Продольные изображения In Vivo и количественная оценка человека поджелудочной железы островок прививки и содействия принимающих клеток в передней камере глаза

Резюме

Цель этого протокола состоит в том, чтобы постоянно контролировать динамику процесса отбора островков поджелудочной железы человека и способствующих принимающей против донорских клеток. Это достигается путем пересадки человеческих островков в переднюю камеру глаза (ACE) НОД. (Cg)-Gt (ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-получатель мыши с последующим повторным 2-фотонных изображений.

Аннотация

Изображение бета-клеток является ключевым шагом на пути к пониманию трансплантации островка. Хотя различные платформы визуализации для записи биологии бета-клеток были разработаны и использованы in vivo,они ограничены с точки зрения разрешения одной клетки и непрерывных продольных записей. Из-за прозрачности роговицы, передняя камера глаза (ACE) у мышей хорошо подходит для изучения человека и мыши поджелудочной железы островка биологии клеток. Вот описание того, как этот подход может быть использован для выполнения непрерывных продольных записей прививки и реваскуляризации отдельных человеческих островк трансплантатов. Человеческие островки трансплантаты вставляются в ACE, используя NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sor^tm4-Rag2^{-/- мыши}в качестве получателей. Это позволяет провести исследование расширения реципиентных и донорских клеток и внести вклад клеток-реципиентов в содействие инкапсуляции и васкуляризации трансплантата. Кроме того, изложен пошаговая подход к анализу изображений и количественной оценке объема островка или сегментированных сосудов и островковых капсул, образующих клетки-получатели.

Введение

Сахарный диабет описывает группу метаболических заболеваний, характеризующихся повышенным уровнем глюкозы в крови, как результат недостаточной выработки инсулина в результате потери или дисфункции бета-клеток островков поджелудочной железы, часто сопровождаемых резистентностью к инсулину. Тип 1 (T1D) и диабет типа 2 (T2D) являются сложными заболеваниями, при которых прогрессирующая дисфункция бета-клеток вызывает развитие болезни. T1D осаждается аутоиммунной атаки на бета-клетки, в то время как T2D считается обусловлен метаболических факторов, хотя и с увеличением доказательств низкосортного^{системного воспаления 1}. Трансплантация донорских человеческих островков, особенно пациентам с Т1Д, дает возможность обеспечения физиологического гликемического контроля. Тем не менее, нехватка доноров тканей и бедных островок engraftment предотвратил островок трансплантации, чтобы стать основным терапевтическим вариантом. Значительная часть функционального пересадки островка теряется в непосредственной посттрансплантации (24-48 ч) из-за гипоксической, воспалительной, иммуногенной^{среды хозяина 2,,3}. Для оценки эффективности методов вмешательства для повышения выживаемости островка необходим постоянный мониторинг таких трансплантаций.

In vivo методы для изображения и отслеживания судьбы пересаженной человеческой поджелудочной железы островки после трансплантации по-прежнему остается проблемой для^{исследования диабета 4,5}. На сегодняшний день неинвазивные методы визуализации, включая позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ) или УЗИ (США), показывают потенциал для количественной и функциональной оценки пересаженных островков в^{экспериментальных условиях 5.} Однако, учитывая небольшие размеры островка, количественные измерения по этим условиям страдают от недостаточного разрешения. Передняя камера глаза (ACE) в качестве места трансплантации для наблюдения является перспективным неинвазивным решением для визуализации, предлагающим эффективно более высокое пространственное разрешение и частый мониторинг в течение длительных^{периодов времени 6.} Этот метод был успешно использован для изучения биологии островка мыши (рассмотрены в Ян и др.⁷), аутоиммунные^{иммунные реакции 8}, а также человека островок^{прививки 9,10}.

Здесь метод трансплантации ACE сочетается с 2-фотонной визуализацией для исследования динамики процесса пересадки островков поджелудочной железы человека путем непрерывных и повторных записей на отдельных островктных трансплантатах в течение 10 месяцев после трансплантации. Многофотонные свойства изображений большей глубины изображения и снижение общего фотоотливов и повреждения фото преодолеть ограничения изображения конфокальные микроскопии¹¹. Количественная оценка флуоресцентной визуализации включает в себя несколько этапов, включая подготовку островка образца, пересадку островка, получение изображений, фильтрацию изображений для удаления шума островка или фона, сегментацию, количественную оценку и анализ данных. Наиболее сложным шагом обычно является разделение или сегментация изображения на несколько частей или областей. Это может включать отделение сигнала от фонового шума или кластеризацию областей вокелей на основе сходства в цвете или форме для обнаружения и обозначения воксельов 3D-тома, который представляет собой островок сосудов, например. После сегментации статистические данные, такие как размеры объема объектов, обычно просты в извлечении. Предоставляется метод количественной оценки и извлечения данных изображений, таких как сегментация и визуализация данных. Особое внимание уделяется удалению аутофторесценции в человеческих островках и различию между островками сосудов и островковых капсул, образующих клетки-реципиенты.

протокол

Региональный комитет по этике в Лунде, Швеция, одобрил исследование в соответствии с Законом об этическом обзоре исследований с участием людей. Эксперименты на животных проводились в строгом соответствии со шведской этикой экспериментов на животных и были одобрены комитетами по этике Мальмё и Лунда. От 6 до 8 недель иммунодефицит NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. РОЗА-помидор. Rag2^-/-) мышей-реципиентов были использованы в качестве получателей для трансплантации человеческих^{островков 10}.

1. Островная подготовка к трансплантации

1. Культурные человеческие островки в CMRL 1066 дополнены 10 мМ HEPES, 2 мМ ЛП-глутамин, 50 мкг/мл гентамицин, 0,25 мкг/мл фунгизон, 20 мкг/мл ципрокслоксацина, 10 мМ никотинамид (NIC) и 10% теплоактивированной человеческой сыворотки при 37 градусах Цельсия в 5% CO_{2 и} увлажненной воздухе до трансплантации,^{как описано ранее 12}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Островки должны быть свободны от экзокринной ткани и не прикасаться друг к другу в культуре. Экзокринные ткани кажутся полупрозрачными.
2. В день трансплантации, передача культуры сми, содержащих островки в новую чашку Петри с помощью аспиратора трубки сборки подключен к вытащил стеклянный капилляр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте трубу из 200 мкл. Окраска задней части чашки Петри помогает сделать островки более легко различимыми под стерео микроскопом.
3. Используя стерео микроскоп, выберите островки по 20-40 евро за трансплантацию и перенесите в трубку 1,5 мл. Заполните трубку доверху культурными медиа из инкубатора.
4. Печать труб с парафиновой пленкой и хранить на льду до трансплантации. Подготовь соответствующую сумму для количества выполненных трансплантаций.
5. Кроме того, убедитесь, что инкубатор CO₂ доступен в хирургическом зале, чтобы сохранить островки в культуре и забрать их непосредственно перед каждой трансплантацией.

2. Подготовка оборудования для трансплантации и хирургического стола

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть автоматически, а хирургический стол и инструменты дезинфицированы 70% алкоголем.

1. Подключите стереотаксис к анестезии через маску для носа и включите грелку.
2. Подключите газовый шприц Гамильтона к полиэтиленовой трубе и тупой канюле для глаз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется заполнить все части PBS перед сборкой. Проверьте, в ловушке пузырьков воздуха и удалить, если присутствует.
3. Прикрепите шприц Гамильтона плотно к столу(рисунок 1a) или подвижному основанию(рисунок 1e)и прикрепите трубку к стерео микроскопу, с канюлей, свисающих (т.е. в положении ожидания).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте хирургическую ленту, потому что это легко удалить и прикрепить.
4. Приготовьте шприц 1 мл, подключенный к игле 30 G, наполненной раствором бупренорфина 0,1 мг/кг.
5. Приготовьте шприц со стерильным PBS. Кроме того, используйте пипетки.
6. Отложите в сторону чистую клетку для пробуждения с нагревательной лампой.

3. Анестезия и позиционирование мышей-реципиентов для хирургического вмешательства

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были выведены и поддерживались в среде, свободной от патогенов, на животных в Лундском университете.

1. Обезболить мышь в камере, наполненной 40% O₂/60% N₂/3% изофлюран и передать анестезированюю мышь на платформу держателя головы на теплой грелке (Рисунок 1a). Проверьте на отсутствие педалей рефлексов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлюран анестезия является предпочтительным методом анестезии для быстрого восстановления после операции. Комната микроскопа должна быть должным образом проветриваема для использования изофлюрана.
2. Поместите морду мыши в маску анестезии, подключенную к 40% O₂/60% N₂/0.9%-1.5% изофлюранная анестезия. Используйте большой палец и палец, чтобы поднять голову немного и закрепить его с помощью металлических частей по бокам. Убедитесь, что наушники зафиксировать голову прямо под ушами. Впрыснуть 0,1 мг/кг бупренорфин раствора подкожно на задней части мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин используется в качестве анальгетика.
3. Наклоните голову так, чтобы глаз, на который будет работать, обращен вверх и был близок к исследователю.
4. Аккуратно втягивайте веки глаза для пересадки с помощью тупых типсов, высовывайте глаз и свободно зафиксв их парой пинцетов. Убедитесь, что кончики пинцета покрыты полиэтиленовой трубкой, прикрепленной к платформе держателя головы(рисунок 1a, вставка).
5. Всегда держите оба глаза мокрыми, применяя каплю стерильных PBS на глаз.
6. Перенесите человеческие островки из запечатанной трубки 1,5 мл (раздел 1) в чашку Петри с стерильным PBS и убедитесь, что островки находятся близко друг к другу, чтобы свести к минимуму количество переданных средств массовой информации клеточнойкультуры (рисунок 1c).
7. Возьмите 20-30 островков в глазной канюле, соединенных через полиэтиленовые трубки со шприцем Гамильтона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите как можно меньше жидкости, как это возможно с островками.
8. Повесьте трубки вверх дном и прикрепите к стерео микроскопу(рисунок 1d). Лента трубки тщательно, чтобы островки опускаются до конца трубки к канюле.

4. Процедура трансплантации

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был ранее описан для трансплантации мышей островки⁶. Здесь представлена слегка измененная процедура.

1. Pinch колодки на задние ноги, чтобы убедиться, что мышь спит.
2. Затяните типсы, сдерживающие глаз, не нарушая кровоток и нанесите каплю стерильного PBS на глаз.
3. Используя 25 G иглы в качестве скальпеля, скошенный вверх, тщательно проникают только половина кончика в роговицу и сделать один боковой разрез. Сделайте отверстие в восходящем углу; отверстие будет печать легче после пересадки (Рисунок 1f).
4. Аккуратно поднимите роговицу с канюлей, предварительно нагруженной островками, и медленно нанесите островки в глаз. Избегайте вставки канюли в переднюю камеру, чтобы предотвратить повреждение радужной оболочки глаза, а нажать осторожно против отверстия роговицы (Рисунок 1g).  Медленно вытягивать канюлю из ACE.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель для объема инъекций 3-8 мл. Если объем слишком большой, он подвергнет глаз излишне высокому внутриглазное давление и может привести к рефлюксу вводимых островков из передней камеры.
5. При сталкиваются с трудностями с вставкой островков из-за повышенного давления в глазной камере, увеличить место разреза путем укрепления бокового разреза сайта и повторно островки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, введенные пузырьки воздуха могут быть использованы в качестве держателей пространства.
6. Нанесите гель для глаз на глаз, ослабьте глазоудерживающих типсов и оставьте мышь на изофлюране в том же положении в течение 8-10 минут, чтобы островки установить.
7. Снимите типсы, удерживав веко, и поставьте веко обратно в нормальное положение.
8. Снимите мышь с держателя головы и перенесите ее в клетку пробуждения.
9. Когда мышь проснется и движется, перенесите ее обратно в оригинальную клетку и держите в корпусе животного до сканирования (не менее 5 дней рекомендуется).

5. Изображение имплантированных человеческих островков с помощью 2-фотонной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Принимая обзор изображения глаза с помощью флуоресценции стереоскопический микроскоп (Рисунок 2a-c) 4-5 дней после трансплантации до 2-фотонной визуализации рекомендуется локализовать островки, представляющие интерес. Избегайте сдерживания глаз слишком плотно это рано после трансплантации. Используйте 2-фотонные изображения 6-7 дней после пересадки.

1. Запустите программное обеспечение для приобретения изображений (см. таблицу материалов). В меню«Лазер»активируется лазер Mai Tai (Power »ON» и в меню«Light Path»устанавливает длину волны до 900 нм и применяет минимальную мощность лазера передачи, начиная с 5%-10% лазерной мощности (использовать ползунки).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сканировании отрегулируйте мощность лазера по мере необходимости.
2. Установите зеленые, оранжевые и красные каналы. Сбор излучения света одновременно на трех недесканных детекторов (NDD) с помощью дихронического зеркала (LBF 760) и информации о фильтре выбросов следующим образом: Red/Angiosense 680, 690-730 nm; Зеленый/Автофлюоресценция, 500-550 нм; и оранжевый /помидор, 565-610nm(рисунок 2d).
3. Поместите ступень держателя головы на стадию моторизованного микроскопа и соедините газовую станцию с трубами анестезиологии и трубами, подключенными к вентиляционной системе. Включите грелку.
4. Обезботь мышь-получателя, перенести на платформу держателя головы, ограничить глаз для визуализации, и управлять бупренорфин решение, как описано выше (шаги 3.1-3.5).
5. Отрегулируйте изофлюрановые пары по мере необходимости. Скорость дыхания 55-65 вдохов в минуту (bpm) указывает на оптимальную анестезию. Если анестезия слишком глубокая, скорость будет lt;50 bpm с тяжелым дыханием или задыхаясь; если слишком легкий, скорость будет йgt;70 bpm с поверхностным дыханием. Тщательно следите за мышами во время анестезии при визуальном осмотре каждые 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия варьируется от мыши к мыши, между штаммами мыши, и, как время под наркозом прогрессирует¹³.
6. Администрирование достаточно глаз гель на глаз, как погружение жидкости между роговицей и хрусталиком, что позволяет ему медленно накапливаться(рисунок 2f, вставить). Избегайте пузырьков воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Боковое освещение с помощью гибкой металлической шланговой лампы рекомендуется регулировать фокус и локализовать островки.
7. Чтобы визуализировать кровеносные сосуды, введите 100 МКЛ агента визуализации (например, Angiosense 680) внутривенно в хвостовую вену с помощью одноразового инсулина 30 G шприц.
8. Врежиме «Приобретение»отрегулируйте размер кадра до 512 x 512 и скорость сканирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более медленное сканирование (т.е. увеличение времени обитаемого времени) улучшит соотношение сигнала к шуму.
9. В меню«Каналы» отрегулируйте Master Gain для каждого PMT в Вольтах, чтобы усилить сигнал до тех пор, пока изображение не будет видно на экране в режиме сканирования Live. Чем выше это значение, тем более чувствительным становится детектор для сигнала и шума.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно держать значения между 500-800 В.
10. Вменю «З-стек»определяют начало и конец z-стека, вручную перемещая фокус на верхнюю часть пересадки островка. Сохранить позицию, выбрав "Установить первый". Переместись к последней нижней плоскости, которая может быть сосредоточена в пересадке островка и сохранить положение, выбрав"Set Last". Используйте z-шаг размером 2 мкм.
11. Соберите окончательный стек изображений, нажав навкладку «Начатьэксперимент» и сохраните как 8-битный файл C'I (т.е. формат Карла Зейса).

6. Изображение имплантированных человеческих островков с помощью конфокальные микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем, морфология и пластичность пересаженных островков можно оценить путем мониторинга сигнала рассеяния in vivo в отдельном сканировании (т.е. отдельной дорожке) путем обнаружения лазерного заднего света¹⁰.

1. Вывите основной сплиттер луча (т.е. фильтр LBF) и вдиалоге «Светлыйпуть» навеяли отдельный трек для конфокальной визуализации. Выберите аргоновый лазер с длиной волны 633 нм и обнаружением на той же длине волны, что и лазерный свет. Стеки приобретаются с размером шага 2-3 мкм для сигнала света backscatter.
2. Скорректировать настройки z-stack, чтобы убедиться, что для записи всего островка (см. шаг 5.10).
3. Приобрети стек изображений и сохраните как 8-битный файл СЗИ.

7. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага использовалось коммерческое программное обеспечение(см. таблицу материалов).

1. Удаление островка аутофторесценции(рисунок 3b)
   1. В вкладке«Обработка изображений»выберите«арифметикуканала» и тип« ch1-ch2». Это создает новый канал 4 (ch 4); переименовать в"Васкулатуру".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый / Autofluorescence канал вычитается из красного / Angiosense канала.
   2. Повторите предыдущий шаг иввест «ch3-ch2»,чтобы создать новый канал (ch 5); переименовать в"Томат (все)".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый / Autofluorescence канал вычитается из оранжевого / томатный канал.
2. Определение островка маска ручного рисования (Рисунок 3c)
   1. Создайте новую поверхность (синий символ) и в мастере выберите" Редактировать вручную". Держите указатель в режиме«Выберите»и в 3D-представлении unclick «Volume» (под сценой)для визуализации разделов.
   2. Для облегчения дискриминации границ островка активируйте все каналы, включая ch 1-ch 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оранжевый / Томатный канал полезен для определения границ островка по сигналу капсулы томата. Кроме того, увеличение интенсивности каналов для использования многоканального островка автофлуоресценции и детектор фонового сигнала в качестве руководства.
   3. В вкладке«Рисунок»выберите«Контур»и нажмите«Draw»,чтобы начать рисовать контуры вокруг границы островка, начиная с позиции среза 1.
   4. Переместись в новое положение среза и повторите контуры рисования. Закончите с последним ломтиком в верхней части островка и в конце, нажав на вкладку«Создайтеповерхность». Обычно достаточно рисовать контуры каждые^{10-й срез.}
3. Сегментация"Островоклатура" и"Остров помидор"флуоресценцияс использованием островка маска(рисунок 3d).
   1. Выберите ранее определенный объект«Островнаямаска», перейдите на вкладкуредактирования (символ карандаша) инажмитена вкладку «Маска все», которая открывает новое окно.
   2. Выберите ранее названный канал «Vasculature»(ch 4) в меню высадки выбора канала и активируйте опции «Дубликатканала перед нанесением маски », «Constant inside/outside», и установите воксели снаружиповерхности до « 0.000», который создает новый канал; переименовать в" Остров сосуды "(ч 6).
   3. Повторите шаги 7.3.1 и 7.3.2 и выберите ранее созданный канал"Tomato (все)" (ch 5) в выборе канала падение вниз меню для создания нового канала; переименовать в"Остров помидор"(ч 7).
4. Поверхностная визуализация островка сосуда(рисунок 3e)
   1. Создайте новую поверхность вменю «Сцена»,а в волшебнике выберите«Автоматическое творение».
   2. Установите исходный канал для ранее созданной"Islet vasculature"(ch 6) и выберите фоновое вычитание. При необходимости можно скорректировать автоматическую оценку порогового значения. Сравните с ответным каналом флуоресценции (например, путем смешивания в/из недавно созданной вкладки поверхности). Продолжить в мастера.
   3. По желанию используйте фильтры. Например, выберите"Объем"и отрегулируйте фильтр (желтый) в окне, который может удалить выбранные объекты поверхности. Закончите мастера и назовите новый поверхностный объект "Islet vasculature".
5. Сегментация сигнала«Островная томатная сосуда»флуоресценции(рисунок 3f)
   1. В ранее созданном"Острове сосудов" поверхностного объекта перейдите на редактирование вкладки инажмитена вкладку "Маска все", которая открывает новое окно.
   2. Выберите ранее названный канал "Islet tomato" (ch 7) в выборе канала, опустите меню и установите воксельы внешней поверхности до" 10.000", который создает новый канал; переименовать в" Остров томатной сосуды "(ч 8).
6. Сегментация сигналафлуоресценции"Томатная капсула"(рисунок 3g)
   1. Выберите«Канал арифметика»ввкладке«Обработка изображений» итип « ch7-ch8», создавая новый канал; переименовать в"Томатнуюкапсулу" (ch 9).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналфлуоресценции томатов isletвычитается из общего сигнала флуоресценцииislet tomato.
7. Поверхностнаярендеринг " Остров томатной сосудоукалы" и "Томатнаякапсула " (Рисунок 3h)
   1. Следуйте шагу 7.4, и в мастере выберите исходные каналы «Islet tomato vasculature»(ch 8) или «Томатнаякапсула» (ch 9) для создания новых поверхностных объектов соответственно.
8. Поверхностная визуализация общей поверхности островка(рисунок 3i)
   1. Откройте файл backscatter островкаттера и создайте новую поверхность.
   2. В мастере выберите«Автоматическоетворение» и определите«Регион интересов».
      ПРИМЕЧАНИЕ:«Регион интереса»используется для раздяблить сигналы нескольких островков и определить глубину островка, который будет проанализирован (например, верхние 75 мкм).
   3. В"Абсолютной интенсивности"корректировать порог, если это необходимо. Поверхностный объект можно нажать или выключить, чтобы переутомиться с соответствующей интенсивностью канала. Закрой волшебника.
9. Количественная оценка(рисунок 3j)
   1. Выберите созданный объект поверхности вменю «Сцена»и перейдите навкладку «Статистика».
   2. Для получения подробных объемных данных в выбранном объекте поверхности выберите«Детальную»вкладку и выберите«Конкретныезначения» и«Том»из меню высадки. Чтобы получить общее значение объема выбранного поверхностного объекта, перейдите на вкладку«Подробная»и выберите«Средние значения».

Результаты

Не помеченные человеческие островки были пересажены в ACE 8-недельной самки NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. РОЗА-помидор. Rag2^(ru)мышей-реципиентов. Для предотвращения отторжения тканей человека, иммунодефицит Rag2 нокаут мышей были выбраны в качестве получат...

Обсуждение

Представлен метод изучения процесса пересадки клеток поджелудочной железы человека путем наблюдения за вовлечением реципиентной и донорской ткани. После минимальной инвазивной операции имплантации человеческих островков в переднюю камеру иммунодефицитного мышиного глаза, мышь бы?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M