אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית

Summary

מטרת הפרוטוקול היא לעקוב באופן רציף אחר הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי ועל הפונדקאי התורם לעומת תאי התורם. זה מושגת על ידי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של העין (ACE) של NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-נמען העכבר ואחריו הדמיה חוזרת של 2 פוטין.

Abstract

הדמיה תאי בטא הוא צעד מפתח לקראת הבנת השתלת איון. למרות פלטפורמות הדמיה שונות להקלטה של ביולוגיה תא בטא פותחו ומנוצלים vivo, הם מוגבלים במונחים של מתן רזולוציה תא יחיד והקלטות אורכיות רציפות. בגלל השקיפות של הקרנית, התא הקדמי של העין (ACE) בעכברים מתאים היטב ללמוד ביולוגיה של תאי אי הלבלב האנושי והעכבר. הנה תיאור של איך גישה זו יכולה לשמש לביצוע הקלטות אורכיות רציפות של השתלה ו revascularization של שתלים בודדים איון אנושי. שתלי אייון אנושיים מוכנסים לתוך ACE, באמצעות NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26סור^tm4-Rag2^{-/- עכברים}נממענים. הדבר מאפשר חקירה של הרחבת תאי הנמען לעומת תאי התורם ותרומתם של תאי הנמען בקידום האנקפולציה וסקולריזציה של השתל. יתר על כן, גישה שלב אחר שלב לניתוח תמונה וכמת של נפח האי או כלי דם מחולקים וקפסולת איון ויוצרים תאים נמען מתואר.

Introduction

סוכרת מתאר קבוצה של מחלות מטבוליות המאופיינת ברמות גבוהות של גלוקוז בדם כתוצאה של ייצור אינסולין לא מספיק מאובדן או תפקוד לקוי של תאי ביתא איון הלבלב, לעתים קרובות מלווה תנגודת לאינסולין. סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D) הן מחלות מורכבות שבהן התפקוד הפרוגרסיבי של תאי הביתא גורם להתפתחות מחלות. T1D הוא זירז על ידי התקפה אוטואימונית על תאי בטא, בעוד T2D נחשב מונע על ידי גורמים מטבוליים, אם כי עם ראיות גוברות של דלקת מערכתית בדרגה נמוכה¹. השתלת איונים אנושיים תורמים, במיוחד לחולים T1D, מציע את הפוטנציאל לספק שליטה גליקמית פיזיולוגית. עם זאת, מחסור של תורמי רקמות וחינוך איון עני מנע השתלת איון להפוך לאפוביה טיפולית הזרם המרכזי. חלק ניכר של שתל האי הפונקציונלי אובד בתקופה שלאחר השתלה מיידית (24-48 שעות) בשל הסביבה המארח היפוקסית, דלקתית, אימונוגנית^2,,3. כדי להעריך את היעילות של שיטות התערבות לשיפור הישרדות איון, ניטור מתמשך של השתלות כאלה הוא הכרחי.

בטכניקות vivo כדי למצוא את גורלם של איונים הלבלב האנושי מושתלים לאחר השתלה עדיין נשאר אתגר עבור סוכרת מחקר^4,5. עד כה, טכניקות הדמיה לא פולשניות, כולל טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET), הדמיית תהודה מגנטית (MRI), או אולטרסאונד (ארה"ב) להראות פוטנציאל לכמת והערכה פונקציונלית של איים מושתלים בתנאים^{ניסיוניים 5}. עם זאת, בהתחשב בגדלים הקטנים של איון, מדידות כמותיות על ידי אותם מודאליות סובלות מרזולוציה לא מספקת. התא הקדמי של העין (ACE) כאתר השתלה לתצפית הוא פתרון הדמיה מבטיח שאינו פולשני המציע רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ביעילות וניטור תכופים על פני תקופות^{ארוכות 6}. שיטה זו נוצלה בהצלחה כדי ללמוד ביולוגיה איון העכבר (נבדק ביאנג ואח^{'. 7), תגובות חיסוניותאוטואימוניות 8, כמו גם}השתלת איון^{אנושי 9,10}.

כאן שיטת השתלת ACE משולבת עם גישה 2-פוטן הדמיה לחקור את הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי הלבלב engraftment על ידי הקלטות רציפות וחוזרות על עצמן על שתלי אי בודדים עד 10 חודשים לאחר ההשתלה. תכונות הדמיה multiphoton של עומקי הדמיה גדולים יותר והפחתת פוטו-בליך הכולל ונזק לצילום להתגבר על מגבלות ההדמיה של מיקרוסקופ confocal¹¹. כימות של הדמיית פלורסנט כרוכה במספר שלבים, כולל הכנת מדגם איון, השתלת איון, רכישת תמונה, סינון תמונות להסרת רעש איון או רקע, פילוח, כימות וניתוח נתונים. השלב המאתגר ביותר הוא בדרך כלל חלוקה למחיצות או פילוח של תמונה לחלקים או לאזורים מרובים. הדבר עשוי לכלול הפרדת אות מרעש רקע, או אזורי קיבוץ באשכולות של voxels בהתבסס על קווי דמיון בצבע או צורה כדי לזהות ולתייג voxels של אמצעי אחסון תלת-מית-מיוידי המייצג כלי דם של איון, לדוגמה. לאחר המקטע, סטטיסטיקה כגון גדלי אמצעי אחסון של אובייקט היא בדרך כלל פשוטה לחילוץ. מסופקת שיטה לכמת ולחילוץ של נתוני ההדמיה, כגון פילוח ופריט חזותי של נתונים. תשומת לב מיוחדת משולמת להסרת autofluorescence איונים אנושיים והבחנה בין כלי דם איון כמוסה איון ויוצרים תאים נמען.

Protocol

ועדת האתיקה האזורית בלונד, שוודיה, אישרה את המחקר על פי החוק הנוגע לביקורת האתית של מחקרים הקשורים לבני אדם. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לאתיקה השבדית של ניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדות האתיקה של מאלמו ולונד. 6 עד 8 שבועות של אף פעם לא חיסוני. (Cg)-Gt(ROSA)26סור^tm4-Rag2^-/- (NOD. רוזה-עגבנייה. Rag2^-/-) עכברים נמען שימשו נמענים להשתלה של איונים אנושיים^10.

1. הכנת איילט להשתלה

1. איונים אנושיים תרבות ב CMRL 1066 בתוספת עם 10 mM HEPES, 2 mM L-גלוטמין, 50 μg/mL gentamycin, 0.25 μg/mL פטריות, 20 μg/mL ציפרופלוקסאצין, 10 m nicotinamide (NIC), ו 10% חום לא פעילות סרום אנושי ב 37 °C ב 5% CO_{2 אוויר} לח עד להשתלה, כפי שתואר^{קודם לכן 12}.
   הערה: אייונים צריכים להיות חופשיים מרקמות אקסוקריניות ולא לגעת אחד בשני בתרבות. רקמות אקסוקריניות נראות שקופות.
2. ביום ההשתלה, העבר את אמצעי התקשורת של התרבות המכילה את אייונים לצלחת פטרי חדשה באמצעות מכלול צינור שאפתור המחובר לניים מזכוכית נשלפת.
   הערה: לחלופין, השתמש פיפטה 200 μL. צביעת החלק האחורי של צלחת פטרי מסייעת להפוך את איי ה-10 לבולטים יותר תחת מיקרוסקופ הסטריאו.
3. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, לבחור ~ 20-40 איונים לכל השתלה ולהעביר צינור 1.5 מ"ל. מלא את הצינור למעלה עם תקשורת תרבות מהאינקובטור.
4. לאטום את הצינורות עם סרט פרפין ולאחסן על קרח עד להשתלה. הכן כמות מתאימה עבור מספר ההשתלות שבוצעו.
5. לחלופין, ודאו_{שאינקובטור CO 2 זמין} בחדר הניתוח כדי לשמור על איונים בתרבות ולבחור אותם מיד לפני כל השתלה.

2. הכנת ציוד השתלה ושולחן ניתוחים

הערה: יש לעבד את כל הכלים הכירורגיים, ושולחן הניתוחים והמכשירים ינותו ב-70% אלכוהול.

1. חבר מחזיק ראש סטריאו-מסה להרדמה באמצעות מסכת אף והפעיל את משטח החימום.
2. חבר מזרק המילטון חזק לצינורות פוליאתילן ופקניק עיניים קהה.
   הערה: מומלץ למלא את כל החלקים ב- PBS לפני ההרכבה. בדוק אם בועות אוויר לכודות ולהסיר אם קיים.
3. חבר את מזרק המילטון בחוזקה לשולחן(איור 1a)או בסיס נייד(איור 1e)וצרף את הצינורות למיקרוסקופ הסטריאופוני, כאשר הנולה תלויה למטה (כלומר, עמדת המתנה).
   הערה: השתמש בקלטת כירורגית, מכיוון שקל להסיר ולצרף מחדש.
4. הכן מזרק 1 מ"ל מחובר מחט 30 G מלא 0.1 מ"ג / ק"ג תמיסת buprenorphine.
5. הכן מזרק עם פי.בי.אס סטרילי. לחלופין, השתמש פיפטה.
6. הניחו בצד כלוב השכמה נקי עם מנורת חימום.

3. הרדמה ומיקום של עכברים נמענים לניתוח

הערה: כל בעלי החיים גודלו והתוחזקו בסביבה ללא פתוגן במתקני בעלי החיים באוניברסיטת לונד.

1. להמם את העכבר בתא מלא 40% O_{2 /60%}N₂/3% isoflurane ולהעביר את העכבר המהדמה לפלטפורמת מחזיק הראש על משטח חימום חם(איור 1a). בדוק אם יש מחסור רפלקסים לדוושה.
   הערה: הרדמה Isoflurane היא השיטה המועדפת של הרדמה להחלמה מהירה לאחר הניתוח. חדר המיקרוסקופ חייב להיות מאוורר כראוי כדי להשתמש isoflurane.
2. מקם את הנום של העכבר לתוך מסכת ההרדמה מחובר 40% O₂/60% N₂/0.9%–1.5% מכונת הרדמה isoflurane. השתמש באגודל ובצבע כדי להרים מעט את הראש ולהדק אותו באמצעות החלקים המתכתיים בצדדים. ודא שהאוזניות מתקנות את הראש ישירות מתחת לאוזניים. להזריק 0.1 מ"ג/ק"ג תמיסת buprenorphine תת עורית על הגב של העכבר.
   הערה: Buprenorphine משמש כשכךכך כאבים.
3. הטה את הראש כך שהעין שיש לנתח פונה כלפי מעלה וקרובה לחוקר.
4. משוך בעדינות את העפעפיים של העין להשתלה באמצעות מפסים קהים, להוציא את העין, ולתקן באופן רופף עם זוג פינצטה. ודא כי קצות הפינצטה מכוסים בצינור פוליאתילן המחובר לפלטפורמת מחזיק הראש(איור 1א,הכנס).
5. תמיד לשמור על שתי העיניים רטובות על ידי החלת טיפה של PBS סטרילי על העין.
6. להעביר את איי האדם מן הצינור אטום 1.5 מ"ל (סעיף 1) לצלחת פטרי עם PBS סטרילי ולוודא כי איונים קרובים זה לזה כדי למזער את כמות התקשורת תרבות התא מועבר(איור 1c).
7. להרים ~ 20-30 איונים בקנולה העין מחובר באמצעות צינורות פוליאתילן מזרק המילטון.
   הערה: קח מעט נוזל ככל האפשר עם איי.
8. לתלות את הצינורות הפוך ולצרף למיקרוסקופ סטריאו(איור 1d). להדביק את הצינורות בזהירות כדי לתת לאיים לשקוע עד קצה הצינור לכיוון הצינור.

4. הליך השתלה

הערה: שיטה זו תוארה בעבר עבור השתלת איי עכבר⁶. הליך שונה במקצת מוצג כאן.

1. צבוט את הרפידות על הרגליים האחוריות כדי לוודא שהעכבר ישן.
2. להדק את המרטיות לרסן את העין מבלי לשבש את זרימת הדם ולהחיל טיפה של PBS סטרילי על העין.
3. באמצעות מחט 25 G כמו אזמל, משופע כלפי מעלה, בזהירות לחדור רק חצי מהקצה בקרנית ו לעשות חתך רוחטי יחיד. הפוך את החור בזווית כלפי מעלה; החור ייאטום בקלות רבה יותר לאחר ההשתלה (איור 1f).
4. הרם בזהירות את הקרנית עם המנה טעון מראש עם איונים ולאט להחיל איונים בעין. הימנעו מהכנסת הנולה לתא הקדמי כדי למנוע נזק של הקשתית, אלא דחפו בזהירות כנגד פתח הקרנית(איור 1 גרם).  לאט לאט למשוך את הנולה מן ACE.
   הערה: לכוון נפח הזרקה של 3-8 μL. אם הנפח גדול מדי, זה יחשוף את העין ללחץ תוך עיני גבוה שלא לצורך עלול לגרום ריפלוקס של איים מוזרקים מתוך התא הקדמי.
5. כאשר הם מתמודדים עם קשיים בהחדרת איים עקב לחץ מוגבר בתא העיניים, הגדל את אתר החתך על ידי חיזוק אתר החתך לחוץ והטמיע מחדש איים.
   הערה: מדי פעם, בועות אוויר הציג יכול לשמש כמחזיקי שטח.
6. למרוח ג'ל עיניים על העין, לשחרר את המרטי ריסון העין ולהשאיר את העכבר על isoflurane באותו מצב במשך 8-10 דקות כדי לאפשר לאיים להגדיר.
7. הסר את המרטיות המחזיקות את העפעף והחזירו את העפעף למיקום הרגיל שלו.
8. הסר את העכבר ממחזיק הראש והעבר אותו לכלוב התעוררות.
9. כאשר העכבר ער וזז, העבר אותו בחזרה לכלוב המקורי והשמור על בית בעלי החיים עד לסריקה (מומלץ לפחות 5 ימים).

5. הדמיה של איונים אנושיים מושתלים על ידי מיקרוסקופי 2 פוטן

הערה: צילום תמונות סקירה של העין באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצי(איור 2a–c)4-5 ימים לאחר ההשתלה לפני הדמיה 2-פוטן מומלץ למצוא את איונים של עניין. הימנע מלרסן את העין חזק מדי בשלב זה מוקדם לאחר ההשתלה. השתמש בהדמיה של 2 פוטון 6-7 ימים לאחר ההשתלה.

1. הפעל את התוכנה לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים). בתפריט "לייזר" להפעיל את לייזר מאי טאי (כוח "ON") וב "נתיב אור" להגדיר את אורך הגל 900 נה"מ ולהחיל כוח לייזר שידור מינימלי החל 5%-10% כוח לייזר (השתמש במחוונים).
   הערה: בעת הסריקה, התאם את כוח הלייזר במידת הצורך.
2. הגדר ערוצים ירוקים, כתומים ואדומים. אסוף אור פליטה בו-זמנית על שלושה גלאים שאינם משורים (NDD) באמצעות מראה דיכרונית (LBF 760) ומידע מסנן פליטה כדלקמן: אדום/אנגיוסנס 680, 690-730 ננ"מ; ירוק/פלואורסנציה, 500-550 צפון;; ותפוז/עגבניה, 565-610nm (איור 2d).
3. מניחים את שלב בעל הראש על שלב המיקרוסקופ הממונע וחברו את מסכת הגז לצינורות של מכונת ההרדמה והצינורות המחוברים למערכת האוורור. הפעל את משטח החימום.
4. להרדים את העכבר הנמען, להעביר לפלטפורמת בעל הראש, לרסן את העין להדמיה, ולנהל פתרון buprenorphine כמתואר לעיל (שלבים 3.1-3.5).
5. כוונן את אדי השופלוריין במידת הצורך. קצב נשימה של כ-55-65 נשימות לדקה (bpm) מצביע על הרדמה אופטימלית. אם ההרדמה עמוקה מדי, הקצב יהיה 50 bpm עם נשימה כבדה או מתנשף; אם קל מדי, הקצב יהיה >70 bpm עם נשימה שטחית. עקוב בזהירות אחר עכברים במהלך הרדמה על ידי בדיקה חזותית כל 15 דקות.
   הערה: הרדמה משתנה מעכבר לעכבר, בין זנים של העכבר, וזמן תחת הרדמה מתקדם¹³.
6. לתת מספיק ג'ל עיניים על העין כנוזל טבילה בין הקרנית לעדשה, ומאפשר לה להצטבר לאט(איור 2f,הכנס). להימנע בועות אוויר.
   הערה: תאורה צדדית עם מנורת צינור מתכת גמישה מומלצת כדי לכוונן את המיקוד ולמצוא למיקום אחר שתלי איי.
7. כדי לדמיין את כלי הדם, לנהל 100 μL של סוכן ההדמיה (למשל, Angiosense 680) דרך וירד לתוך וירק הזנב באמצעות אינסולין חד פעמי 30 G מזרק.
8. במצברכישה " להתאיםאת גודל המסגרת ל- 512 x 512 ואת מהירות הסריקה.
   הערה: סריקות איטיות יותר (כלומר, הגדלת זמן ההתעכבות) ישפרו את יחס האות לרעש.
9. בתפריט "ערוצים" להתאים רווח ראשי עבור כל PMT ב וולט כדי להגביר את האות עד תמונה נראית על המסך במצב סריקה חיה. כערך זה גבוה יותר, כך הגלאי הופך רגיש יותר לאותת ורעש.
   הערה: רצוי, שמור ערכים בין 500-800 V.
10. בתפריט "Z-stack" להגדיר את ההתחלה ואת הסוף של z-stack על-ידי הזזת המוקד באופן ידני לראש שתל אייון. שמור מיקום על-ידי בחירה באפשרות "הגדר ראשון". עבור אל הישור התחתון האחרון שניתן להתמקד בהשתלת איון ולשמור מיקום על-ידי בחירה באפשרות "הגדר אחרון ". השתמש בגודל z-שלב של 2 μm.
11. אסוף את ערימת התמונה הסופית על-ידילחיצהעל הכרטיסיה " התחל ניסוי " ושמור כקובץ CZI של 8 סיביות (כלומר, תבנית Carl Zeiss).

6. הדמיה של איונים אנושיים מושתלים על ידי מיקרוסקופית קונפוקלי

הערה: ניתן להעריך את הנפח הכולל, מורפולוגיה ופלסטיקיות של איים מושתלים על ידי ניטור אות פיזור vivo בסריקה נפרדת (כלומר, מסלול נפרד) על ידי זיהוי של אור backscatter^{לייזר 10}.

1. להוציא את מפצל הקורה הראשי (כלומר, LBF Filter) ובדו-שיח "נתיבאור " להגדיר מסלול נפרד עבור הדמיה confocal. בחר את לייזר ארגון עם אורך גל של 633 00 0m וזיהוי באותו אורך גל כמו אור הלייזר. Z-stacks נרכשים עם גודל שלב של 2-3 μm עבור אות אור backscatter.
2. תקן מחדש את הגדרות z-stack כדי לוודא להקליט את כל אי המקום (ראה שלב 5.10).
3. רכש את מחסנית התמונה ושמור כקובץ CZI של 8 סיביות.

7. ניתוח תמונה

הערה: תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים)שימשה עבור שלב זה.

1. הסרת שפעת אוטומטית של איון (איור 3b)
   1. בכרטיסיה "עיבוד תמונה" לבחור "חשבון ערוץ" והקלד "ch1-ch2". פעולה זו יוצרת ערוץ חדש 4 (ch 4); לשנות את שמו כ "כלי דם".
      הערה: ערוץ ירוק/השפעה אוטומטית הוא חיסור מערוץ אדום/Angiosense.
   2. חזור על השלב הקודם והקלד "ch3-ch2" כדי ליצור ערוץ חדש (ch 5); לשנות את שם "עגבניה (כל)".
      הערה: ערוץ ירוק/פלואורסצינציה אוטומטית חסר מערוץ התפוז/עגבניות.
2. הגדרת מסיכת איון לפי ציור ידני (איור 3c)
   1. צור משטח חדש (סמל כחול) ובבחור באשף בחר " ערוךבאופן ידני". השאר את המצביע במצב "בחר" ובתצוגת תלת-מיוד בטל את הלחץ על "אמצעיאחסון " (תחת סצינה)כדי להציג מקטעים באופן חזותי.
   2. לאפליה קלה יותר בגבול איון, הפעל את כל הערוצים, כולל ch 1-ch 3.
      הערה: ערוץ תפוז/עגבניות שימושי להגדרת גבולות איון על ידי אות קפסולת עגבניות. לחלופין, להגביר את עוצמת הערוץ כדי להשתמש בפלאורסצנציה אוטומטית של האי רב ערוצי ואות רקע גלאי כהדרכה.
   3. בכרטיסיה "ציור" בחר "מתאר" ולחץ על "צייר" כדי להתחיל לצייר קווי מתאר סביב גבול איון החל במיקום פרוסה 1.
   4. מעבר למיקום פרוסה חדש וחזור על קווי מתאר של ציור. סיים עם הפרוסה האחרונה בראש איון וסיום על-ידי לחיצה על הכרטיסיה "יצירת משטח". בדרך כלל זה מספיק כדי לצייר קווי מתאר כל פרוסה^10.
3. פילוח של "כלי דם של איון" ו "עגבניית איילט" פלואורסצנציה באמצעות מסכת איון (איור 3D).
   1. בחר את האובייקט"מסיכת איון"שהוגדר קודם לכן, עבור אל כרטיסיית העריכה(סימן עיפרון) ולחץ על הכרטיסיה "מסיכההכל ", הפותחת חלון חדש.
   2. בחר את הערוץ הקודם"Vasculature" (ch 4) בתפריט הנפתח של בחירת הערוץ והפעל אפשרויות " שכפל ערוץ לפניהחלת מסיכה", " קבוע בפנים/ בחוץ", ולהגדיר voxels מחוץ לפני השטח "0.000", אשר יוצר ערוץ חדש; לשנות את שם "כלי דם איילט" (ch 6).
   3. חזור על שלבים 7.3.1 ו- 7.3.2 ובחר את הערוץ שנוצר בעבר "עגבניה (כל )" (ch 5) בתפריט הנפתח בחירת ערוץ כדי ליצור את הערוץ החדש; לשנות את שם "עגבניית איון" (ch 7).
4. עיבוד פני השטח של כלי דם של איון (איור 3e)
   1. צור משטח חדש בתפריט "סצינה" ובבחור באשף "יצירה אוטומטית".
   2. הגדר את ערוץ המקור ל"כלי דם של Islet" (ch 6) ובחר חיסור רקע. ניתן לכוונן הערכת סף אוטומטית במידת הצורך. השווה לערוץ הפלואורסץ המגיב (לדוגמה, על-ידי מיזוג לשונית פני השטח החדשה שנוצרה). המשך באשף.
   3. לחלופין, השתמש במסננים. לדוגמה, בחר "Volume" והתאם את המסנן (צהוב) בחלון, אשר יכול להסיר אובייקטי משטח נבחרים. סיים את האשף ותן שם לאובייקט פני השטח החדש "כלי דם של האי".
5. פילוח של "אות פלואורסצט עגבניותאיילט " (איור 3f)
   1. באובייקט השטח"Islet vasculature" שנוצר בעבר, עבור אל כרטיסיית העריכה ולחץ על הכרטיסיה "מסיכההכל ", הפותחת חלון חדש.
   2. בחר את הערוץ שנקרא קודם לכן "עגבניית איון" (ch 7) בתפריט הנפתח של בחירת הערוץ והגדר voxels מחוץ לפני השטח "10.000", אשר יוצר את הערוץ החדש; לשנות את שם "כלי דם עגבניות איילט" (ch 8).
6. פילוח של "כמוסת עגבניות" אות פלואורסנס( איור 3 גרם)
   1. בחר "ערוץ חשבון" בכרטיסיה "עיבוד תמונה" והקלד "ch7-ch8", יצירת הערוץ החדש; לשנות את שם "כמוסת עגבניות" (ch 9).
      הערה: "אות הפלואורסצנציהשל עגבניות האיון"מנוקב מאיית הפלואורסצנציה הכוללת.
7. עיבוד פני השטח של "כלי דם עגבניות איילט" ו "כמוסת עגבניות" (איור 3h)
   1. בצע שלב 7.4, באשף לבחור ערוצי מקור "כלי דם עגבניות איון" (ch 8) או "כמוסת עגבניות" (ch 9) כדי ליצור אובייקטים פני השטח חדשים בהתאם.
8. עיבוד פני השטח של משטח איון כולל (איור 3i)
   1. פתח את קובץ ה-backscatter של איון וצור משטח חדש.
   2. באשף, בחר "יצירה אוטומטית" והגדר "אזור עניין".
      הערה: "אזור עניין" משמש כדי להפריד את האותות של איים מרובים ולהגדיר את עומק האי שיש לנתח (לדוגמה, 75 μm העליון).
   3. ב "עוצמה מוחלטת" להתאים סף במידת הצורך. ניתן ללחוץ על אובייקט פני השטח או כבוי כדי להצליב עם עוצמת הערוץ המתאימה. סגור את האשף.
9. כימות (איור 3j)
   1. בחר אובייקט משטח שנוצר בתפריט "סצינה" ולך אל הכרטיסיה "סטטיסטיקה".
   2. כדי לאחזר נתוני אמצעי אחסון מפורטים באובייקט פני השטחשנבחר,בחר בכרטיסיה " מפורטת " ובחר "ערכים ספציפיים" ו "Volume" מהתפריט הנפתח . כדי לאחזר ערך אמצעי אחסון כולל של אובייקט פני השטח שנבחר, עבור אלהכרטיסיה" מפורט " ובחר "ערכים ממוצעים".

תוצאות

איונים אנושיים לא מתויגים הושתלו ב-ACE של ה-NOD הנשי בן ה-8 שבועות. (Cg)-Gt(ROSA)26סור^tm4-Rag2^-/-(NOD. רוזה- עגבניה. עכברי נמען Rag2^./). כדי למנוע דחיית רקמות אנושיות, עכברי נוקאאוט של Rag2 לא חיסוניים נבחרו נמעני. בעכברים טרנסגניים אלה, כל התאים והרקמות הביעו חלבון פלואור...

Discussion

שיטה מוצגת כדי לחקור את תהליך השתלת תאי איון הלבלב האנושי על ידי התבוננות המעורבות של הנמען ורקמות התורם. לאחר ניתוח פולשני מינימלי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של עין עכבר immunodeficient, העכבר מתאושש במהירות בתוך דקות לאחר הניתוח. ההליך מתבצע בעין אחת. בדרך כלל, מ 5-7 ימים לאחר השתלה ואילך...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M