04-000-10 | |
CMRL 1066 | Corning | 99-603-CV | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAF1000 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Disposable Spinner Flasks | Corning, VWR | 89089-814 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Essential 6 Media | Gibco | A1516501 | |
FAF-BSA | Proliant | 68700 | |
FGF7 | PeproTech | 100-19 | |
Geltrex | Gibco | A1413202 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Human Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO Diagnostics | 80-INSHUU-E01.1 | |
ITS-X | Invitrogen | 51500056 | |
KGF | Peprotech | AF-100-19 | |
Knockout DMEM | Gibco | 10829018 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
L-3,3′,5-Triiodothyronine (T3) | EMD Millipore | 642245 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354277 | |
MCDB-131 | Cellgro | 15-100-CV | |
MEM NEAA | Gibco | 11140050 | |
mTeSR 1 | StemCell Technologies | 5850 | |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
NaHCO3 | Sigma | S3817 | |
Noggin Fc Chimera Protein | R&D Systems | 3344-NG-050 | |
PdBU | EMD Millipore | 524390 | |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
Sant1 | Sigma-Aldrich | S4572 | |
SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
Smoothened Agonist, SAG | EMD Millipore | 566660 | |
StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | |
TrypLE | Gibco | 12604013 | |
Ultra-Low Attachment Microplates | Corning | 3471 | |
Vitamin C | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Wnt3a | R&D Systems | 5036-WN | |
XAV 939 | Tocris | 3748 | |
XXI | EMD Millipore | 565790 | |
Y-27632 | StemCell Technologies | 72302 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved