אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

Summary

כאן, אנו מאפיינים מבנה חלבונים ואינטראקציה אתרים בתאים חיים באמצעות חלבון הדפסה הטכניקה הנקראת-cell חמצון מהיר אטמוספרי של חלבונים (IC-fpop).

Abstract

מהיר חמצון פוטוכימיקלים של חלבונים (FPOP) הוא חלבון רדיקלי הידרוקסיל שיטת הדפסה המשמש לאפיון מבנה החלבון ואינטראקציות. FPOP משתמש 248 ננומטר excimer לייזר כדי photolyze תחמוצת מימן הפקת רדיקלים הידרוקסיל. רדיקלים אלה oxidatively לשנות את הממס שרשראות חשופות לצדדים של 19 של 20 חומצות אמינו. לאחרונה, שיטה זו שימש בתאים חיים (IC-FPOP) כדי ללמוד אינטראקציות חלבונים בסביבה הטבעית שלהם. המחקר של חלבונים בתאים חשבונות עבור הצפיפות הבין-מולקולרית ואינטראקציות חלבונים שונים, כי הם מופרדים ללימודי מבחנה. מערכת זרימת תאים בודדת מותאמת אישית תוכננה להפחית את צבירת התאים והסתימה במהלך IC-FPOP. מערכת זרימה זו מתמקדת התאים מעבר לייזר excimer בנפרד, ובכך להבטיח הקרנה עקבית. על ידי השוואת היקף החמצון המיוצר FPOP אל הנגישות הממס של חלבון מחושב ממבנה גביש, IC-FPOP יכול במדויק לחקור את הרשתות בצד ממיס נגיש של חלבונים.

Introduction

הידרוקסיל חלבונים רדיקלים הדפסה (HRPF) היא שיטה כי בדיקה הנגישות הממס של חלבון באמצעות שינויים בעלי שינוי באמצעות שנוצרו באמצעות רדיקלים הידרוקסיל. כאשר מבנה החלבונים או אינטראקציות החלבונים משתנים, זה ישנה את חשיפת הממס של חומצות אמינו, ובכך שינוי היקף השינוי של שאריות. עם hrpf, אינטראקציות חלבונים^1,2,3 ו החלבון התאמות שינויים^4,5,6 נחקרו בהצלחה בתוך מבחנה. ישנן מספר שיטות היוצרות רדיקלים הידרוקסיל עבור ניסויים HRPF, אחד להיות מהיר חמצון פוטוכימיקלים של חלבונים (FPOP). Fpop פותחה על ידי בזריזות ו גרוס ב 2005 ומנצל 248 ננומטר excimer לייזר לייצר רדיקלים הידרוקסיל דרך פוטוליזה של חמצן מימן (H₂O₂)⁷.

לאחרונה, Espino ואח ' הרחיב את השימוש FPOP לחקור מבנה חלבון בתאים חיים, שיטה הנקראת FPOP בתא (IC-FPOP)⁸. בניגוד למחקרים בעלי מבחנה, לימוד חלבונים בתאים לצורך הצפיפות המולקולארית יחד עם אינטראקציות חלבונים שונות העלולות להשפיע על המבנה. בנוסף, הוא מציג את היתרון של מתן תמונה של הפרוטדום מלא הפוטנציאל לספק מידע מבניים של מערכות רבות בבת אחת כדי לבצע פרוטדום ביולוגיה מבנית רחב. יתר על כן, טכניקה זו היא אידיאלית עבור חלבונים שקשה ללמוד מבחנה, כמו חלבונים ממברנה.

מחקרים ראשוניים של IC-FPOP בהצלחה בוחן 105 חלבונים החל שפע חלבון ולוקליזציה הסלולר. כדי לשפר את שיטת ה-IC-FPOP, רינאס ואח ' פיתח מערכת מיקרוזרימה להזרמת תאים בודדת⁹. שיפור מערכת הזרימה המקורית מגביל את צבירת התאים ומגדיל את ה-H_{2O הזמין עבור} הקרנה. במערכת הזרימה הראשונית, התאים המקרקהים בצינורות סיליקה הביאו כפכפים והקרנה לא אחידה. שילוב של שני זרמים של מאגר נדן הידרודינמי מתמקד בתאים, ומאפשר להם לזרום בנפרד מעבר ללייזר. התאגדות של מזרק נפרד עבור H₂O₂ מאפשר מבוקרת יותר ממוטב החשיפה זמן המאפשר גבוה יותר h₂או₂ ריכוזים ללא תופעות לוואי. גם, הגבלת זמן הדגירה מגביל את התמוטטות של H₂O₂ על ידי הקטלני הקטאז. על ידי שילוב זה מערכת הזרימה החדשה, מספר מזוהה של חלבונים עם שינוי FPOP גדל 13-קיפול, ובכך להרחיב את היכולות של שיטה זו כדי לחקור שפע של חלבונים בתאי החיים. בפרוטוקול זה ניסוי IC-FPOP כללי מתואר בהתמקדות על ההרכבה של מערכת הזרימה IC-FPOP.

Protocol

1. הגדרת מערכת זרימה IC-FPOP

1. כדי להתחיל את ההרכבה של מערכת הזרימה, חותכים את סיליקה התמזגו באמצעות אבן מחשוף לגודל. מערכת הזרימה IC-fpop דורש 4 12 ס"מ ו 1 17 התמזגו סיליקה ס"מ עם קוטר פנימי (ID) של 450 יקרומטר ו בקוטר החיצוני (OD) של 670 יקרומטר, 2 24 ס"מ ו-10 ס מ עם מזהה של 1 40 יקרומטר ו-OD של 75 יקרומטר , ולבסוף 2 57 ס מ עם מזהה של 150 יקרומטר ו-OD של 360 יקרומטר.
   הערה: כאשר חותכים את צינור סיליקה, לגרד בעדינות את ציפוי פוליאימיד ולהתכופף כדי לקבל את החתך הנקי. בדוק כדי לוודא שהוא חתוך ישר (זה הכרחי כדי להבטיח לא מחסומים או בטופס הדלפות).
2. הגדרת 15 התקשרויות באמצעות שרוולים בעלי הדוקה (0.0155 "id x 1/16" od עבור 360 יקרומטר od סיליקה אבובים ו0.027 "id x 1/16" od עבור ב670 יקרומטר ה-סיליקה הצינורות) עם הצצה באגוז סופר ללא מקום התחתון שטוח עבור 1/4-28 "od ו-super מהיר ferang, הטבעת, tefzel (etfe), 1/4-28 שטוח למטה, עבור 1/16" OD. בניית חיבורים לפי פרוטוקול היצרן (איור 1).
3. מקום 6 מגנטים גליליים קטנים ב 1 500 μL מזרק. למלא את המזרק יחד עם עוד 500 μL מזרק ושני 5 מ ל מזרקים עם מאגר ולהסיר אוויר. מיקום על משאבת המזרק כפי שמוצג על איור 2א.
   הערה: 5 מזרקים mL גדולים יותר מאשר 500 μL מזרקים, כך מרווח נדרש כדי להדק את כל הזרקים בו זמנית במקום (איור 2B).
4. להדק משאבת המשאבה בפקק כך מזרק התא יש בערך 50 μL עזב כאשר המנוע דוכנים. . זה ישאיר מקום לרודרים מגנטיים (איור 2C-D).
   התראה: אם משאבת המזרק מפעילה לחץ על המגנטים, הם יג'אם את המזרק ועלולים לגרום למזרק להישבר.
5. באמצעות מתאם Luer, חבר שסתום ידני לכל מזרק. להרכיב את צינור סיליקה כפי שמוצג באיור 3.
   הערה: הפתיל קו עם התאים + H₂O₂ כל הדרך דרך הצלב לצד השני. ואז להכניס אותו לתוך צינורות סיליקה 450 יקרומטר ID. הנדן מאגר במזרק 5 מ ל יזרום בקצב מהיר יותר מאשר התאים H₂O₂. עם מאגרי המעטפת משני הצדדים, התאים יהיו ממוקדים בצורה בודדת להקרנה.
6. מיקום מערכת זרימה ליד לייזר. באמצעות מצית, לשרוף את ציפוי סיליקה על צינורות 450 יקרומטר מזהה כדי ליצור חלון עבור הקרנה לייזר.
7. מניחים שהוא מערבב מגנטי מעל מזרק התא המכיל את ששת המגנטים.
8. הגדר משאבת מזרק ל 492.4 μL/min עבור קצב הזרימה הסופי של 1,083.3 μL/min. מאגר זרימה דרך המערכת שלוש פעמים כדי לרוקן את המערכת ולבדוק את כל הדליפות.
9. למקד את לייזר excimer על אבובים סיליקה באמצעות עדשה קמורה. לאחר ההתמקדות, בדוק את חלון ההקרנה על ידי הצבת פיסת נייר קטנה מאחורי אבובים סיליקה ולהפעיל את הלייזר. למדוד את האזור נשרף מן ההקרנה. חשב את תדר הלייזר הדרוש באמצעות חלון ההקרנה וקצב הזרימה כדי לקבל חלק הדרה של אפס.
   הערה: אנרגיית הלייזר המומלצת לניסוי IC-FPOP היא ≥ 120 mJ. כדי לקבל חלק הדרה של 0 עם חלון הקרנה של 2.58 מ"מ ושיעור זרימה של 1083.3 μL/min, התדר צריך להיות 44. להלן המשוואות הדרושות לחישוב תדר הלייזר אם חלון ההקרנה, קצב הזרימה ושבר ההדרה ידועים.
   
   כאשר w הוא אמצעי האחסון nL, x הוא רוחב ספוט לייזר ב mm, y הוא מזהה אבובים של סיליקה ב-μm, v הוא הנפח הכולל μL, b הוא שבר הדרה, a הוא קצב הזרימה ב-μL/min, ו-f הוא התדר ב-Hz.

2. לעשות כיבוי ו-H₂O₂

1. לעשות כיבוי המכיל 100 mM N-tert-בוטיל-אלפא-פנילטין (PBN) ו 100 mM N, N'-diמתילתיואוראה (DMTU). מחלק 11 מ ל של כיבוי עבור כל מדגם לתוך שפופרת חרוט 50 mL.
2. לדלל H₂O₂ כדי 200 מ"מ. כל דוגמה מחייבת 500 μL של H₂O₂.
   הערה: ניתן לעשות את היום שלפני ולאגור ב -4 ° c בלילה, מוגן מפני אור. 2_O2₂ יש לעשות טרי ביום של ניסויים.

3. לאסוף תאים

1. לגדול תאים בבקבוקון T175 על 70-90% שליטה.
2. הסר מדיה ושטוף עם מאגר.
   הערה: מאגרים טיפוסיים לשימוש הם תרבות תא כיתה מלוחים באגירה של דולקקו פוספט (DPBS) או תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS).
3. ניתוק תאים באמצעות טריפסין-EDTA או במגרד.
4. מנותקת פעם מחדש ב 10 מ ל של מאגר ולספור את התאים.
5. ספין למטה, להסיר את מאגר טריפסין-EDTA, ולהשעות מחדש לעשות 2 x 10⁶ תאים/mL.
6. Aliquot 500 μL של התאים לכל מדגם.
   הערה: עבור כל תנאי, לבצע לפחות 3 דגימות לייזר, ו 3 אין שולטת לייזר.

4. ביצוע IC-FPOP

1. למלא את שני 5 מזרקים mL עם מאגר, מזרק 500 μL המכיל את מגנטים עם התאים, ואת הסופי 500 μL מזרק עם H₂O₂. . תדליק את הטירר המגנטי
2. ספייק ב 220 μl של diמתיל סולפוקסיד (dmso) לאחד סדרת מחלקים של כיבוי, בעדינות לערבב, ומקום מאחורי מערכת הזרימה כדי לאסוף דגימות הקרינה. תוספת של DMSO יהיה לעכב מתיונין אנדוגניים סולפוקסיד רדוקטאז.
3. הפעל לייזר, המתן 7 s ולאחר מכן הפעל את מערכת הזרימה.
4. לאחר סיום המדגם זורם, לכבות את הלייזר, ולערבב בעדינות את הכיבוי עם המדגם שנאסף. מניחים את זה בצד במהלך השלבים 4.5 ו 4.6.
5. למלא את כל ארבעת מזרקים עם המאגר התאים מושעה ולזרום אותו דרך מערכת הזרימה.
6. לאחר שהמערכת מסתיימת בשטיפה, חזור על שלבים 4.1 ו-4.2. הפעל את הזרימה ללא הקרנה. זהו לא שליטה לייזר לחשבון על חמצון הרקע בתאים.
7. בעוד המדגם הבא פועל, ספין למטה את המדגם הקודם ב 450-800 x g עבור 5 דקות, להסיר את הממס, ולהשעות מחדש ב 100 μl של מאגר פירוק התא כמו radioimmunoprecipitation מאגר (ריפה).
8. העבר את הדגימה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה והקפא הבזק בחנקן נוזלי.
9. כאשר כל הדגימות סיימו לפעול, פרק את מערכת הזרימה לניקוי. להיפטר אבובים סיליקה השתמשו ולנקות את כל החיבורים האחרים על ידי sonicating עבור 1 h ב 50% מים: 50% מתנול. נקה את הזרקים לפי הוראות היצרן.

5. תקציר

1. . מעכל את כל התאים התחילו בהתדלחם הדגימות והחום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
2. לאחר החימום, לצנן את הליפוסט על הקרח עבור 15 דקות.
3. הוסף 25 יחידות של נוקלאז כדי לעכל DNA ו-RNA ו-דגירה בחדר ממוזג עבור 15 דקות.
4. דגימות ספין באמצעות צנטריפוגה העליון הטבלה ב 16,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
5. לאסוף את סופרנטנט ולהעביר אותו צינור מיקרוצנטריפוגה נקי.
6. בדוק את ריכוז החלבון בעזרת ערכת שיטת החלבונים.
7. העברת 20-100 μg של דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי ולהביא 100 μL.
8. להפחית דגימות עם 20 מ"מ dithio, (DTT) ב 50 ° c עבור 45 דקות.
9. לצנן את הדגימות בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
10. בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. מוגן מפני אור
11. הוסף אצטון טרום מקורר בחלבון 1:4 היחס: אצטון. לערבב דגימות ולמקם ב-20 ° c בלילה.
12. למחרת בבוקר, לסובב דגימות ב 16,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
13. הסר את הסופרנטאנט והוסף 50 μL של 90% אצטון מקורר. מערבבים דגימות ו למטה ב 16,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
14. להסיר אצטון ולתת דגימות יבש על ידי השארת כובעים של המיקרוצנטריפוגה לפתוח עם מחיקה חינם של מוך מכסה את החלק העליון. לאחר הדגימות התייבשו, השהה מחדש את הגלולה חלבון עם 10 מ"מ מאגר טריס pH 8.
15. השעיה מחדש 20 μg של טריפסין ב 40 μL של 10 מ"מ מאגר טריס pH 8. הוסף 2 μg של טריפסין (מסה: יחס המונים של טריפסין 1:50 מדגם). מודטה דגימות ב 37 ° c ללילה.
16. בבוקר שלמחרת בודקים את הריכוז הפפטיד בעזרת שיטת מבחן פפטיד. לאחר שהדוגמא הוסרה לצורך הבחינה הפפטיד, כיבוי הטריפסין של העיכול על ידי הוספת חומצה פורמית לדגימות (הריכוז הסופי הוא 5% חומצה פורמית).
17. לאחר ריכוז פפטיד הסופי נקבע, להעביר 10 μg של כל דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. פעולה זו מבטיחה שאותה כמות של כל דגימה תהיה מנותח. יבש את המדגם באמצעות צנטריפוגה ואקום. פעם אחת מיובש מחדש עם 20 μl של המסה ספקטרומטריה כיתה 0.1% החומצה פורמית. העבר דגימות לבקבוקונים באמצעות דוגם אוטומטי.

6. כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריה מאסיבית

1. כדי להתאים שינויים FPOP לנתח את התא מתעכל ליפוסט באמצעות ניתוח LC-MS/MS.
2. השתמש בשלבים ניידים של 0.1% החומצה פורמית במים (A) ו 0.1% החומצה פורמית ב acetonitrile (ב).
3. טען 0.5 μg של דגימה אל 180 יקרומטר x 20 מ"מ סי18 (5 יקרומטר ו-100 Å) השמנה עמודה ולשטוף מדגם עם 99% (a) ו-1% (ב) עבור 15 דקות.
4. באמצעות 75 יקרומטר x 30 ס"מ סי18 (5 יקרומטר ו 125 Å) טור אנליטי, להפעיל את שיטת ההפרדה האנליטית עם קצב הזרימה של 0.300 μl/min החל ב 3% (ב) עבור דקה אחת ולאחר מכן כבש 10% (ב) מ 1-2 min. הרמפה הבאה ל 45% (ב) מ 2-100 דקות מכן 100% (ב) מ 100-110 min. לנקות את העמודה על ידי החזקת 100% (ב) מ-110-115 min. מחדש את העמודה על-ידי המשך 3% (ב) מ 115-116 דקות ולהחזיק ב -3% (ב) מתוך 116-130 דקות.
5. הגדר את שיטת הרכישה MS כדי לקבל רזולוציה של 60,000 עם טווח סריקה m/z של 375-1500. הגדר את בקרת הרווח האוטומטי (AGC) היעד כדי 5.0 x 10⁵ עם זמן הזרקה מקסימלית של 50 ms.
6. במהלך הרכישה MS, בחר את היונים המקודמות עם מדינות החיוב 2-6 עבור בידוד באמצעות רכישה תלויה נתונים (דה) עם חלון בידוד של 1.2 m/z וזמן מחזור של 4 s. בחר את הפפטידים עם סף עוצמה של 5.0 x 10⁴ עבור hcd הפעלה עם אנרגיה מנורמלת מוגדר 32%. להוציא את פפטידים לאחר 1 MS/MS הרכישה עבור 60 s. הגדר את הרזולוציה MS/MS ל 15,000 עם יעד AGC של 5.0 x 10⁴ ו זמן הזרקה מקסימלית של 35 MS.

7. עיבוד נתונים

1. חפש בקובצי ה-RAW על תוכנת ניתוח חלבון זמינה כנגד מסד נתונים של חלבונים רלוונטיים ואנזים התקציר הרלוונטי. כאן, השתמשו במאגר המידע של האדם השוויצרי-פרוט ובטריפסין.
2. הגדר את מסה הקודמן כדי לחפש בין 350 עד 5,000 Da ו עמידות המונית של 10 עמודים לדקה. יכול להיות לכל היותר 1 מחשוף האתר החמיץ עם אורך פפטיד בין 6 כדי 144 שאריות. מגבלות אלה מקלות על חיפוש במסד נתונים.
3. הגדר את יוני הקטע עמידות מסה מקסימלית ל 0.02 Da עם carbamidomethyl (+ 57.021) כשינוי סטטי וכל שינויי FPOP מ -17 חומצות אמינו כשינוי דינאמי (איור 4 היא דוגמה לזרימת העבודה של ניתוח החלבון המשמשת לזיהוי שינויי fpop).
   הערה: שינויים FPOP על סרין וטראונין אינם כלולים בחיפוש עקב הפעילות החוזרת התחתונה שלהם עם רדיקלים הידרוקסיל.
4. חפש עם מסד נתונים דמה עם שיעור גילוי שווא של 1% ו-5%.
5. לאחר הקבצים מסתיים החיפוש לחשב את מידת השינוי FPOP. פתח פרוטדום גלה 2.2, רצף ייצוא, מיקומי שינוי, הצטרפות חלבון, קובץ ספקטרום, השפע מקודמן, ואת זמן השמירה מידע. חישוב היקף השינוי מהמשוואה 4:
   
   אזור EIC שונה הוא אזור כרומטוגרפי של פפטיד ספציפי עם שינוי רדיקלי הידרוקסיל. אזור EIC הוא האזור הכולל כרומטוגרפי של אזורים ששונו ולא השתנו של הפפטיד הספציפי. מידת החמצון מחושבת בדגימות עם ובלי הקרנה. המדגם נמנע הקרנה (שליטה) חשבונות עבור כל חמצון הרקע שהיה יכול להיות נוכח בתאים לפני ואחרי H₂O₂ חשיפה. הפקדים מופחתים מדגימות ההקרנה כדי לסייע בבידוד של שינויים ספציפיים של FPOP.

תוצאות

IC-FPOP היא שיטת הדפסת רגליים לחקור אינטראקציות חלבונים בתאים חיים. במערכת הזרימה IC-FPOP, הזמן חשיפה H₂o₂ מוגבל בערך 3 s, אחריות גבוהה יותר h₂o_{2 ריכוזי ללא} השלכות מזיקות עבור התאים. מערכת הזרימה משלבת גם שני זרמים של חיץ מעטפת, אשר הידרודינמי מתמקד את התאים למרכז אבובים לייצר זרימה אחת של תאים להיות לקרינה אחידה (איור 5)⁹. הדמיה פלואורסצנטית של מוערמים YZ תמונות מוערמות (איור 5A) להראות הפרדה ברורה של מאגר נדן (המכיל fluorc fluorophore) מן הפתרון התא (המכיל את tmrm פלואורואופפור). כדי להדגיש הפרדה זו, איור 5B ואיור 5C הצג מפות חום ממוצעות תלת ממדיות של התמיסה או פתרון התאים של המעטפת, הממחישות ערבוב מינימלי של שני הפתרונות.

השימוש במערכת זרימת התא הבודדת מגדיל את מספר החלבונים הoxidatively ששונו על-ידי 13מתקפל(איור 6א)⁹. בשיטה זו, חלבונים ברבים של התאים הסלולריים מסומנים עם חלבונים ממברנה, חלבונים cytoplasmic, וחלבונים בתוך הגרעין להיות הנפוצים ביותר^8,9. כדי להבטיח חלבונים שונו בתוך תאים שלמים, תמונות פלורסנט של תאים מטופלים CellROX נערכו בעקבות H₂O₂ טיפול הקרנה (איור 6ב)⁸. היציבות של התאים במהלך תהליך תיוג עוד מאשרת את היעילות של IC-FPOP לחקור חלבונים בסביבה הסלולר הילידים שלהם. שינויים אלה יכולים להיות מותאמים לחומצות אמינו מסוימות על חלבון. איור 7 מייצג שינוי המתרחשים במהלך IC-fpop יחד עם הופק כרומאטוגרם יון שלה. המשמרת שנצפתה ב כרומוטוגרמה המחולצים מתרגמת את השינוי בהידרופוטטין הנגרמת על ידי מתיונין מתחמוצת החיידקים ב פפטיד שונה.

כדי לבדוק אם השינויים fpop הגישה הממס בתוך התאים, בתוך התא המסומן אקטין הושווה הן במחקר הדפסה מחוץ לגוף ומבנים גבישים שונים של אקטין (איור 8)⁸. אקטין בתוך התא מיוצג באיור 8A מראה רחבות המקבילה של חמצון מתוך מחקר מתורבת על ידי גואן ואח '¹⁰ (איור 8B), המסכם אקטין יש נגישות הממס דומה הן בתאי והן במחקרים מבחנה. לאישור נוסף IC-fpop היה בודק את הנגישות הממס של אקטין, היקף שינויי fpop הושוו הנגישות ממס של שאריות בעלי תווית מחושב שני מבנים קריסטל אקטין (איור 8ג). מתאם זה ממחיש כי IC-FPOP בוחן את הנגישות הממס של חלבון monomeric היטב.

איור 1: כיצד לבנות כיאות כראוי. (א) המקום ferrules, סיליקה אבובים, שרוול יחד לפני הידוק. (ב) הדקו את כל הרכיבים יחד. (ג) המוצר הסופי יפיק פרריר כי כבר התהדקו על השרוול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הגדרת מערכת זרימה IC-FPOP. (A) תמונה של מערכת זרימה IC-fpop התאספו במלואו הממוקמים ליד הלייזר. (ב) דוגמה של רווח צורך להגדיל את הקוטר החיצוני של 500 μl מזרקים כדי להדק בהצלחה את כל הזרקים ביחד. (ג) תמונות מייצגות המציגות את השטח הנדרש עבור הרידרים המגנטיים. (ד) הפקקים נחוצים כדי לעכב את משאבת המזרק מבלי לשבור את הזרקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סכמטית של מערכת הזרימה שפותחה עבור IC-FPOP. קווים כחולים מייצגים צינורות סיליקה עם 450 יקרומטר מזהה ו 670 יקרומטר od, קווים אדומים יש 150 יקרומטר מזהה ו 360 יקרומטר od, וקווים כתומים יש מזהה ב75 יקרומטר ו-360 יקרומטר od. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תוכנת ניתוח חלבונים המשמשת לזיהוי שינויי FPOP. זרימת עבודה טיפוסית עם השינויים המתאימים שחיפשו בכל צומת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מערכת זרימה תא בודדת הידרודינמית מתמקדת התאים לתוך זרם אחד. (A) אורתוגלוונלית yz מחסנית הממחישות 3d מיקוד של האנליטה הסלולר (אדום, tmrm fluorophore) מוקפת מאגר הנדן (ירוק, fitopפפור). ממוצע תלת מימדי של חום בעוצמה ממוצעת של מאגר המעטפת (ב) ו-מכשירים סלולריים (C). עוצמות נמוכות הן כחולות וגבוהות ביותר הן אדומות (B-C). דמות זו שונתה מרינאס ואח '⁹נא ללחוץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ניצול של מערכת זרימה IC-FPOP באופן דרסטי מגדילה את fpop חלבונים ששונו בתאי צריכת. (א) השוואה של חלבונים המזוהים עם ובלי מערכת הזרימה. מערכת הזרימה זיהה 1391 FPOP שונה חלבונים בעוד רק 105 חלבונים זוהו ללא מערכת זרימה עם חפיפה של 58 שונה חלבונים. דמות זו שונתה מ Rinas ואח '⁹ (ב) הדמיה פלואורסצנטית של cellrox מטופלים תאים לאחר IC-fpop הצג את התאים עדיין שלמים לאחר תיוג חמצוני. התאים הופלו באמצעות מיקרוסקופ מרובה מולטיפוטון FV1000 MPE ב-665 ננומטר. תמונה המוצגת היא פרוסה בודדת. איור זה השתנה מ-Espino et al^.8אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: דוגמאות של ספקטרום ms/ms לטנדם המתרחשים במהלך IC-FPOP. מוצר-יון (MS/MS) ספקטרום של (א) פפטיד לא שונו, ו (ב) חמצון זוהה על שאריות M8 נמצא על זה פפטיד. מייצג EIC של (ג) שונה פפטיד ו (ד) פפטיד משתנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: IC-FPOP יעיל בחיטוט הנגישות ממס של חלבונים. (A) היקף השינוי עבור 9 פפטידים oxidatively שונה מ actin. הערכים מוצגים כממוצעים ובתוספת סטיית תקן מינוס (n = 3). (ב) שינוי של פפטידים אקטין תחמוצת בחוץ גופית על ידי סינכרוטרון radiolysis מ גואן ואח '¹⁰ (ג) קורלציה של שאריות fpop שינויים עם סאסא הדוק (משולשים, קו מגמה מקווקו) ופתוח (עיגולים, קו מגמה מוצק) מצבי אקטין. איור זה השתנה מ-Espino et al^.8אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שיטות מבוססות מספר ספקטרומטר המסה פותחו כדי לחקור את מבנה החלבון ואת החלבון-ligand מתחמי באופן פרוטדום-רחב בתאים שלמים או ליסביטים תא. טכניקות אלה כוללות אך אינם מוגבלים ביציבות של חלבונים משיעור של חמצון (SPROX), פרופיל פרוטדום תרמי (TPP), החוצה קישורים כימיים (XL-MS), ו-הידרוקסיל חלבון רדיקלי מfootprinting דפסה (HRPF). כל טכניקה יש מגבלות ייחודיות ויתרונות לעומת אחד את השני, אשר נבדקו בהרחבה¹². כל אחת מהשיטות הללו שימשו לביולוגיה מבנית רחבה כדי להבהיר מבנה חלבונים ולתפקד בסופו של דבר בתוך הסביבה התאית המורכבת. IC-FPOP היא טכניקה HRPF המנצלת רדיקלים הידרוקסיל כדי oxidatively לשנות את הממס שרשראות בצד של חומצות אמינו, מבנה חלבון בודק חלבון-ligand אינטראקציות בתוך תאים קיימא¹³. IC-FPOP הוא שיפור HRPF הראשונית בתאים חיים שהשתמשו בכימיה פנטון ליצור רדיקלים על ציר הזמן של הדקות¹⁴. במחקר זה, שינויים מבניים בחלבון ממברנה אינטגרלי בתגובה הפחתת כוח pH או יוניים של המאגר התאפיין בהצלחה עם כיסוי חמצון טוב על פני החלבון. לעומת פנטון כימיה, IC-fpop הוא הרבה יותר מהר, שינוי חלבונים על ציר הזמן יליונית, ובכך מאפשר היווצרות חלבון יליד ללמוד.

מבחן מפתח עבור IC-FPOP היא לאשר את הכדאיות של התאים לאחר החשיפה H₂O₂. שימוש קו ערבוב 40 ס מ, התאים מודבטים ב H₂O₂ עבור בערך 3 s לפני הקרנה. הפעם ניתן לכוונן על ידי שינוי אורך של אבובים זה סיליקה. ראוי לציין כי למרות השימוש טרילאן כחול כדי לבדוק את הכדאיות התא מראה את היושרה של התאים מתמשכת בעקבות H₂O₂ דגירה, התאים יכול להיות פוטנציאלי תחת לחץ מטפל מסלולים איתות כי אינטראקציה עם H₂O₂. למרבה המזל, זמן הדגירה הקצר הוא מהיר יותר מאשר סינתזה חלבון מתן אמון החלבונים הנוכחי אינם המושרה על ידי H₂O₂.

הצעד החשוב הבא הוא לאשר הרכבה נכונה של מערכת הזרימה. לאחר ההרכבה, להבטיח שאין דליפות נוכח לאחר שריקון המערכת עם המאגר הרצוי. אם הדליפות נמצאות, לוודא כי צינורות סיליקה נחתך כראוי הוא הריקון נגד חזיות לעשות חותם מתאים פעם אחת למטה. כל החלקים התהדקו בידי, כך שאין צורך בכלים. במהלך כל ניסוי IC-FPOP, ודא כי הנימרים המגנטיים במזרק התאים נשארים בתנועה. עצבנות קטנה זו מגבילה את מספר התאים הנמצאים בתחתית המזרק אך אינה קשה מספיק כדי להטות את התאים. לאחר ריצה אחת, יש בערך 50 μL של תאים שנותרו במזרק. הקפד תמיד לדלל את זה עם צעד שטיפה כדי להגביל את מספר התאים המעבירים לניסוי הבא. מומלץ להשתמש במזרק תאים טריים אם משווים טיפולי תאים מרובים. חשוב גם לבחור מאגר מתאים עבור התאים הנבדקים. כמה מאגרים להרוות את הרדיקלי הידרוקסיל המוביל פחות שינויים על חלבונים. שו ואח ' הראו כי כמה מאגרים בשימוש נפוץ להפחית את החיים הרדיקלי הידרוקסיל¹¹. DPBS ו-HBSS הם מאגרים נפוצים המשמשים ניסויים IC-FPOP.

לאחר IC-FPOP, למטב את פרוטוקול העיכול בהתבסס על הפרמטרים הדרושים. מאז FPOP מייצרת שינויים בלתי הפיכה בלתי הפיך, יש זמן רב זמין לעיכול יסודי וניקוי מבלי לאבד את הכיסוי תיוג. תמיד לבדוק ולנרמל את ריכוז החלבון כך ריכוזי פפטיד אחיד טעונים עבור ספקטרומטריה המסה טנדם. לבסוף, יש להיות מודעים לכך שimmunoprecipitation לא ניתן לבצע בשיתוף עם IC-FPOP. אם שינוי FPOP מכוון את אזור האינטראקציה, הזיקה של הנוגדן מונמכת. כדי לסייע להגדיל את הזיהוי של שינויים FPOP, 2D-כרומאטוגרפי שלבי הפרדה הראו יותר מאשר משולש את מספר פפטידים תחמוצת זיהה¹⁵.

אתגר של כל ניסוי FPOP הוא רמה מסובכת של ניתוח נתונים בשל מוצרי חמצון אפשרי שיכולים להתעורר. הדבר נכון הן בתוך התא והן בתוך מבחנה, אך מוגברת באופן דרסטי עם המורכבות הנוספת של ניתוח ליסיטים של תאים. עם אופטימיזציה נוספת של IC-fpop יותר חלבונים עם כיסויים שינוי גבוה יותר נובעים, ובכך מהיר ניתוח ביצוע מפרך יותר. כמות ההטיה של נתונים שנוצרת מניסוי IC-FPOP יחיד מגבילה את השימוש באימות ידני הגורם לחוקרים להסתמך על תוכנות רבות יותר. בשל כך, Rinas ואח ' פיתחה אסטרטגיית קוונט עבור HRPF באמצעות פרוטאום גלה (PD)¹⁶. שיטה זו משתמשת בזרימת עבודה של צומת מרובה חיפוש ב-PD בשילוב עם פלטפורמה כמותית בגיליון אלקטרוני. שיפורים נוספים על פלטפורמת IC-FPOP בעיצומן כדי להגדיל את מספר פפטידים מזוהה עם שינויים FPOP יחד עם מוגבר מוגברת ודיוק כימות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A	any brand is sufficient
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock	SGE Analytical Science	008760
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22	any brand is sufficient
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models	Fisher Scientific	SG-00723
Acetone, HPLC Grade	Fisher Scientific	A929-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg	Waters	186007496
ACQUITY UPLC M-Class System	Waters	ACQUITY UPLC M-Class System
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100	any brand is sufficient
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material	Phenomenex	04A-4299
Centrifuge	Eppendorf	022625501
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
Dithiothreiotol (DTT)	AmericanBio	AB00490-00005
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
EX350 excimer laser	GAM Laser	EX350 excimer laser
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID	IDEX Health & Science	1548L
Formic Acid, LC/MS Grade	Fisher Scientific	A117-50
HV3-2 VALVE	Hamilton	86728
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H325-100	any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Iodoacetamide (IAA)	ACROS Organics	122270050
Legato 210 syringe pump	KD Scientific	788212	Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene	IDEX Health & Science	P-618L
Methanol, LC/MS Grade	Fisher Scientific	A454SK-4	4 L quantity is not necessary
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002436
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU)	ACROS Organics	116891000
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6"	IDEX Health & Science	F-242X
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6"	IDEX Health & Science	F-246
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN)	ACROS Organics	177350250
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
PE50-C pyroelectric energy meter	Ophir Optronics	7Z02936
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Scientific	23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	A53225
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Scientific	90058
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis	Fisher Scientific	88702
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32"	Molex	1068680064	any capillary tubing cutter is sufficient
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350	Polymicro Technologies	1068150024
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670	Polymicro Technologies	1068150025
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375	Polymicro Technologies	1068150019
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P382-500
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software)	Thermo Scientific	OPTON-30799
Rotary Magnetic Tumble Stirrer	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3-4
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD	IDEX Health & Science	P-259X
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD	IDEX Health & Science	P-255X
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick	V&P Scientific, Inc.	VP 722F
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Fisher Scientific	PI89900
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK	Fisher Scientific	05-700-182
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK	Fisher Scientific	05-700-178
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses	THORLABS	LA4052
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000	V&P Scientific, Inc.	VP724F
VHP MicroTight Union for 360µm OD	IDEX Health & Science	UH-436
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS118-500
Water, LC/MS Grade	Fisher Scientific	W6-4