Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure

Résumé

Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.

Résumé

L’imagerie des cellules bêta est une étape clé vers la compréhension de la transplantation d’îlots. Bien que différentes plates-formes d’imagerie pour l’enregistrement de la biologie des cellules bêta aient été développées et utilisées in vivo,elles sont limitées en termes de résolution à cellule unique et d’enregistrements longitudinals continus. En raison de la transparence de la cornée, la chambre antérieure de l’œil (ACE) chez la souris est bien adapté pour étudier la biologie des cellules d’îlots pancréatiques humains et de souris. Voici une description de la façon dont cette approche peut être utilisée pour effectuer des enregistrements longitudinals continus de greffe et de revascularisation des greffes d’îlots humains individuels. Les greffes d’îlots humains sont insérées dans l’ACE, à l’aide de NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-souris en tant que receveurs. Cela permet l’étude de l’expansion des cellules de receveur par rapport aux donneurs et de la contribution des cellules bénéficiaires dans la promotion de l’encapsulation et de la vascularisation de la greffe. De plus, une approche étape par étape pour l’analyse de l’image et la quantification du volume de l’îlot ou de la vasculature segmentée et de la capsule d’îlot formant des cellules destinataires est décrite.

Introduction

Le diabète sucré décrit un groupe de maladies métaboliques caractérisées par des niveaux élevés de glucose sanguin comme résultats de la production insuffisante d’insuline de la perte ou du dysfonctionnement des cellules bêta d’îlot pancréatique, souvent accompagnés par la résistance à l’insuline. Le diabète de type 1 (T1D) et le diabète de type 2 (T2D) sont des maladies complexes dans lesquelles le dysfonctionnement progressif des cellules bêta provoque le développement de la maladie. Le T1D est précipité par une attaque auto-immune sur les cellules bêta, tandis que le T2D est considéré comme étant motivé par des facteurs métaboliques, bien qu’avec des preuves croissantes de l’inflammation systémique de qualité basse¹. La transplantation d’îlots humains donneurs, en particulier pour les patients atteints de T1D, offre le potentiel de fournir un contrôle glycémique physiologique. Cependant, une pénurie de donneurs de tissus et une mauvaise engreffement d’îlots a empêché la transplantation d’îlots de devenir une option thérapeutique courante. Une proportion substantielle de la greffe fonctionnelle d’îlot est perdue dans la période immédiate de posttransplantation (24–48 h) due à l’environnement d’hôte hypoxique, inflammatoire, immunogénique^2,3. Pour évaluer l’efficacité des méthodes d’intervention pour l’amélioration de la survie des îlots, un suivi continu de ces transplantations est nécessaire.

In vivo techniques pour l’image et le suivi du sort des îlots pancréatiques humains transplantés après la transplantation reste un défi pour la recherche sur le diabète^4,5. À ce jour, les techniques d’imagerie non invasive, y compris la tomographie par émission de positrons (TEP), l’imagerie par résonance magnétique (IRM) ou l’échographie (US) présentent un potentiel de quantification et d’évaluation fonctionnelle des îlots transplantés dans des conditions expérimentales⁵. Toutefois, compte tenu de la petite taille des îlots, les mesures quantitatives effectuées par ces modalités souffrent d’une résolution insuffisante. La chambre antérieure de l’œil (ACE) comme site de transplantation pour l’observation est une solution d’imagerie non invasive prometteuse offrant effectivement une résolution spatiale plus élevée et une surveillance fréquente sur de longues périodes de temps⁶. Cette méthode a été exploitée avec succès pour étudier la biologie des îlots de souris (revue dans Yang et coll.⁷), les réponses immunitaires auto-immunes⁸, ainsi que la greffe d’îlot humain^9,10.

Ici, la méthode de transplantation ACE est combinée avec une approche d’imagerie de 2 photons pour étudier la dynamique du processus d’engraftment de l’îlot pancréatique humain par des enregistrements continus et répétés sur des greffes d’îlots individuels pendant jusqu’à 10 mois après la transplantation. Les propriétés d’imagerie multiphoton de plus grandes profondeurs d’imagerie et de photobleaching global réduit et dommages de photo surmontent les limitations d’imagerie de la microscopie confocale¹¹. La quantification de l’imagerie fluorescente comporte plusieurs étapes, y compris la préparation de l’échantillon d’îlots, la transplantation d’îlots, l’acquisition d’images, le filtrage d’images pour éliminer le bruit ou le fond des îlots, la segmentation, la quantification et l’analyse des données. L’étape la plus difficile consiste généralement à partitionner ou segmenter une image en plusieurs parties ou régions. Cela pourrait impliquer la séparation du signal du bruit de fond, ou le regroupement des régions de voxels en fonction de similitudes de couleur ou de forme pour détecter et étiqueter les voxels d’un volume 3D qui représente la vascularisation des îlots, par exemple. Une fois segmentées, les statistiques telles que la taille du volume d’objets sont généralement simples à extraire. Fourni est une méthode de quantification et d’extraction des données d’imagerie, telles que la segmentation et la visualisation des données. Une attention particulière est accordée à l’élimination de l’autofluorescence dans les îlots humains et à la distinction entre la vascularisation des îlots et la capsule d’îlot formant des cellules destinataires.

Protocole

Le Comité régional d’éthique de Lund, en Suède, a approuvé l’étude conformément à la Loi sur l’examen éthique de la recherche impliquant des humains. Les expériences animales ont été réalisées dans le strict respect de l’éthique suédoise des expériences animales et approuvées par les comités d’éthique de Malmö et Lund. NOD immunodéficient de 6 à 8 semaines. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. ROSA-tomate. Rag2^-/-) souris receveurs ont été utilisés comme receveurs pour la transplantation d’îlots humains¹⁰.

1. Préparation des îlots pour la transplantation

1. Îlots humains de culture en CMRL 1066 complétés par 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 50 μg/mL de gentamycine, 0,25 μg/mL de champignonszone, 20 μg/mL ciproxfloxacine, 10 mM nicotinamide (NIC), et 10% sérum humain inactivé thermique à 37 °C dans 5% CO₂ et l’air humidifié jusqu’à la transplantation, comme décrit précédemment¹².
   REMARQUE : Les îlots doivent être exempts de tissu exocrine et ne pas se toucher en culture. Les tissus exocrines semblent translucides.
2. Le jour de la transplantation, transférez des supports de culture contenant les îlots dans une nouvelle boîte de Pétri à l’aide d’un ensemble de tubes d’aspiration relié à un capillaire en verre tiré.
   REMARQUE : Sinon, utilisez une pipette de 200 μL. La coloration du dos de la boîte de Pétri permet de rendre les îlots plus facilement reconnaissables sous le microscope stéréo.
3. À l’aide d’un microscope stéréo, choisissez des îlots de 20 à 40 par transplantation et transférez-les dans un tube de 1,5 mL. Remplissez le tube au sommet avec des supports culturels de l’incubateur.
4. Sceller les tubes avec du film de paraffine et les conserver sur la glace jusqu’à la transplantation. Préparer une quantité appropriée pour le nombre de transplantations effectuées.
5. Sinon, assurez-vous qu’un incubateur de CO₂ est disponible dans la salle de chirurgie pour garder les îlots en culture et les cueillir immédiatement avant chaque transplantation.

2. Préparation de matériel de transplantation et de table de chirurgie

REMARQUE : Tous les outils chirurgicaux doivent être autoclaved, et la table de chirurgie et les instruments désinfectés avec 70% d’alcool.

1. Connectez un support de tête stéréotaxique à l’anesthésie via un masque de nez et allumez le coussin chauffant.
2. Connectez une seringue Hamilton à un tube en polyéthylène et à une canule émoussée pour les yeux finaux.
   REMARQUE : Il est recommandé de remplir toutes les pièces avec pbs avant l’assemblage. Vérifiez s’il y a des bulles d’air emprisonnées et retirez-les si elles sont présentes.
3. Attachez la seringue Hamilton étroitement à la table (figure 1a) ou à une base mobile (figure 1e)et attachez le tube au microscope stéréo, avec une canule suspendue (c.-à-d. position d’attente).
   REMARQUE : Utilisez du ruban chirurgical, car il est facile d’enlever et de rattacher.
4. Préparer une seringue de 1 mL reliée à une aiguille de 30 G remplie d’une solution de buprénorphine de 0,1 mg/kg.
5. Préparer une seringue avec pbs stérile. Sinon, utilisez une pipette.
6. Réserver une cage de réveil propre avec lampe chauffante.

3. Anesthésie et positionnement des souris receveurs pour la chirurgie

REMARQUE : Tous les animaux ont été élevés et maintenus dans un environnement exempt d’agents pathogènes dans les installations pour animaux de l’Université de Lund.

1. Anesthésiez la souris dans une chambre remplie de 40% O₂/60% N₂/3% isoflurane et transférez la souris anesthésiée sur la plate-forme du support de tête sur un coussin chauffant chaud (Figure 1a). Vérifiez l’absence de réflexes de pédale.
   NOTE : L’anesthésie isoflurane est la méthode préférée d’anesthésie pour la récupération rapide après chirurgie. La salle de microscope doit être correctement ventilée pour utiliser l’isoflurane.
2. Placez le museau de la souris dans le masque d’anesthésie relié à 40% O₂/60% N₂/0,9%–1,5% isoflurane machine d’anesthésie. Utilisez le pouce et le doigt pour soulever légèrement la tête et la fixer à l’aide des morceaux métalliques sur les côtés. Assurez-vous que les écouteurs fixent la tête directement sous les oreilles. Injecter une solution de buprénorphine de 0,1 mg/kg à l’arrière de la souris.
   REMARQUE : La buprénorphine est utilisée comme analgésique.
3. Inclinez la tête de sorte que l’œil à opérer est orienté vers le haut et est proche du chercheur.
4. Rétractez doucement les paupières de l’œil à transplanter à l’aide de forceps émoussés, sortez l’œil et fixez-les avec une pince à épiler. Assurez-vous que les pointes des pinces sont recouvertes d’un tube de polyéthylène fixé à la plate-forme du support de tête(figure 1a, insert).
5. Gardez toujours les deux yeux mouillés en appliquant une gouttelette de PBS stérile sur l’œil.
6. Transférer les îlots humains du tube scellé de 1,5 mL (section 1) vers une boîte de Pétri avec pbs stérile et s’assurer que les îlots sont proches les uns des autres pour minimiser la quantité de milieux de culture cellulaire transférés (Figure 1c).
7. Ramasser des îlots de 20 à 30 dans la canule oculaire reliées par des tubes en polyéthylène à la seringue hamiltonien.
   REMARQUE : Prenez le moins de liquide possible avec les îlots.
8. Accrochez le tube à l’envers et attachez-le au microscope stéréo (Figure 1d). Collez soigneusement les tubes pour laisser les îlots couler jusqu’à l’extrémité du tube vers la canule.

4. Procédure de transplantation

REMARQUE : Cette méthode a déjà été décrite pour la transplantation d’îlots de souris⁶. Une procédure légèrement modifiée est présentée ici.

1. Pincez les coussinets sur les pattes postérieures pour vous assurer que la souris dort.
2. Serrez les forceps qui retiennent l’œil sans perturber le flux sanguin et appliquez une gouttelette de PBS stérile sur l’œil.
3. À l’aide d’une aiguille de 25 G comme scalpel, biseauter vers le haut, pénétrer soigneusement seulement la moitié de la pointe dans la cornée et faire une incision latérale unique. Faire le trou dans un angle vers le haut; le trou se scellera plus facilement après la greffe (Figure 1f).
4. Soulevez soigneusement la cornée avec la canule préchargée avec des îlots et appliquez lentement les îlots dans l’œil. Évitez l’insertion de la canule dans la chambre antérieure pour éviter les dommages de l’iris, mais plutôt pousser soigneusement contre l’ouverture cornéenne (Figure 1g).  Rétractez lentement la canule de l’ACE.
   REMARQUE : Visez un volume d’injection de 3 à 8 μL. Si le volume est trop grand, il exposera l’œil à une pression intraoculaire inutilement élevée et peut entraîner le reflux des îlots injectés hors de la chambre antérieure.
5. Lorsque vous rencontrez des difficultés d’insertion des îlots en raison d’une pression accrue dans la chambre des yeux, agrandir le site d’incision en renforçant le site d’incision latérale et réappliquer les îlots.
   REMARQUE : De temps en temps, des bulles d’air introduites peuvent être utilisées comme supports d’espace.
6. Appliquez du gel pour les yeux sur l’œil, desserrez les forceps qui retiennent les yeux et laissez la souris sur l’isoflurane dans la même position pendant 8 à 10 min pour laisser les îlots se mettre.
7. Retirez les forceps qui tiennent la paupière et remettez la paupière à sa position normale.
8. Retirez la souris du support de la tête et transférez-la dans une cage de réveil.
9. Lorsque la souris est éveillée et en mouvement, transférez-la dans la cage d’origine et gardez-la dans le logement pour animaux jusqu’à ce qu’elle soit scannant (au moins 5 jours sont recommandés).

5. Imagerie des îlots humains implantés par microscopie 2-photon

REMARQUE : Il est recommandé de prendre des images d’ensemble de l’œil à l’aide d’un microscope stéréoscopique fluorescence (figure 2a– c) 4 à 5 jours après la transplantation avant l’imagerie 2-photons pour localiser les îlots d’intérêt. Évitez de retenir l’œil trop étroitement si tôt après la transplantation. Utilisez l’imagerie 2-photon 6–7 jours après la transplantation.

1. Démarrez le logiciel d’acquisition d’images(voir Tableau des matériaux ). Dans le menu "Laser" activer le laser Mai Tai (Power "ON« ) et dans le menu "Light Path" définissent la longueur d’onde à 900 nm et appliquent une puissance laser de transmission minimale à partir de 5%–10% de puissance laser (utiliser des curseurs).
   REMARQUE : Lors de la numérisation, réglez la puissance laser au besoin.
2. Placez les canaux verts, oranges et rouges. Recueillir simultanément la lumière d’émission sur trois détecteurs non à inspire (NDD) à l’aide d’un miroir dichronique (LBF 760) et des informations sur les filtres d’émission comme suit : Rouge/Angiosense 680, 690–730 nm; Vert/Autofluorescence, 500–550 nm; et Orange/Tomate, 565–610nm (figure 2d).
3. Placez la scène du support de tête sur le stade du microscope motorisé et connectez le masque à gaz au tube de la machine d’anesthésie et aux tubes reliés au système de ventilation. Allumez le coussin chauffant.
4. Anesthésiez la souris destinataire, transférez à la plate-forme du support de tête, retenez l’œil pour l’imagerie et administrez la solution de buprénorphine comme décrit ci-dessus (étapes 3.1–3.5).
5. Ajuster les vapeurs d’isoflurane au besoin. Un taux d’haleine de ~55–65 respirations par minute (bpm) indique une anesthésie optimale. Si l’anesthésie est trop profonde, le taux sera de <50 bpm avec une respiration lourde ou haletant; si trop léger, le taux sera >70 bpm avec une respiration superficielle. Surveillez attentivement les souris pendant l’anesthésie par inspection visuelle toutes les 15 minutes.
   NOTE : L’anesthésie varie d’une souris à l’autre, entre les souches de souris, et au fur et à mesure que le temps sous anesthésie progresse¹³.
6. Administrer suffisamment de gel pour les yeux sur l’œil comme liquide d’immersion entre la cornée et la lentille, ce qui lui permet de s’accumuler lentement(figure 2f, insérer). Évitez les bulles d’air.
   REMARQUE : L’éclairage latéral avec une lampe flexible de tuyau en métal est recommandé pour ajuster la mise au point et localiser les greffes d’îlot.
7. Pour visualiser les vaisseaux sanguins, administrer 100 μL de l’agent d’imagerie (p. ex., Angiosense 680) par voie intraveineuse dans la veine de la queue à l’aide d’une seringue jetable d’insuline 30 G.
8. Enmode " Acquisition« , ajuster la taille du cadre à 512 x 512 et la vitesse de numérisation.
   REMARQUE : Des analyses plus lentes (c.-à-d. augmentation du temps d’habitation) amélioreront le rapport signal/bruit.
9. Dans le menu "Canaux« , ajustez Master Gain pour chaque PMT en Volts afin d’amplifier le signal jusqu’à ce qu’une image soit vue à l’écran en mode numérisation en direct. Plus cette valeur est élevée, plus le détecteur devient sensible au signal et au bruit.
   REMARQUE : De préférence, gardez les valeurs entre 500 et 800 V.
10. Dans le menu «Z-stack», définissez le début et la fin de la pile z en déplaçant manuellement la mise au point vers le haut de la greffe d’îlot. Enregistrer la position en sélectionnant "Set First« . Passez au dernier plan inférieur qui peut être concentré dans la greffe de l’îlot et enregistrez la position en sélectionnant «Set Last». Utilisez une taille z-step de 2 μm.
11. Collectez la pile d’images finale en cliquant sur l’onglet «Démarrer l’expérience» et enregistrez sous forme de fichier CZI 8 bits (c.-à-d. le format Carl Zeiss).

6. Imagerie des îlots humains implantés par microscopie confocale

REMARQUE : Le volume total, la morphologie et la plasticité des îlots transplantés peuvent être évalués en surveillant le signal de diffusion in vivo dans un balayage séparé (c.-à-d. une voie séparée) par détection de la lumière rétrodiffusion laser¹⁰.

1. Retirez le séparateur de faisceau principal (c.-à-d. filtre LBF) et dans le dialogue «Voie lumineuse» a mis en place une piste distincte pour l’imagerie confocale. Choisissez le laser Argon avec une longueur d’onde de 633 nm et la détection à la même longueur d’onde que la lumière laser. Les piles Z sont acquises avec une taille d’étape de 2 à 3 μm pour le signal lumineux rétrodiffusion.
2. Réajuster les paramètres de la pile z pour vous assurer d’enregistrer l’ensemble de l’îlot (voir l’étape 5.10).
3. Acquérir la pile d’images et enregistrer sous forme de fichier CZI 8 bits.

7. Analyse d’image

REMARQUE : Un logiciel commercial (voir tableau des matériaux)a été utilisé pour cette étape.

1. Suppression de l’autofluorescence des îlots (Figure 3b)
   1. Dansl’onglet " Traitement d’image" choisissez "Channel arithmétique" et tapez "ch1-ch2« . Cela crée un nouveau canal 4 (ch 4); renommer "Vasculature« .
      REMARQUE : Le canal Vert/Autofluorescence est soustrait du canal Red/Angiosense.
   2. Répétez l’étape précédente et tapez «ch3-ch2» pour créer un nouveau canal (ch 5); renommer "Tomate (tous) « .
      REMARQUE : Le canal Vert/Autofluorescence est soustrait du canal Orange/Tomate.
2. Définition du masque d’îlot par dessin manuel (Figure 3c)
   1. Créez une nouvelle surface (symbole bleu) et dans l’Assistant choisissez "Modifier manuellement« . Gardez le pointeur en mode "Sélectionner" et en vue 3D unclick "Volume" (sous Scène) pour visualiser les sections.
   2. Pour faciliter la discrimination aux frontières des îlots, activez tous les canaux, y compris le ch 1–ch 3.
      REMARQUE : Le canal Orange/Tomate est utile pour définir les bordures d’îlots par le signal de la capsule Tomato. Alternativement, augmenter les intensités de canal pour utiliser l’autofluorescence multicanal d’îlot et le signal de fond de détecteur comme orientation.
   3. Dans l’onglet "Dessin" choisissez "Contour" et cliquez sur "Dessiner" pour commencer à dessiner les contours autour de la bordure de l’îlot à partir de la position de tranche 1.
   4. Passez à une nouvelle position de tranche et répétez les contours du dessin. Terminez avec la dernière tranche sur le dessus de l’îlot et terminez en cliquant sur l’onglet «Créer une surface». Habituellement, il suffit de dessiner des contours toutes les^{10 e} tranche.
3. Segmentation de la «vasculature d’îlot» et de la fluorescencede la « tomate islet» à l’aide d’un masque d’îlot ( figure3d).
   1. Choisissez l’objet «Masque d’îlot» précédemment défini, accédez à l’onglet d’édition (symbolede crayon) et cliquez sur l’onglet «Masque tous», qui ouvre une nouvelle fenêtre.
   2. Choisissez le canal précédemment nommé "Vasculature" (ch 4) dans le menu déroulant de sélection de canal et activez les options "Double-canal avant d’appliquer le masque« , "Constant inside/outside« , et définissez voxels extérieur à "0.000« , ce qui crée un nouveau canal; renommer "Islet vascularature" (ch 6).
   3. Répétez les étapes 7.3.1 et 7.3.2 et choisissez le canal précédemment créé "Tomate (tous) " (ch 5) dans le menu déroulant sélection de canal pour créer le nouveau canal ; renommer "Islet tomate" (ch 7).
4. Rendu de surface de la vasculature des îlots (Figure 3e)
   1. Créez une nouvelle surface dans le menu «Scène» et dans l’Assistant, choisissez «Création automatique».
   2. Définissez le canal source sur la «vascularature de l’îlot» créée précédemment (ch 6) et choisissez la soustraction d’arrière-plan. L’estimation automatique du seuil peut être ajustée si nécessaire. Comparez au canal de fluorescence répondant (p. ex., en mélangeant l’onglet surface nouvellement créé). Procédez dans l’Assistant.
   3. En option, utilisez des filtres. Par exemple, choisissez «Volume» et réglez le filtre (jaune) dans la fenêtre, qui peut supprimer les objets de surface sélectionnés. Terminez l’assistant et nommez le nouvel objet de surface «Vase vascularature d’îlot».
5. Segmentation du signal de fluorescence dela « vasculature de tomate d’îlot» (Figure 3f)
   1. Dans l’objet de surface «Vaset vascularature » précédemment créé, accédez à l’onglet édition et cliquez sur l’onglet «Masque tous», qui ouvre une nouvelle fenêtre.
   2. Choisissez le canal précédemment nommé "Islet tomate" (ch 7) dans le menu déroulant de sélection de canal et définissez voxels extérieur surface à "10.000« , qui crée le nouveau canal; renommer "Vasecularature de tomate d’Islet" (ch 8).
6. Segmentation du signal de fluorescence dela « capsule de tomate»(figure 3g)
   1. Choisissez "Channel Arithmetic’s" dans l’onglet "Traitement d’image" et tapez "ch7-ch8« , créant le nouveau canal; renommer "Capsule de tomate" (ch 9).
      NOTE: Le signal de fluorescence dela " vasculature de tomate d’îlot" est soustrait du signal total de fluorescence dela tomate d’îlot.
7. Rendu de surface de "Vasecularature de tomate d’îlot" et "Capsule de tomate" ( Figure3h)
   1. Suivez l’étape 7.4, et dans l’Assistant choisissez les canaux source "Vasecularature de tomate d’îlot" (ch 8) ou "Capsule de tomate" (ch 9) pour créer de nouveaux objets de surface en conséquence.
8. Rendu de surface de la surface totale des îlots (Figure 3i)
   1. Ouvrez le fichier backsdatter de l’îlot et créez une nouvelle surface.
   2. Dans l’Assistant, choisissez «Création automatique» et définissez «Région d’intérêt».
      REMARQUE : «Région d’intérêt» est utilisée pour séparer les signaux de plusieurs îlots et pour définir la profondeur de l’îlot à analyser (p. ex., 75 μm supérieurs).
   3. En "intensité absolue" ajuster le seuil si nécessaire. L’objet de surface peut être cliqué sur ou en dehors pour recouper avec l’intensité correspondante du canal. Fermez l’Assistant.
9. Quantification (Figure 3j)
   1. Sélectionnez un objet de surface créé dans le menu «Scène» et accédez à l’onglet «Statistiques».
   2. Pour récupérer des données de volume détaillées dans l’objet de surface sélectionné, choisissez l’onglet «Détaillé» et sélectionnez «Valeurs spécifiques» et «Volume» dans le menu déroulant. Pour récupérer une valeur totale en volume de l’objet de surface sélectionné, accédez à l’onglet «Détaillé» et choisissez «Valeurs moyennes».

Résultats

Des îlots humains non étiquetés ont été transplantés dans l’ACE du NOD femelle de 8 semaines. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. ROSA-tomate. Rag2^−/−) souris destinataires. Pour empêcher le rejet de tissu humain, les souris knock-out immunodéficientes de Rag2 ont été choisies comme destinataires. Chez ces souris transgéniques, toutes les cellules et tissus ont exprimé une protéine de fluorescence de tomate (mT) ciblée par me...

Discussion

Une méthode est présentée pour étudier le processus de greffe de cellules d’îlot pancréatique humaine en observant la participation du tissu de destinataire et de donneur. Après une chirurgie invasive minimale implantant des îlots humains dans la chambre antérieure d’un œil de souris immunodéficient, la souris récupère rapidement dans les minutes qui s' adressent à la chirurgie. La procédure est effectuée sur un œil. En général, à partir de 5 à 7 jours après l’implantation, la cornée est suff...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M