생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

요약

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

초록

화상 진찰 베타 세포는 아일렛 이식을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 베타 세포 생물학의 기록을 위한 다른 화상 진찰 플랫폼이 개발되고 생체 내에서이용되고 있더라도, 단하나 세포 분해능 및 연속적인 세로 기록을 허용하는 측면에서 제한됩니다. 각막의 투명성 때문에 마우스내 눈의 전방 챔버(ACE)는 인간 및 마우스 췌장 세포 생물학을 연구하기에 적합합니다. 다음은 이 접근법이 개별 인간 적인 아슬렛 이식의 접목 및 개조의 연속적인 세로 기록을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 설명입니다. 인간 적인 아슬렛 이식편은 NOD를 사용하여 ACE에 삽입됩니다. (Cg)-Gt (ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-마우스를 받는 사람으로. 이것은 기증자 세포 대 수령인의 확장및 접목의 캡슐화 및 혈관화를 승진시키는 수신자 세포의 기여의 조사를 허용합니다. 또한, 배분부 또는 분할된 혈관분기 및 아슬레 캡슐 형성 수용자 세포의 이미지 분석 및 정량화를 위한 단계별 접근법이 설명된다.

서문

당뇨병 mellitus는 종종 인슐린 저항을 동반췌형 연하 베타 세포의 손실 또는 기능 장애에서 불충분 한 인슐린 생산의 결과로 혈당의 높은 수준을 특징으로 하는 대사 질환의 그룹을 설명합니다. 타입-1 (T1D) 및 타입-2 당뇨병 (T2D)는 베타 세포의 진보적인 기능 장애가 질병 발달을 일으키는 원인이 되는 복잡한 질병입니다. T1D는 베타 세포에 대한 자가 면역 공격에 의해 침전되고, T2D는 신진 대사 요인에 의해 구동되는 것으로 간주되는 반면, 저급 전신 염증^1의증가 증거이기는하지만. 기증자 인간 섬, 특히 T1D 환자에게 이식은 생리적 혈당 조절을 제공할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 그러나, 조직 기증자와 가난한 축 소 이식의 부족은 주류 치료 옵션이 될 수있는 islet 이식을 방지하고있다. 저산소, 염증성, 면역원성 숙주 환경^2,,3으로인해 즉각적인 이식 후 기간(24-48h)에서 기능성 축약 이식의 상당 부분이 손실된다. 섬 생존의 개선을 위한 개입 방법의 효율성을 평가하기 위해, 이러한 이식의 지속적인 모니터링이 필요하다.

이식 후 이식된 인간 췌장암의 운명을 이미지화하고 추적하는 생체기술에서 여전히 당뇨병 연구에 대한 도전으로 남아^{있다 4,,5.} 현재까지, 양성선 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI), 또는 초음파(미국)를 포함한 비침습적 이미징 기술은 실험 조건에서 이식된 섬의 정량화 및 기능적 평가가능성을^{보여준다 5.} However, given the small islet sizes, quantitative measurements by those modalities suffer from insufficient resolution. 관찰을 위한 이식 부위로서 눈의 전방 챔버(ACE)는 장기간에 걸쳐 효과적으로 더 높은 공간 해상도와 빈번한 모니터링을 제공하는 유망한 비침습적 이미징 솔루션이다^6. 이 방법은 마우스 개강 생물학(양외^7에서검토), 자가면역 반응^8,인간 유일 접목^9,,10을연구하기 위해 성공적으로 악용되었다.

여기서 ACE 이식 방법은 이식 후 최대 10개월 동안 개별 축약 이식에 대한 연속적이고 반복된 기록에 의한 인간 췌장 이식 과정의 역학을 조사하기 위한 2-광자 이미징 접근법과 결합된다. 더 큰 이미징 깊이의 다광 화상 진찰 특성및 감소된 전반적인 광표백 및 사진 손상은 공초점 현미경^{검사법 11의}화상 진찰 한계를 극복합니다. 형광 화상 진찰의 정량화는 islet 견본 준비, islet 이식, 화상 취득, 심상 여과를 포함하여 몇몇 단계를 관련시킵니다, 탈모 소음 또는 배경, 분할, 정량화 및 데이터 분석. 가장 어려운 단계는 일반적으로 이미지를 여러 부품 또는 영역으로 분할하거나 분할하는 것입니다. 예를 들어, 신호와 배경 잡음 또는 색상 또는 모양의 유사성에 따라 복셀의 클러스터링 영역을 분리하여 축화 를 나타내는 3D 볼륨의 복셀을 감지하고 레이블을 지정하는 것이 포함될 수 있습니다. 분할되면 개체 볼륨 크기와 같은 통계는 일반적으로 추출하기 간단합니다. 분할 및 데이터 시각화와 같은 이미징 데이터의 정량화 및 추출을 위한 방법이 제공된다. 특히 인간 섬에서 자가형광을 제거하고 아슬렛 혈관과 섬 캡슐 형성 수용자 세포를 구별하는 데 특별한 주의를 기울입니다.

프로토콜

스웨덴 룬드의 지역 윤리위원회는 인간과 관련된 연구의 윤리적 검토에 관한 법에 따라 연구를 승인했습니다. 동물 실험은 스웨덴동물 실험윤리에 따라 엄격하게 수행되었으며 말뫼와 룬드의 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 6~8주된 면역결핍 NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sor^tm4-Rag2^{-/ -} (NOD. 로사 토마토. Rag2^Rag2-/-받는 마우스는 인간^섬(10)의이식을 위한 수령인으로 사용되었다.

1. 이식을 위한 아일렛 준비

1. CMRL 1066의 문화 인간 섬은 10m HEPES로 보충, 2 mM L-글루타민, 50 μg/mL 젠타마이신, 0.25 μg/mL 균류존, 20 μg/mL 시프록스플로X락사신, 10mMM 니코티나미드(NIC), 10% 열활성 인간 혈청(NIC), 그리고 10% 열활성화 인간 혈청은 5%의 CO₂ 및 후압공기로^12°
   참고 : 섬은 외신 조직이 없어야하며 문화에서 서로를 만지지 않아야합니다. 엑소크리엔 조직은 반투명으로 나타납니다.
2. 이식 당일, 섬이 함유된 배양 배지를 당겨진 유리 모세혈관에 연결된 흡혈관 어셈블리를 사용하여 새로운 페트리 접시로 이송한다.
   참고: 또는 200 μL 파이펫을 사용하십시오. 페트리 접시의 뒷면을 착색하면 스테레오 현미경으로 섬을 보다 쉽게 구별할 수 있습니다.
3. 스테레오 현미경을 사용하여 이식당 ~20-40개의 섬을 선택하고 1.5mL 튜브로 옮김합니다. 인큐베이터의 문화 매체로 튜브를 맨 위에 채웁니다.
4. 파라핀 필름으로 튜브를 밀봉하고 이식 될 때까지 얼음에 저장합니다. 수행 된 이식 수에 대한 적절한 금액을 준비합니다.
5. 또는 수술실에서_CO2 인큐베이터를 사용할 수 있도록 배양섬을 유지하고 각 이식 직전에 바로 선택하십시오.

2. 이식 장비 및 수술 테이블 준비

참고: 모든 수술 도구는 자동 으로 사용되어야 하며 수술 테이블과 기기는 70%의 알코올로 소독되어야 합니다.

1. 입체 헤드 홀더를 코 마스크를 통해 마취에 연결하고 가열 패드를 켭니다.
2. 가스가 단단한 해밀턴 주사기를 폴리에틸렌 튜빙과 무딘 끝 눈 캐뉼라에 연결합니다.
   참고: 조립 하기 전에 PBS로 모든 부품을 채우는 것이 좋습니다. 갇힌 기포를 확인하고 있는 경우 제거합니다.
3. 해밀턴 주사기를테이블(도 1a)또는 이동식 베이스(도1e)에단단히 부착하고 캐뉼라가 매달려 있는 스테레오 현미경에 튜브를 부착합니다(예: 대기 위치).
   참고: 제거 및 다시 부착하기 쉽기 때문에 수술 용 테이프를 사용합니다.
4. 0.1 mg/kg 부프레노르핀 용액으로 채워진 30 G 바늘에 연결된 1mL 주사기를 준비합니다.
5. 멸균 PBS로 주사기를 준비합니다. 또는 파이펫을 사용하십시오.
6. 가열 램프가있는 깨끗한 모닝케이지를 따로 두십시오.

3. 마취 및 수술을위한 받는 마우스의 위치

참고: 모든 동물은 룬드 대학의 동물 시설에서 병원체가 없는 환경에서 사육되고 유지되었습니다.

1. 40% O 2/60% N_2/3%로채워진₂챔버에서 마우스를 마취시키고 마취된 마우스를 따뜻한 가열 패드(도1a)의헤드 홀더 플랫폼으로 이송한다. 페달 반사 신경의 부족을 확인합니다.
   참고: 이소플루란 마취는 수술 후 빠른 회복을 위한 마취의 바람직한 방법입니다. 현미경 방은 이소플루란을 사용하기 위해 제대로 환기해야합니다.
2. 마우스의 주미를 40% O 2/60% N₂2/0.9%-1.5% 이소플루란 마취기계에 연결된 마취 마스크에 넣습니다.₂ 엄지와 손가락을 사용하여 머리를 약간 들어 올리고 측면에있는 금속 조각을 사용하여 고정하십시오. 이어피스가 귀 바로 아래 머리를 고정하도록 합니다. 마우스 뒷면에 피하로 0.1 mg/kg 부프레노르핀 용액을 주입합니다.
   참고: 부프레노르핀은 진통제로 사용됩니다.
3. 머리를 기울여 서 작동할 눈이 위쪽으로 향하고 있으며 연구원과 가깝습니다.
4. 눈꺼풀을 부드럽게 철회하여 무딘 집게를 사용하여 이식하고, 눈을 뜨고, 핀셋한 쌍으로 느슨하게 고정합니다. 핀셋의 끝이 헤드 홀더플랫폼(도 1a,삽입)에 부착된 폴리에틸렌 튜브로 덮여 있는지 확인합니다.
5. 항상 눈에 멸균 PBS의 액적을 적용하여 두 눈을 젖은 유지.
6. 인간 섬은 밀폐된 1.5mL 튜브(section 1)에서 멸균 PBS를 가진 페트리 접시로 옮기고 섬이 서로 가까이 있는지 확인하여 전송된 세포 배양 매체의 양을 최소화한다(도1c).
7. 해밀턴 주사기에 폴리에틸렌 튜브를 통해 연결된 눈 캐뉼라에서 ~ 20-30개의 섬을 선택하십시오.
   참고: 섬으로 가능한 한 적은 액체를 섭취하십시오.
8. 튜브를 거꾸로 걸어 스테레오 현미경(도 1d)에부착합니다. 섬이 캐뉼라쪽으로 튜브의 끝에 가라앉을 수 있도록 튜브를 조심스럽게 테이프로 놓습니다.

4. 이식 절차

참고: 이 방법은 이전에 마우스 섬^6의이식에 대해 설명되었습니다. 약간 수정된 절차가 여기에 표시됩니다.

1. 뒷다리에 패드를 꼬집어 마우스가 잠들어 있는지 확인합니다.
2. 혈류를 방해하지 않고 눈을 억제하는 집게를 조이고 멸균 PBS의 액적을 눈에 적용합니다.
3. 25 G 바늘을 메스로 사용하여 위쪽으로 구부리며 각막에 있는 팁의 절반만 조심스럽게 침투하여 하나의 측면 절개를 합니다. 위쪽 각도로 구멍을 만듭니다. 구멍은 이식 후 더 쉽게 밀봉됩니다(도 1f).
4. 섬이 미리 로드된 캐뉼라로 각막을 조심스럽게 들어 올리고 천천히 눈에 섬으로 바립니다. 홍채의 손상을 방지하기 위해 전방 챔버에 캐뉼라를 삽입하지 말고 각막 개구부(도1g)에조심스럽게 밀어 넣습니다.  에이스에서 캐뉼라를 천천히 철회합니다.
   참고: 3-8 μL의 사출 부피를 목표로 합니다. 부피가 너무 크면 불필요하게 높은 내피압에 눈을 노출시키고 전방 챔버에서 주입 된 섬의 역류가 발생할 수 있습니다.
5. 안구 챔버의 압력 증가로 인해 섬 삽입에 어려움을 겪을 때 측면 절개 부위를 보강하고 섬을 다시 적용하여 절개 부위를 확대합니다.
   참고: 때때로 도입된 기포는 공간 홀더로 사용할 수 있습니다.
6. 눈젤을 눈에 바르고, 눈 절제 포셉을 풀고, 8-10분 동안 같은 위치에 마우스를 그대로 두어 섬이 세팅하도록 합니다.
7. 눈꺼풀을 들고 있는 집게를 제거하고 눈꺼풀을 정상 위치로 다시 놓습니다.
8. 머리 홀더에서 마우스를 제거하고 깨우기 케이지로 옮습니다.
9. 마우스가 깨어 있고 움직일 때 원래 케이지로 다시 옮기고 스캔할 때까지 동물 하우징에 보관하십시오(최소 5일 이상 권장).

5. 2 광자 현미경 검사법에 의해 이식 된 인간 섬의 이미징

참고: 2-광자 이미징 전에 이식 후 4~5일 동안 형광 입체현미경(도 2a–c)을사용하여 눈의 개요 영상을 촬영하여 관심 있는 섬을 국소화하는 것이 좋습니다. 이식 후 일찍 눈을 너무 단단히 억제하지 마십시오. 이식 후 6-7일 동안 2-광자 이미징을 사용하십시오.

1. 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다(재료 표참조). "레이저"메뉴에서는 마이타이 레이저(Power"ON")를활성화하고"라이트 패스"메뉴에서 파장을 900nm로 설정하고 5%-10% 레이저 파워(슬라이더 사용)로 시작하는 최소한의 전송 레이저 파워를 적용한다.
   참고: 스캔하는 동안 필요에 따라 레이저 전원을 조정합니다.
2. 녹색, 주황색 및 빨간색 채널을 설정합니다. 다음과 같이 비단열성 거울(LBF 760) 및 배출 필터 정보를 사용하여 3개의 비다산 검출기(NDD)에 동시에 방출 광을 수집합니다: 레드/안지오센스 680, 690-730 nm; 녹색/자동 불발성, 500-550 nm; 오렌지/토마토, 565-610nm(그림 2d).
3. 헤드 홀더 스테이지를 전동 현미경 단계에 놓고 방독면을 마취 기계의 튜브및 환기 시스템에 연결된 튜브에 연결합니다. 가열 패드를 켭니다.
4. 수신자 마우스를 마취하고, 헤드 홀더 플랫폼으로 이송하고, 이미징을 위해 눈을 억제하고, 위에서 설명한 바와 같이 부프레노르핀 용액을 관리한다(단계 3.1-3.5).
5. 필요에 따라 이소플루란 증기를 조정합니다. 분당 ~55-65의 호흡 속도(bpm)는 최적의 마취를 나타냅니다. 마취가 너무 깊으면, 속도는 무거운 호흡 또는 헐떡거리는 것으로 <50 bpm이 될 것입니다. 너무 가벼우면 피상호흡이 있는 >70 bpm이 됩니다. 15분마다 육안 검사를 통해 마취 중 마우스를 주의 깊게 모니터링합니다.
   참고: 마취는 마우스에서 마우스, 마우스 균주 사이, 그리고 마취에 따른 시간이^13로진행됨에 따라 다릅니다.
6. 각막과 렌즈 사이에 침지 액체로서 눈에 충분한 눈 젤을 투여하여 천천히 축적할 수있습니다(그림 2f,삽입). 기포를 피하십시오.
   참고: 유연한 금속 호스 램프가 있는 측면 조명은 초점을 조정하고 섬 이식편을 국소화하는 것이 좋습니다.
7. 혈관을 시각화하려면 일회용 인슐린 30 G 주사기를 사용하여 화상 진찰제(예를 들어, Angiosense 680)의 100 μL을 정맥내로 투여한다.
8. "획득 모드에서"512 x 512 및 스캔 속도로 프레임 크기를 조정합니다.
   참고: 느린 스캔(예: 거주 시간 증가)은 신호 대 잡음 비율을 향상시킵니다.
9. "채널"메뉴에서는 볼트의 각 PMT에 대한 마스터 게인을 조정하여 라이브 스캐닝 모드에서 이미지가 화면에 보일 때까지 신호를 증폭시합니다. 이 값이 높을수록 검출기가 신호및 소음에 더 민감해집니다.
   참고: 바람직하게는 값을 500-800 V 사이로 유지합니다.
10. "Z-스택"메뉴에서 포커스를 수동으로 아일렛 접목의 맨 위로 이동하여 z 스택의 시작과 끝을 정의합니다. "먼저 설정"을 선택하여 위치를저장합니다. "마지막 설정"을 선택하여 islet 접목에 초점을 맞출 수 있는 마지막 하단 평면으로 이동하여 위치를저장합니다. 2 μm의 z 단계 크기를 사용합니다.
11. "실험시작"탭을 클릭하여 최종 이미지 스택을 수집하고 8비트 CZI(즉, 칼 자이스 형식) 파일로 저장합니다.

6. 공초점 현미경 검사법에 의한 이식된 인간 섬 의 이미징

참고: 이식된 섬의 총 부피, 형태 및 가소성은 레이저 백스캐터^{라이트(10)를}검출하여 별도의 스캔(즉, 별도의 트랙)에서 생체 내 산란 신호를 모니터링하여 평가할 수 있다.

1. 메인 빔 스플리터(즉, LBF 필터)를 꺼내"라이트 패스"대화 상자에서 공초점 이미징을 위한 별도의 트랙을 설정합니다. 633 nm의 파장이있는 아르곤 레이저를 선택하고 레이저 빛과 동일한 파장에서 감지하십시오. Z 스택은 백스캐터 광 신호를 위해 2-3 μm의 단계 크기로 획득됩니다.
2. 전체 이면에 있는 내용을 기록하려면 z 스택 설정을 재조정합니다(5.10단계 참조).
3. 이미지 스택을 획득하고 8비트 CZI 파일로 저장합니다.

7. 이미지 분석

참고: 상업용 소프트웨어(재료 표참조)가 이 단계에 사용되었습니다.

1. 제거 된 islet 자동 불발(그림 3b)
   1. 「이미지 처리」에서 탭 선택 「채널 산술 」과타입 「ch1-ch2」. 이렇게 하면 새 채널 4(ch 4)가 생성됩니다. "혈관"으로 이름을바꿉니다.
      참고: 녹색/자동 불발 채널은 빨간색/혈관 감각 채널에서 빼됩니다.
   2. 이전 단계를 반복하고"ch3-ch2"를입력하여 새로운 채널(ch 5)을 만듭니다. "토마토 (모두)"로이름을 바꿉니다.
      참고: 녹색/자동 형광 채널은 오렌지/토마토 채널에서 빼됩니다.
2. 수동 도면으로 이스릿 마스크 정의(도 3c)
   1. 새 표면(파란색 기호)을 만들고 마법사에서"수동으로 편집"을 선택합니다. "선택"모드로 포인터를 유지하고 3D 보기에서"볼륨"(장면아래)을 클릭 해제하여 섹션을 시각화합니다. Scene
   2. 쉽게 이면 국경 차별을 원하기 위해 ch 1-ch 3를 포함한 모든 채널을 활성화하십시오.
      참고: 오렌지/토마토 채널은 토마토 캡슐 신호로 이점 테두리를 정의하는 데 유용합니다. 또는 멀티채널 islet 자동 형광 및 검출기 배경 신호를 지침으로 사용하기 위해 채널 강도를 늘립니다.
   3. "드로잉"탭에서"윤곽"을선택하고"그리기"를클릭하여 슬라이스 위치 1에서 시작하여 개국 테두리 주위에 윤곽을 그리기 시작합니다.
   4. 새 슬라이스 위치로 이동하고 드로잉 윤곽을 반복합니다. "표면만들기"탭을 클릭하여 마지막 슬라이스로 마무리하고 끝작입니다. 일반적으로 10 번째 슬라이스마다 윤곽을 그리는 것으로^{충분합니다.}
3. "아슬렛 혈관 "및"아슬렛 토마토"형광을 사용하여 착질(도 3d)의세분화.
   1. 이전에 정의된"Islet 마스크"객체를 선택하고 편집탭(연필 기호)으로 이동하여 새 창을 여는"모든 "마스크"탭을 클릭합니다.
   2. 채널 선택 드롭다운 메뉴에서 이전에 명명된 채널"Vasculature"(ch 4)를 선택하고 옵션을 활성화 "중복 채널 마스크를 적용하기 전에","상수 내부/ 외부",그리고"0.000"로외부 의 복셀을 설정, 새로운 채널을 만드는; "이슬화 혈관 "(ch6)으로 이름을 바꿉니다.
   3. 7.3.1 및 7.3.2 단계를 반복하고 채널 선택 드롭 다운 메뉴에서 이전에 만든 채널"토마토 (모두)"(ch5)를 선택하여 새 채널을 만듭니다.all "아일렛토마토"(ch 7)로 이름을 바꿉니다.
4. 아슬렛 혈관의 표면 렌더링(그림 3e)
   1. "장면"메뉴에서 새 표면을 만들고 마법사에서"자동 생성"을선택합니다.
   2. 소스 채널을 이전에 만든"Islet vasculature"(ch 6)로 설정하고 배경 빼기를 선택합니다. 필요한 경우 자동 임계값 추정을 조정할 수 있습니다. 응답형광 채널(예: 새로 생성된 표면 탭을 혼합/내)과 비교합니다. 마법사에서 진행합니다.
   3. 선택적으로 필터를 사용합니다. 예를 들어 "볼륨"을선택하고 선택한 표면 객체를 제거할 수 있는 창에서 필터(노란색)를 조정합니다. 마법사를 완료하고 새 표면 오브젝트"Islet vasculature"의 이름을 지정합니다.
5. "아일렛 토마토 혈관 "형광 신호(도 3f)
   1. 이전에 만든"Islet vasculature" 표면 오브젝트에서 편집 탭으로 이동하여 새 창을 여는"모든 "마스크"탭을 클릭합니다.
   2. 채널 선택 드롭 다운 메뉴에서 이전에 명명 된 채널"아일렛 토마토"(ch 7)를 선택하고 새로운 채널을 만드는"10.000"로표면 외부 의 복셀을 설정; "아슬렛 토마토 혈관 "(ch8)으로 이름을 바꿉니다.
6. "토마토캡슐"형광 신호(도 3g)의세분화
   1. "채널산술의"를선택 "이미지 처리"탭 및 유형 "ch7-ch8",새로운 채널을 만드는; 「토마토캡슐」(ch 9)으로 이름을 바꿉니다.
      참고 :"아슬렛 토마토 혈관 "형광 신호는 총"아슬렛 토마토"형광 신호에서 빼는다.
7. "아슬렛 토마토 혈관 "과"토마토 캡슐"의표면 렌더링 "(그림3h)
   1. 7.4단계를 따르고, 마법사에서 소스 채널을 선택하여"아슬렛 토마토 혈관 "(ch 8) 또는"토마토캡슐"(ch 9)을 선택하여 그에 따라 새로운 표면 물체를 만듭니다.
8. 총 아틀릿 표면의 표면 렌더링(그림 3i)
   1. 이스렛 백스캐터 파일을 열고 새 표면을 만듭니다.
   2. 마법사에서"자동 생성"을선택하고"관심 영역"을정의합니다.
      참고 :"관심 영역"은여러 섬의 신호를 분리하고 분석 할 섬의 깊이를 정의하는 데 사용됩니다 (예를 들어, 상위 75 μm).
   3. "절대 강도"가 필요한 경우 임계 값을 조정합니다. 서피스 오브젝트를 클릭하거나 끄면 해당 채널 강도를 교차 확인할 수 있습니다. 마법사를 닫습니다.
9. 정량화(그림 3j)
   1. "장면"메뉴에서 생성된 서피스 오브젝트를 선택하고"통계"탭으로 이동합니다.
   2. 선택한 표면 개체에서 자세한 볼륨 데이터를 검색하려면"자세한"탭을 선택하고 드롭다운 메뉴에서"특정 값"과"볼륨"을선택합니다. 선택한 표면 오브젝트의 총 볼륨 값을 검색하려면"상세"탭으로 이동하여"평균 값"을 선택합니다.

결과

표지되지 않은 인간 섬은 8주된 여성 NOD의 ACE로 이식되었다. (Cg)-Gt (ROSA)26Sor^tm4-Rag2^{-/ -}(NOD. 로사토마토. Rag2^-/−)받는 쥐. 인간 조직 거부를 방지하기 위해 면역형 Rag2 녹아웃 마우스를 수령인으로 선택하였다. 이러한 형질전환 마우스에서, 모든 세포와 조직은 수령인과 기증자 조직의 명확한 식별을 허용하는 막 표적 토마토 형광 단백질 (mT)?...

토론

수급자와 기증자 조직의 개입을 관찰하여 인간 췌장 세포 이식 과정을 연구하는 방법이 제시된다. 면역 결핍 마우스 눈의 전방 챔버에 인간 섬을 이식 하는 최소한의 침습 수술 후, 마우스 는 수술 후 분 이내에 신속 하 게 복구. 절차는 한쪽 눈에 수행됩니다. 일반적으로, 5-7 일 이후 이식 후 각막은 충분히 인트인트 이미징을 수행 하기 위해 치유.

이 프로토콜에서는 인간 적?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M