Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

Resumo

Aqui, caracterizamos a estrutura proteica e os locais de interação em células vivas usando uma técnica de pegada proteica denominada oxidação fotoquímica rápida de proteínas (IC-FPOP).

Resumo

A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é um método de pegada de proteína radical hidroxil usado para caracterizar a estrutura e interações proteicas. FPOP usa um laser excimer de 248 nm para fotolyze peróxido de hidrogênio produzindo radicais hidroxilos. Estes radicais modificam oxidativamente cadeias laterais expostas de 19 dos 20 aminoácidos. Recentemente, esse método tem sido utilizado em células vivas (IC-FPOP) para estudar interações proteicas em seu ambiente nativo. O estudo de proteínas nas células explica a aglomeração intermolecular e várias interações proteicas que são interrompidas para estudos in vitro. Um sistema de fluxo de células unicelular personalizado foi projetado para reduzir a agregação celular e entupimento durante o IC-FPOP. Este sistema de fluxo concentra as células além do laser excimer individualmente, garantindo assim uma irradiação consistente. Comparando a extensão da oxidação produzida do FPOP com a acessibilidade solvente da proteína calculada a partir de uma estrutura cristalina, o IC-FPOP pode sondar com precisão as cadeias laterais acessíveis de proteínas.

Introdução

A pegada de proteína radical hidroxil (HRPF) é um método que sonda a acessibilidade solvente de uma proteína através de modificações covalentes produzidas a partir de radicais hidroxilos. Quando a estrutura proteica ou as interações proteicas mudam, ela alterará a exposição ao solvente de aminoácidos, alterando assim a extensão da modificação dos resíduos. Com o HRPF, as interações proteicas^1,2,,3 e as alterações conformacionais proteicas^4,5,6 foram interrogadas com sucesso in vitro. Existem vários métodos que geram radicais hidroxilos para experimentos de HRPF, sendo um deles a oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP). FPOP foi desenvolvido pela Hambly e Gross em 2005 e utiliza um laser excimer de 248 nm para produzir radicais hidroxilos através da fotolíse do peróxido de hidrogênio (H₂O₂)⁷.

Recentemente, Espino et al. estenderam o uso do FPOP para sondar a estrutura proteica em células vivas, um método denominado FPOP in-cell (IC-FPOP)⁸. Em contraste com estudos in vitro, estudar proteínas em células explica a aglomeração molecular, juntamente com várias interações proteicas que poderiam potencialmente influenciar a estrutura. Além disso, apresenta a vantagem de fornecer um instantâneo do proteome completo potencialmente fornecendo informações estruturais de inúmeros sistemas ao mesmo tempo para realizar a biologia estrutural ampla do proteome. Além disso, essa técnica é ideal para proteínas difíceis de estudar in vitro, como proteínas de membrana.

Estudos iniciais do IC-FPOP sondaram com sucesso 105 proteínas que variam em abundância de proteínas e localização celular. Para melhorar o método IC-FPOP, Rinas et al. desenvolveram um sistema de microfluxo para o fluxo de células^{únicas 9}. O aprimoramento do sistema de fluxo original limita a agregação celular e aumenta o H₂O₂ disponível disponível para irradiação. No sistema de fluxo inicial, as células que se aglomeravam na tubulação de sílica resultaram em tamancos e irradiação irregular. A incorporação de dois fluxos de um tampão de bainha concentra hidrodinamicamente as células, permitindo que elas fluam individualmente através do laser. A incorporação de uma seringa separada para o H₂O₂ permite um tempo de exposição mais controlado e otimizado, permitindo concentrações mais altas de H₂O₂ sem efeitos adversos. Além disso, limitar o tempo de incubação limita a quebra de H₂O₂ por catalase endógena. Ao incorporar este novo sistema de fluxo, o número detectado de proteínas com uma modificação FPOP aumentou 13 vezes, expandindo assim as capacidades deste método para sondar uma infinidade de proteínas em células vivas. Neste protocolo, um experimento geral do IC-FPOP é descrito com foco na montagem do sistema de fluxo IC-FPOP.

Protocolo

1. Configurar o sistema de fluxo IC-FPOP

1. Para iniciar a montagem do sistema de fluxo, corte a sílica fundida usando uma pedra de decote para o tamanho. O sistema de fluxo IC-FPOP requer quatro sílicafundidas de 12 cm e uma de 17 cm com diâmetro interno (ID) de 450 μm e diâmetro externo (OD) de 670 μm, dois de 24 cm e um de 40 cm com um ID de 75 μm e um OD de 360 μm , e finalmente dois 57 cm com um ID de 150 μm e um OD de 360 μm.
   NOTA: Ao cortar o tubo de sílica, raspe suavemente o revestimento de poliimida e dobre para obter o corte mais limpo. Verifique se é um corte reto (isso é necessário para garantir que não haja bloqueios ou vazamentos).
2. Configure 15 conexões usando mangas nano-apertadas (0,0155" ID X 1/16" OD para tubos de sílica OD de 360 μm e 0,027" ID X 1/16" OD para o 670 tubo de sílica oD μm) com porca super flangeless PEEK 1/4-28 flat-bottom para 1/16" OD e super flangeless ferrule c/SST ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 flat-bottom, para 1/16" OD. Construir conexões de acordo com o protocolo do fabricante (Figura 1).
3. Coloque 6 pequenos ímãs cilíndricos em uma seringa de 500 μL. Encha esta seringa junto com outra seringa de 500 μL e duas seringas de 5 mL com tampão e remova o ar. Posição na bomba de seringa conforme mostrado na Figura 2A.
   NOTA: As seringas de 5 mL são maiores que as seringas de 500 μL, de modo que é necessário um espaçador para apertar todas as seringas simultaneamente no lugar (Figura 2B).
4. Aperte a rolha da bomba de seringa para que a seringa celular tenha cerca de 50 μL esquerda quando o motor parar. Isso vai deixar espaço para os agitadores magnéticos. (Figura 2C-D).
   ATENÇÃO: Se a bomba de seringa colocar pressão sobre os ímãs, eles vão emperrar a seringa e podem fazer com que a seringa quebre.
5. Usando um adaptador Luer, conecte uma válvula manual a cada seringa. Montar o tubo de sílica como mostrado na Figura 3.
   NOTA: Rosqueie a linha com as células + H₂O₂ todo o caminho através da cruz para o outro lado. Em seguida, insira-o na tubulação de sílica id de 450 μm. Os tampões de bainha na seringa de 5 mL estarão fluindo a uma taxa mais rápida do que as células e H₂O₂. Com os tampões de bainha em ambos os lados, as células serão hidrodinamicamente focadas em uma única linha de irradiação.
6. Posicione o sistema de fluxo ao lado do laser. Usando um isqueiro, queime o revestimento de sílica na tubulação de 450 μm de id para fazer uma janela para irradiação a laser.
7. Coloque um agitador magnético acima da seringa celular contendo os seis ímãs.
8. Coloque a bomba de seringa para 492,4 μL/min para uma taxa de fluxo final de 1.083,3 μL/min. Tampão de fluxo através do sistema três vezes para lavar o sistema e testar para quaisquer vazamentos.
9. Concentre o laser excimer no tubo de sílica usando uma lente convexa. Uma vez focado, teste a janela de irradiação colocando um pequeno pedaço de papel atrás do tubo de sílica e ligue o laser. Meça a região queimada pela irradiação. Calcule a freqüência de laser necessária usando a janela de irradiação e a taxa de fluxo para obter uma fração de exclusão de zero.
   NOTA: A energia laser recomendada para um experimento IC-FPOP é ≥120 mJ. Para obter uma fração de exclusão de 0 com uma janela de irradiação de 2,58 mm e uma taxa de fluxo de 1083,3 μL/min, a frequência precisa ser de 44. Abaixo estão as equações necessárias para calcular a freqüência do laser se a janela de irradiação, a taxa de fluxo e a fração de exclusão forem conhecidas.
   
   onde w é o volume em nL, x é a largura do ponto laser em mm, y é o ID de tubos de sílica em μm, v é o volume total em μL, b é a fração de exclusão, a é a taxa de fluxo em μL/min, e f é a freqüência em Hz.

2. Faça saciedade e H₂O₂

1. Faça a saciedade contendo 100 mM N-tert-Butyl-alfa-fenilnitrona (PBN) e 100 mM N,N'-dimetilthiourea (DMTU). Alíquota 11 mL de saciedade para cada amostra em um tubo cônico de 50 mL.
2. Diluir H₂O₂ a 200 mM. Cada amostra requer 500 μL de H₂O₂.
   NOTA: A saciedade pode ser feita no dia anterior e armazenada a 4 °C durante a noite, protegida da luz. H₂O₂ deve ser feito fresco no dia da experimentação.

3. Coletar células

1. Cultivar células em um frasco T175 para cerca de 70-90% de confluência.
2. Remova a mídia e enxágue com tampão.
   NOTA: Os buffers típicos a serem usados são a solução de soro tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) ou a solução de sal balanceado (HBSS) de Hank.
3. Desconecte células usando trypsin-EDTA ou com um raspador.
4. Uma vez destacado resuspender em 10 mL de buffer e contar as células.
5. Gire para baixo, remova o buffer e a tripsina-EDTA e resuspenda para fazer 2 x 10⁶ células/mL.
6. Alíquota 500 μL das células por amostra.
   NOTA: Para cada condição, faça um mínimo de 3 amostras de laser e 3 sem controles a laser.

4. Realização do IC-FPOP

1. Encha as duas seringas de 5 mL com tampão, a seringa de 500 μL contendo os ímãs com as células e a seringa final de 500 μL com H₂O₂. Ligue o agitador magnético.
2. Spike em 220 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO) para uma alíquota de saciedade, misture suavemente e coloque atrás do sistema de fluxo para coletar amostras irradiadas. A adição de DMSO inibirá a metionina endógena sulfória reductase.
3. Ligue o laser, espere 7 s e ligue o sistema de fluxo.
4. Quando a amostra terminar de fluir, desligue o laser e misture suavemente a saciedade com a amostra coletada. Coloque isso ao lado durante as etapas 4.5 e 4.6.
5. Encha todas as quatro seringas com o tampão onde as células estão suspensas e fluam pelo sistema de fluxo.
6. Depois que o sistema terminar de lavar, repita as etapas 4.1 e 4.2. Inicie o fluxo sem irradiação. Este é o controle sem laser para explicar a oxidação de fundo nas células.
7. Enquanto a próxima amostra estiver em execução, gire a amostra anterior em 450-800 x g por 5 min, remova o solvente e resuspenda em 100 μL de um tampão de lyse celular como o tampão de radioimunoprecipitação (RIPA).
8. Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuge e congele em nitrogênio líquido.
9. Quando todas as amostras terminarem de funcionar, desmonte o sistema de fluxo para limpeza. Descarte o tubo de sílica usado e limpe todas as outras conexões sônica por 1 h em 50% de água: 50% metanol. Limpe as seringas de acordo com as instruções do fabricante.

5. Digest

1. Digerir todo o lysate celular. Comece descongelando as amostras e aqueça a 95 °C por 10 minutos.
2. Depois de aquecer, esfrie o lysate no gelo por 15 min.
3. Adicione 25 unidades de nuclease para digerir DNA e RNA e incubar no quarto temperado por 15 min.
4. Girar amostras usando uma centrífuga de mesa a 16.000 x g por 10 min a 4 °C.
5. Coletar o sobrenadante e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga limpo.
6. Verifique a concentração de proteínas usando um kit de ensaio de proteínas.
7. Transfira 20-100 μg de amostra para um tubo de microcentrífuga limpo e leve a 100 μL.
8. Reduza as amostras com dithiothreiotol de 20 mM (DTT) a 50 °C por 45 min.
9. Esfrie as amostras em temperatura ambiente por 15 min.
10. Alquilato com iodoacetamida de 20 mM (IAA) à temperatura ambiente por 20 min protegido da luz.
11. Adicione acetona pré-refrigerada em uma proteína de proporção 1:4: acetona. Misture as amostras e coloque em -20 °C durante a noite.
12. Na manhã seguinte, gire amostras a 16.000 x g por 10 min a 4 °C.
13. Remova o sobrenadante e adicione 50 μL de acetona pré-refrigerada. Misture as amostras e gire para baixo a 16.000 x g por 5 min a 4 °C.
14. Remova a acetona e deixe as amostras secarem deixando as tampas da microcentrífuga abertas com um lenço sem fiapos cobrindo a parte superior. Depois que as amostras secarem, resuspenda a pelota de proteína com 10 mM Tris tampão pH 8.
15. Resuspender 20 μg de tripsina em 40 μL de 10 mM Tris buffer pH 8. Adicionar 2 μg de tripsina (massa: razão de massa de 1 tripsina: 50 amostra). Incubar amostras a 37 °C durante a noite.
16. Na manhã seguinte, verifique a concentração do peptídeo usando um ensaio de peptídeo. Após a remoção da amostra para o ensaio de peptídeo, sacie a digestão da tripsina adicionando ácido fórmico às amostras (a concentração final é de 5% de ácido fórmico).
17. Uma vez determinada a concentração final do peptídeo, transfira 10 μg de cada amostra para um tubo de microcentrífuge limpo. Isso garante que a mesma quantidade de cada amostra seja analisada. Seque a amostra usando uma centrífuga a vácuo. Uma vez seca, resuspenda com 20 μL de grau de espectrometria de massa 0,1% de ácido fórmico. Transferir amostras para frascos de amostradore automático.

6. Espectrometria de Massa cromatografia líquida-Tandem

1. Para localizar as modificações do FPOP, analise o llite celular digerido utilizando a análise LC-MS/MS.
2. Utilizar fases móveis de 0,1% de ácido fórmico na água (A) e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo (B).
3. Carga 0,5 μg de amostra em uma coluna de trapping de 180 μm x 20 mm C18 (5 μm e 100 Å) e amostra de lavagem com 99% (A) e 1% (B) por 15 min.
4. Utilizando uma coluna analítica de 75 μm x 30 cm C18 (5 μm e 125 Å), execute o método de separação analítica com uma taxa de fluxo de 0,300 μL/min a partir de 3% (B) por um min e depois rampa para 10% (B) a partir de 1-2 min. Próxima rampa para 45% (B) de 2-100 min e 100% (B) de 100-110 min. Limpe a coluna mantendo 100% (B) de 110-115 min. Recondicione a coluna, diminuindo para 3% (B) de 115-116 min e mantenha a 3% (B) de 116-130 min.
5. Defina o método de aquisição de MS para ter uma resolução de 60.000 com uma faixa de varredura m/z de 375-1500. Defina a meta de controle automático de ganho (AGC) para 5,0 x 10⁵ com um tempo máximo de injeção de 50 ms.
6. Durante a aquisição de MS, selecione os íons precursores com estados de carga 2-6 para isolamento via aquisição dependente de dados (DDA) com uma janela de isolamento de 1,2 m/z e um tempo de ciclo de 4 s. Selecione os peptídeos com um limiar de intensidade de 5,0 x 10⁴ para ativação de HCD com uma energia normalizada definida para 32%. Exclua os peptídeos após a aquisição de 1 MS/MS por 60 s. Defina a resolução MS/MS para 15.000 com uma meta AGC de 5,0 x 10⁴ e um tempo máximo de injeção de 35 ms.

7. Processamento de dados

1. Pesquise os arquivos RAW em um software de análise de proteínadisponível contra um banco de dados de proteínas relevante e a enzima digestiva relevante. Aqui, use o banco de dados Swiss-Prot Homo Sapiens e trypsin.
2. Defina a massa precursora para procurar entre 350 a 5.000 da e uma tolerância em massa de 10 ppm. Pode haver no máximo 1 local de decote perdido com um comprimento de peptídeo entre 6 a 144 resíduos. Essas limitações facilitam a busca no banco de dados.
3. Defina os íons de massa máxima de tolerância a 0,02 Da com o carbamidomeetil (+57.021) como uma modificação estática e todas as modificações de FPOP de 17 aminoácidos como uma modificação dinâmica (A Figura 4 é um exemplo do fluxo de trabalho de análise de proteínas usado para detectar modificações fpop).
   NOTA: As modificações de FPOP na serina e na threonina não estão incluídas na busca devido à sua menor reatividade com radicais hidroxilos.
4. Pesquise com um banco de dados de isca com uma taxa de descoberta falsa de 1% e 5%.
5. Uma vez que os arquivos são concluídos, calcule a extensão da modificação do FPOP. Abra o Proteome Discoverer 2.2, seqüência de exportação, locais de modificação, adesão à proteína, arquivo de espectro, abundância de precursores e informações de tempo de retenção. Calcular a extensão da modificação da equação 4:
   
   A área eic modificada é a área cromatográfica de um peptídeo específico com uma modificação radical hidroxil. A área do EIC é a área cromatográfica total de áreas modificadas e não modificadas desse peptídeo específico. A extensão da oxidação é calculada nas amostras com e sem irradiação. A amostra omitindo irradiação (controle) explica qualquer oxidação de fundo que poderia ter estado presente nas células antes e depois da exposição h₂O_2. Os controles são subtraídos das amostras de irradiação para ajudar a isolar modificações específicas do FPOP.

Resultados

IC-FPOP é um método de pegada para interrogar interações proteicas em células vivas. No sistema de fluxo IC-FPOP, o tempo de exposição de H₂O₂ é limitado a aproximadamente 3 s, garantindo concentrações mais altas de H₂O₂ sem consequências prejudiciais para as células. O sistema de fluxo também incorpora dois fluxos de tampão de bainha, que concentra hidrodinamicamente as células no centro da tubulação produzindo um único fluxo de células a serem uniformemente irradiadas (Figura 5)⁹. Imagens de fluorescência de imagens empilhadas de YZ ortogonais(Figura 5A) mostram uma clara separação do tampão da bainha (contendo um fluoróforo FITC) da solução celular (contendo um fluoróforo TMRM). Para enfatizar essa separação, as Figuras 5B e Figura 5C mostram mapas de calor médios tridimensionais da solução de tampão da bainha ou da solução celular, ilustrando a mistura mínima das duas soluções.

O uso do sistema de fluxo de célulaúnica única aumenta o número de proteínas oxidativamente modificadas em 13 vezes(Figura 6A)⁹. Neste método, as proteínas em muitos dos compartimentos celulares são rotuladas com proteínas de membrana, proteínas citoplasmáticas e proteínas dentro do núcleo sendo as 8^8,9. Para garantir que as proteínas fossem modificadas dentro de células intactas, foram realizadas imagens fluorescentes das células tratadas CellROX após o tratamento de H₂O₂ e a irradiação (Figura 6B)⁸. A estabilidade das células ao longo do processo de rotulagem confirma ainda mais a eficácia do IC-FPOP para sondar proteínas em seu ambiente celular nativo. Usando espectrometria de massa tandem, essas modificações podem ser localizadas em aminoácidos específicos em uma proteína. A Figura 7 representa uma modificação que ocorre durante o IC-FPOP juntamente com seu cromatograma de íon extraído. A mudança observada no cromatograma de íons extraído traduz-se na mudança na hidrofobicidade causada pela metionina oxidada no peptídeo modificado.

Para testar se as modificações do FPOP sondam a acessibilidade do solvente dentro das células, a actina rotulada in-cell foi comparada tanto com um estudo de pegada in vitro quanto com várias estruturas cristalinas de actina (Figura 8)⁸. A actina rotulada in-cell é representada na Figura 8A mostra extensões comparáveis de oxidação do estudo in vitro por Guan et al.¹⁰ (Figura 8B),concluindo que a actina tem acessibilidade solvente semelhante para estudos in-cell e in vitro. Para confirmar ainda mais que o IC-FPOP estava sondando a acessibilidade solvente da actina, a extensão das modificações do FPOP foi comparada com a acessibilidade solvente dos resíduos rotulados calculados a partir de duas estruturas de cristais de actina(Figura 8C). Esta correlação demonstra que o IC-FPOP sonda bem a acessibilidade solvente da proteína monórrica.

Figura 1: Como construir corretamente as regras. (A)Coloque as ferrules, a tubulação de sílica e a manga juntas antes de apertar. (B) Aperte todos os componentes juntos. (C) O produto final produzirá uma regra que foi apertada na manga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Configuração do sistema de fluxo IC-FPOP. (A) Imagem de um sistema de fluxo IC-FPOP totalmente montado posicionado ao lado do laser. (B)Exemplo de um espaçador necessário para aumentar o diâmetro externo das seringas de 500 μL para apertar com sucesso todas as seringas juntas. (C) Imagens representativas mostrando o espaço necessário para os agitadores magnéticos. (D)As rés são necessárias para enrolar a bomba de seringa sem quebrar as seringas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Esquema do sistema de fluxo desenvolvido para IC-FPOP. As linhas azuis representam tubos de sílica com um ID de 450 μm e 670 μm de OD, as linhas vermelhas têm um ID de 150 μm e 360 μm OD, e as linhas laranjas têm um ID de 75 μm e 360 μm OD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Software de análise de proteínas usado para detectar modificações FPOP. Um fluxo de trabalho típico com as modificações correspondentes pesquisadas em cada nó. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O sistema de fluxo de células únicas concentra hidrodinamicamente as células em um único fluxo. (A) Pilha Ortogonal YZ ilustrando o foco 3D do analyte celular (vermelho, fluoróforo TMRM) cercado pelo tampão da bainha (verde, fluoróforo FITC). Mapa de calor de intensidade média tridimensional do tampão da bainha(B)e do analyte celular(C). As intensidades mais baixas são azuis e as mais altas são vermelhas(B-C). Esta figura foi modificada de Rinas et al.⁹Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A utilização do Sistema de Fluxo IC-FPOP aumenta drasticamente as proteínas modificadas fpop nas células de ingestão. (A) Comparação das proteínas oxidadas identificadas com e sem o sistema de fluxo. O sistema de fluxo identificou 1391 proteínas modificadas FPOP, enquanto apenas 105 proteínas foram identificadas sem sistema de fluxo com sobreposição de 58 proteínas modificadas. Esta figura foi modificada a partir de Rinas et al.⁹ (B) Imagem de fluorescência de células tratadas CellROX após IC-FPOP mostrar que as células ainda estão intactas após rotulagem oxidativa. As células foram imagens usando um microscópio multifônico Olympus Fluoview FV1000 MPE a 665 nm. A imagem mostrada é uma única fatia. Esta figura foi modificada de Espino et al.⁸Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Exemplos de espectros Tandem MS/MS que ocorrem durante o IC-FPOP. Espectro de íon-produto (MS/MS) de um peptídeo(A)não modificado e uma oxidação(B)detectada no resíduo M8 encontrado nesse peptídeo. Um Peptídeo(C)não modificado e(D)modificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: O IC-FPOP é eficaz na sondagem da acessibilidade solvente de proteínas. (A) Extensão da modificação para os 9 peptídeos oxidativamente modificados da actina. Os valores são mostrados como médias mais e menos desvio padrão (n = 3). (B) Modificação dos peptídeos de actina oxidados in vitro por radiolíse síncrotron de Guan et al.¹⁰ (C) Correlação de modificações de resíduo FPOP com SASA nos estados apertados (triângulos, linha de tendência tracejada) e abertos (círculos, linha de tendência sólida) de actina. Esta figura foi modificada de Espino et al.⁸Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Várias técnicas baseadas em espectrometria de massa foram desenvolvidas para estudar a estrutura proteica e os complexos de ligadores de proteínas de forma proteome em células inteiras ou lisatos celulares. Essas técnicas incluem, mas não se limitam à estabilidade das proteínas da taxa de oxidação (SPROX), perfil de proteome térmico (TPP), cross-linking químico (XL-MS) e pegada de proteína radical hidroxil (HRPF). Cada técnica tem limitações e vantagens únicas em relação umas às outras, que foram amplamente revisadas¹². Cada um desses métodos tem sido usado para a biologia estrutural ampla do proteome para elucidar a estrutura proteica e, finalmente, funcionar dentro do ambiente celular complexo. IC-FPOP é uma técnica hrpf que utiliza radicais hidroxilos para modificar oxidativamente cadeias laterais expostas a solventes de aminoácidos, sondando estrutura proteica e interações proteína-ligantes dentro de células viáveis¹³. IC-FPOP é uma melhoria para hrpf inicial em células vivas que usaram a química de Fenton para gerar radicais na escala de tempo^{minutos 14}. Neste estudo, mudanças estruturais em uma proteína de membrana integral em resposta à redução do pH ou força iônica do tampão foram caracterizadas com sucesso com boa cobertura de oxidação em toda a proteína. Comparado com a química de Fenton, o IC-FPOP é muito mais rápido, modificando proteínas na escala de tempo de microssegundos, permitindo assim que a conformação de proteínas nativas seja estudada.

Um teste-chave para IC-FPOP é confirmar a viabilidade das células após a exposição a H₂O₂. Usando uma linha de mistura de 40 cm, as células são incubadas em H₂O₂ para cerca de 3 s antes da irradiação. Este tempo pode ser ajustado alterando o comprimento deste tubo de sílica. Vale ressaltar que, embora o uso de azul trypan para testar a viabilidade celular mostre que a integridade das células é sustentada após a incubação de H₂O_2, as células podem estar vias de sinalização de estressque interagem com H₂O₂. Felizmente, o curto tempo de incubação é mais rápido do que a síntese proteica, proporcionando confiança de que as proteínas presentes não são induzidas por H₂O₂.

O próximo passo importante é confirmar a montagem adequada do sistema de fluxo. Uma vez montado, certifique-se de que não há vazamentos presentes após a lavagem do sistema com o buffer desejado. Se houver vazamentos, certifique-se de que o tubo de sílica foi cortado corretamente e está alinhado contra a ferrule para fazer uma vedação adequada uma vez apertado. Todas as peças são apertadas à mão, por isso não são necessárias ferramentas. Durante cada experimento IC-FPOP, certifique-se de que os agitadores magnéticos na seringa celular permaneçam em movimento. Esta pequena agitação limita o número de células que se instalam na parte inferior da seringa, mas não é dura o suficiente para cisalhamento das células. Depois de uma corrida, há cerca de 50 μL de células deixadas na seringa. Certifique-se sempre de diluir isso com um passo de lavagem para limitar o número de células que se transportam para o próximo experimento. Recomenda-se o uso de uma seringa celular fresca se vários tratamentos celulares estiverem sendo comparados. Também é importante selecionar um buffer apropriado para as células que estão sendo testadas. Alguns tampões saciam o radical hidroxilo levando a menos modificações nas proteínas. Xu et al. mostraram que alguns tampões comumente usados diminuem a vida radical hidroxil¹¹. DPBS e HBSS são buffers comuns usados para experimentos IC-FPOP.

Após o IC-FPOP, otimize o protocolo de digestão com base nos parâmetros necessários. Uma vez que o FPOP produz modificações covalentes irreversíveis, há muito tempo disponível para uma digestão completa e limpeza sem perder a cobertura de rotulagem. Sempre teste e normalize a concentração de proteínas para que as concentrações uniformes de peptídeos sejam carregadas para espectrometria de massa em tandem. Por fim, tenha em mente que uma imunoprecipitação não pode ser realizada em conjunto com o IC-FPOP. Se uma modificação FPOP atingir a região de interação, a afinidade do anticorpo será reduzida. Para ajudar a aumentar a identificação das modificações do FPOP, as etapas de separação cromatográfica 2D mostraram mais do que o triplo do número de peptídeos oxidados detectados¹⁵.

Um desafio de qualquer experimento FPOP é o nível complicado de análise de dados devido aos possíveis produtos de oxidação que podem surgir. Isso é verdade tanto para as células quanto para o in vitro, mas é drasticamente aumentado com a complexidade adicional de analisar os lysatos celulares. Com a otimização adicional do IC-FPOP mais proteínas com maiores coberturas de modificação estão surgindo, tornando a análise mais árdua. A quantidade de dados gerada a partir de um único experimento IC-FPOP limita o uso de validação manual, fazendo com que os pesquisadores confiem mais fortemente no software. Devido a isso, Rinas et al. desenvolveram uma estratégia de quantificar o HRPF utilizando o Proteome Discoverer (PD)¹⁶. Este método utiliza um fluxo de trabalho de nó de várias pesquisas em PD combinado com uma plataforma quantitativa em uma planilha. Outras melhorias na plataforma IC-FPOP estão em andamento para aumentar o número de peptídeos identificados com modificações FPOP, juntamente com maior capacidade de reprodutibilidade e quantitação.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A	any brand is sufficient
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock	SGE Analytical Science	008760
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22	any brand is sufficient
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models	Fisher Scientific	SG-00723
Acetone, HPLC Grade	Fisher Scientific	A929-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg	Waters	186007496
ACQUITY UPLC M-Class System	Waters	ACQUITY UPLC M-Class System
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100	any brand is sufficient
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material	Phenomenex	04A-4299
Centrifuge	Eppendorf	022625501
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
Dithiothreiotol (DTT)	AmericanBio	AB00490-00005
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
EX350 excimer laser	GAM Laser	EX350 excimer laser
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID	IDEX Health & Science	1548L
Formic Acid, LC/MS Grade	Fisher Scientific	A117-50
HV3-2 VALVE	Hamilton	86728
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H325-100	any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Iodoacetamide (IAA)	ACROS Organics	122270050
Legato 210 syringe pump	KD Scientific	788212	Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene	IDEX Health & Science	P-618L
Methanol, LC/MS Grade	Fisher Scientific	A454SK-4	4 L quantity is not necessary
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002436
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU)	ACROS Organics	116891000
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6"	IDEX Health & Science	F-242X
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6"	IDEX Health & Science	F-246
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN)	ACROS Organics	177350250
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
PE50-C pyroelectric energy meter	Ophir Optronics	7Z02936
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Scientific	23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	A53225
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Scientific	90058
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis	Fisher Scientific	88702
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32"	Molex	1068680064	any capillary tubing cutter is sufficient
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350	Polymicro Technologies	1068150024
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670	Polymicro Technologies	1068150025
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375	Polymicro Technologies	1068150019
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P382-500
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software)	Thermo Scientific	OPTON-30799
Rotary Magnetic Tumble Stirrer	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3-4
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD	IDEX Health & Science	P-259X
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD	IDEX Health & Science	P-255X
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick	V&P Scientific, Inc.	VP 722F
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Fisher Scientific	PI89900
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK	Fisher Scientific	05-700-182
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK	Fisher Scientific	05-700-178
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses	THORLABS	LA4052
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000	V&P Scientific, Inc.	VP724F
VHP MicroTight Union for 360µm OD	IDEX Health & Science	UH-436
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS118-500
Water, LC/MS Grade	Fisher Scientific	W6-4