Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.

Abstract

L'imaging delle cellule beta è un passo fondamentale verso la comprensione del trapianto di islet. Anche se diverse piattaforme di imaging per la registrazione della biologia delle cellule beta sono state sviluppate e utilizzate in vivo,sono limitate in termini di possibilità di risoluzione a singola cellula e registrazioni longitudinali continue. A causa della trasparenza della cornea, la camera anteriore dell'occhio (ACE) nei topi è adatta a studiare la biologia delle cellule dell'isolotto pancreatico umano e topo. Ecco una descrizione di come questo approccio può essere utilizzato per eseguire registrazioni longitudinali continue di innesto e revascolarizzazione di singoli innesti di isolotto umano. Gli innesti di isolotto umano vengono inseriti nell'ACE, utilizzando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-topi come destinatari. Ciò consente di sondare l'espansione delle cellule del ricevente rispetto a quelle del donatore e il contributo delle cellule riceventi nella promozione dell'incapsulamento e della vascolarizzazione dell'innesto. Inoltre, viene delineato un approccio passo-passo per l'analisi delle immagini e la quantificazione del volume dell'isolotto o della vascolatura segmentata e della capsula dell'isolotto che formano le cellule riceventi.

Introduzione

Il diabete mellito descrive un gruppo di malattie metaboliche caratterizzate da livelli elevati di glucosio nel sangue come risultato di una produzione insufficiente di insulina da perdita o disfunzione delle cellule beta delle isole pancreatiche, spesso accompagnate da insulino-resistenza. Il diabete di tipo 1 (T1D) e il diabete di tipo 2 (T2D) sono malattie complesse in cui la progressiva disfunzione delle cellule beta causa lo sviluppo della malattia. T1D è precipitato da un attacco autoimmune sulle cellule beta, mentre T2D è considerato guidato da fattori metabolici, anche se con crescente evidenza di infiammazione sistemica di basso^{grado 1}. Il trapianto di isolotti umani donati, in particolare ai pazienti affetti da T1D, offre il potenziale per fornire un controllo glicemico fisiologico. Tuttavia, la carenza di donatori di tessuti e la scarsa innesto di isoloti ha impedito che il trapianto di isolotto diventasse un'opzione terapeutica tradizionale. Una parte sostanziale dell'innesto dell'isolotto funzionale viene persa nell'immediato periodo post-trapianto (24-48 h) a causa dell'ambiente di ospite ipossico, infiammatorio e immunogenico^2,3. Per valutare l'efficienza dei metodi di intervento per il miglioramento della sopravvivenza delle isore, è necessario un monitoraggio continuo di tali trapianti.

Tecniche in vivo per immaginiare e tracciare il destino delle isole pancreatiche umane trapiantate dopo il trapianto rimane ancora una sfida per la ricerca sul^{diabete 4,5}. Ad oggi, le tecniche di imaging non invasive, tra cui la tomografia a emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (RTI) o gli ultrasuoni (US) mostrano il potenziale per la quantificazione e la valutazione funzionale delle isole trapiantate in condizioni^{sperimentali 5}. Tuttavia, date le piccole dimensioni degli isocchi, le misurazioni quantitative di tali modalità soffrono di una risoluzione insufficiente. La camera anteriore dell'occhio (ACE) come sito di trapianto per l'osservazione è una promettente soluzione di imaging non invasivo che offre una risoluzione spaziale efficace e un monitoraggio frequente per lunghi periodi^{di tempo 6}. Questo metodo è stato sfruttato con successo per studiare la biologia delle isole dei topi (recensito in Yang et al.⁷), le risposte immunitarie autoimmuni⁸, così come l'innesto dell'isolotto^{umano 9,10}.

Qui il metodo di trapianto ACE si combina con un approccio di imaging a 2 fotoni per studiare la dinamica del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano mediante registrazioni continue e ripetute su singoli innesti di isolotto fino a 10 mesi dopo il trapianto. Le proprietà di imaging multifoto di maggiori profondità di imaging e riduzione del fotobleaching complessivo e dei danni fotografici superano i limiti di imaging della microscopia confocale¹¹. La quantificazione dell'imaging fluorescente comporta diverse fasi, tra cui la preparazione del campione di isolotto, il trapianto di isolotto, l'acquisizione di immagini, il filtraggio delle immagini per rimuovere il rumore o lo sfondo delle isole, la segmentazione, la quantificazione e l'analisi dei dati. Il passaggio più impegnativo è in genere il partizionamento o la segmentazione di un'immagine in più parti o aree. Ciò potrebbe comportare la separazione del segnale dal rumore di fondo o il raggruppamento di regioni di voxel in base a somiglianze di colore o forma per rilevare ed etichettare i voxel di un volume 3D che rappresenta la vascolatura dell'isolotto, ad esempio. Una volta segmentate, le statistiche, ad esempio le dimensioni del volume degli oggetti, sono in genere semplici da estrarre. Fornito è un metodo per la quantificazione e l'estrazione dei dati di imaging, ad esempio la segmentazione e la visualizzazione dei dati. Particolare attenzione è prestata alla rimozione dell'autofluorescenza negli isolotti umani e alla distinzione tra vascolatura dell'isolotto e capsula isolotta che forma le cellule riceventi.

Protocollo

Il Comitato Etico Regionale di Lund, Svezia, ha approvato lo studio secondo la legge riguardante la revisione etica della ricerca che coinvolge gli esseri umani. Esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in stretta conformità con l'etica svedese degli esperimenti sugli animali e approvati dai comitati etici di Malma e Lund. NOD immunodeficiente di 6-8 settimane. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. ROSA-pomodoro. Rag2^-/-) topi ricevente sono stati utilizzati come destinatari per il trapianto di isolotti^{umani 10}.

1. Preparazione dell'isolotto per il trapianto

1. Isolotti umani di coltura in CMRL 1066 integrati con 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 gentamicina 20 g/mL, 0,25 funghi di 2,25 g/mL, 20 g/mL ciproxfloxacin, 10 mM nicotinamide (NIC) e siero umano inattivato al 10% a 37 gradi centigradi nel 5% di CO_{2 e} aria umida fino al trapianto, come descritto in^{precedenza 12}.
   NOTA: Le isole devono essere libere dal tessuto esocrino e non toccarsi in coltura. I tessuti esocrini appaiono traslucidi.
2. Il giorno del trapianto, trasferire i supporti di coltura contenenti le isole in un nuovo piatto Petri utilizzando un assemblaggio di tubi aspiratori collegato a un capillare di vetro tirato.
   NOTA: In alternativa, utilizzare una pipetta da 200 L. Colorare la parte posteriore del piatto Petri aiuta a rendere gli isolotti più facilmente distinguibili al microscopio stereo.
3. Utilizzando uno stereoscopio, scegliere isolotti da 20 a 40 dollari per trapianto e trasferirli in un tubo da 1,5 mL. Riempire il tubo verso l'alto con i mezzi di coltura dall'incubatore.
4. Sigillare i tubi con pellicola di paraffina e conservare sul ghiaccio fino al trapianto. Preparare una quantità adeguata per il numero di trapianti eseguiti.
5. In alternativa, assicurarsi che un_{incubatore di} CO 2 sia disponibile nella sala operatoria per mantenere le isole in coltura e raccoglierle immediatamente prima di ogni trapianto.

2. Preparazione delle attrezzature di trapianto e tavolo di chirurgia

NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere autoclavi e il tavolo operatorio e gli strumenti disinfettati con 70% di alcol.

1. Collegare un supporto della testa stereotassico all'anestesia tramite una maschera per il naso e accendere il pad di riscaldamento.
2. Collegare una siringa Hamilton gastight a tubi in polietilene e una cannula dell'occhio finale smussata.
   NOTA: si consiglia di riempire tutte le parti con PBS prima dell'assemblaggio. Controllare le bolle d'aria intrappolate e rimuovere se presente.
3. Collegare la siringa Hamilton saldamente al tavolo (Figura 1a) o una base mobile (Figura 1e) e collegare il tubo al microscopio stereo, con cannula appesa (cioè posizione di attesa).
   NOTA: Utilizzare nastro chirurgico, perché è facile da rimuovere e ricollegare.
4. Preparare una siringa da 1 mL collegata ad un ago da 30 G riempito con una soluzione di buprenorfina da 0,1 mg/kg.
5. Preparare una siringa con PBS sterile. In alternativa, utilizzare una pipetta.
6. Mettere da parte una gabbia di sveglia pulita con lampada riscaldante.

3. Anestesia e posizionamento dei topi riceventi per la chirurgia

NOTA: tutti gli animali sono stati allevati e mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni presso le strutture animali dell'Università di Lund.

1. Anestetizzare il topo in una camera riempita con 40% O₂/60% N₂/3% isoflurane e trasferire il mouse anestetizzato alla piattaforma portaodetti su un tampone riscaldante caldo (Figura 1a). Verificare la mancanza di riflessi del pedale.
   NOTA: L'anestesia isoflurane è il metodo preferito di anestesia per un rapido recupero dopo l'intervento chirurgico. La stanza del microscopio deve essere adeguatamente ventilata per l'uso di isoflurane.
2. Posizionare il muso del topo nella maschera di anestesia collegata al 40% O₂/60% N₂/0.9%–1.5% macchina per anestesia isoflurana. Utilizzare il pollice e il dito per sollevare leggermente la testa e fissarla utilizzando i pezzi metallici sui lati. Assicurarsi che gli auricolari fissino la testa direttamente sotto le orecchie. Iniettare 0,1 mg/kg di soluzione di buprenorfina sottocutaneamente sul retro del mouse.
   NOTA: Buprenorphine viene utilizzato come analgesico.
3. Inclinare la testa in modo che l'occhio da azionare è rivolto verso l'alto ed è vicino al ricercatore.
4. Ritrarre delicatamente le palpebre dell'occhio da trapiantare con pinze smussate, far uscire l'occhio e fissare liberamente con un paio di pinzette. Assicurarsi che le punte delle pinzette siano coperte da un tubo politene collegato alla piattaforma portariforme(Figura 1a, inserire).
5. Tenere sempre entrambi gli occhi bagnati applicando una gocciolina di PBS sterile sull'occhio.
6. Trasferire le isole umane dal tubo sigillato da 1,5 mL (sezione 1) a un piatto Petri con PBS sterile e assicurarsi che le isole siano vicine l'una all'altra per ridurre al minimo la quantità di supporti di coltura cellulare trasferiti(Figura 1c).
7. Raccogliere 20-30 isolotti nella cannula dell'occhio collegati tramite tubi di politene alla siringa Hamilton.
   NOTA: Prendere il meno liquido possibile con le isole.
8. Appendere il tubo a testa in giù e attaccare al microscopio stereo (Figura 1d). Nastro il tubo con attenzione per lasciare che le isole affondano alla fine del tubo verso la cannula.

4. Procedura di trapianto

NOTA: Questo metodo è stato precedentemente descritto per il trapianto di isolotti di topo⁶. Qui viene presentata una procedura leggermente modificata.

1. Pizzicare le pastiglie sulle zampe posteriori per assicurarsi che il mouse sia addormentato.
2. Stringere le forcepi trattenendo l'occhio senza interrompere il flusso sanguigno e applicare una goccia di PBS sterile sull'occhio.
3. Utilizzando un ago di 25 G come bisturi, smussare verso l'alto, penetrare con attenzione solo la metà della punta nella cornea e fare una singola incisione laterale. Fare il foro in un angolo verso l'alto; il foro si sigilla più facilmente dopo il trapianto (Figura 1f).
4. Sollevare con cura la cornea con la cannula precaricata con isolotti e applicare lentamente le isole nell'occhio. Evitare l'inserimento della cannula nella camera anteriore per evitare danni dell'iride, ma piuttosto spingere con attenzione contro l'apertura corneale (Figura 1g).  Ritrarre lentamente la cannula dall'ACE.
   NOTA: Obiettivo per un volume di iniezione di 3-8 L. Se il volume è troppo grande, esporrà l'occhio a una pressione intraoculare inutilmente elevata e può provocare il reflusso delle isole iniettate dalla camera anteriore.
5. Quando si affrontano difficoltà con l'inserimento degli isolotti a causa di una maggiore pressione nella camera degli occhi, ingrandire il sito di incisione rafforzando il sito di incisione lateralmente e riapplicare le isole.
   NOTA: Occasionalmente, le bolle d'aria introdotte possono essere utilizzate come detentori di spazio.
6. Applicare il gel per gli occhi all'occhio, allentare le forature che frenano gli occhi e lasciare il mouse sull'isoflurane nella stessa posizione per 8-10 min per far impostare le isole.
7. Rimuovere le forcepi tenendo la palpebra e rimettere la palpebra nella sua posizione normale.
8. Togliere il mouse dal supporto della testa e trasferirlo in una gabbia di sveglia.
9. Quando il mouse è sveglio e in movimento, trasferirlo nella gabbia originale e tenerlo nell'alloggiamento degli animali fino alla scansione (almeno 5 giorni sono raccomandati).

5. Imaging di isolotti umani impiantati mediante microscopia a 2 fotoni

NOTA: Si consiglia di localizzare le immagini panoramiche dell'occhio utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza (Figura 2a–c) 4-5 giorni dopo il trapianto prima dell'imaging a 2 fotoni per localizzare gli isolotti di interesse. Evitare di trattenere l'occhio troppo strettamente questo presto dopo il trapianto. Utilizzare l'imaging a 2 fotoni 6-7 giorni dopo il trapiantata.

1. Avviare il software di acquisizione delle immagini (vedere Tabella dei materiali). Nel menu "Laser" attivare il laser Mai Tai (Power "ON") e nel menu "Percorso luce" impostare la lunghezza d'onda a 900 nm e applicare una potenza laser di trasmissione minima a partire da 5%-10% potenza laser (utilizzare cursori).
   NOTA: durante la scansione, regolare la potenza del laser in base alle esigenze.
2. Impostare i canali verdi, arancioni e rossi. Raccogliere la luce di emissione simultaneamente su tre rilevatori non scansionati (NDD) utilizzando uno specchio dicronico (LBF 760) e le informazioni sul filtro delle emissioni come segue: Red/Angiosense 680, 690–730 nm; Verde/Autofluorescenza, 500-550 nm; e Arancione/Pomodoro, 565–610nm(Figura 2d).
3. Posizionare il supporto della testa sul microscopio motorizzato e collegare la maschera antigas al tubo della macchina di anestesia e tubi collegati al sistema di ventilazione. Accendere il pad di riscaldamento.
4. Anestetizzare il mouse destinatario, trasferire alla piattaforma del supporto della testa, trattenere l'occhio per l'imaging e somministrare la soluzione di buprenorfina come descritto sopra (passaggi da 3.1 a 3.5).
5. Regolare i vapori isoflurani in base alle esigenze. Una velocità di respiro di 55-65 dollari al minuto (bpm) indica un'anestesia ottimale. Se l'anestesia è troppo profonda, il tasso sarà <50 bpm con respirazione pesante o ansimante; se troppo leggero, il tasso sarà >70 bpm con respirazione superficiale. Monitorare attentamente i topi durante l'anestesia mediante ispezione visiva ogni 15 minuti.
   NOTA: l'anestesizzazione varia da mouse a mouse, tra le tensioni del mouse e con il passare del tempo sotto anestesia¹³.
6. Amministrare abbastanza gel per gli occhi sull'occhio come liquido di immersione tra la cornea e l'obiettivo, permettendogli di accumularsi lentamente (Figura 2f, inserto). Evitare le bolle d'aria.
   NOTA: Si consiglia di regolare la messa a fuoco e localizzare gli innesti di isolotti con una lampada flessibile in metallo.
7. Per visualizzare i vasi sanguigni, somministrare 100 L dell'agente di imaging (ad esempio, Angiosense 680) per via endovenosa nella vena della coda utilizzando una siringa usa e getta da 30 G.
8. In "Modalità di acquisizione" regolare la dimensione del fotogramma a 512 x 512 e la velocità di scansione.
   NOTA: scansioni più lente (cioè l'aumento del tempo di dimora) miglioreranno il rapporto segnale-rumore.
9. Nel menu "Canali" regolare Il guadagno principale per ogni PMT in Volts per amplificare il segnale fino a quando non viene visualizzata un'immagine sullo schermo in modalità di scansione dal vivo. Più alto è questo valore, più il rilevatore diventa sensibile al segnale e al rumore.
   NOTA: preferibilmente, mantenere i valori compresi tra 500 e 800 V.
10. Nel menu "z-stack" definire l'inizio e la fine della z-stack spostando manualmente lo stato attivo sulla parte superiore dell'innesto dell'isolotto. Salvare la posizione selezionando "Imposta prima". Spostarsi sull'ultimo piano inferiore che può essere messo a fuoco nell'innesto dell'isolotto e salvare la posizione selezionando"Imposta ultima". Utilizzare una dimensione del passo z di 2 m.
11. Raccogliere la pila di immagini finale facendo clic sulla scheda "Inizia esperimento" e salvare come file C'I a 8 bit (cioè il formato Carl .

6. Imaging di isolotti umani impiantati mediante microscopia confocale

NOTA: Il volume totale, la morfologia e la plasticità degli isolotti trapiantati possono essere valutati monitorando il segnale di dispersione in vivo in una scansione separata (ad esempio, traccia separata) rilevando la luce di backscatter laser¹⁰.

1. Togliere lo splitter del fascio principale (ad esempio, Filtro LBF) e nella finestra di dialogo "Percorso luce" impostare una traccia separata per l'imaging confocale. Scegliete il laser Argon con lunghezza d'onda di 633 nm e il rilevamento alla stessa lunghezza d'onda della luce laser. Le pile di z vengono acquisite con una dimensione di gradino di 2-3 m per il segnale di luce backscatter.
2. Modificare le impostazioni dello z-stack per assicurarsi di registrare l'intero isolotto (vedere il passaggio 5.10).
3. Acquisire la pila di immagini e salvare come file A 8 bit C.I.

7. Analisi delle immagini

NOTA: per questo passaggio è stato utilizzato ilsoftware commerciale (vedere Tabella dei materiali).

1. Rimozione dell'autofluorescenza dell'isolotto (Figura 3b)
   1. Nella scheda "Elaborazione immagine" scegliere "Aritmetica canale" e digitare "ch1-ch2". Questo crea un nuovo canale 4 (ch 4); rinominare come "Vasculature".
      NOTA: il canale Verde/Autofluorescenza viene sottratto dal canale Rosso/Angiosense.
   2. Ripetere il passaggio precedente e digitare "ch3-ch2" per creare un nuovo canale (ch 5); rinominare come "Pomodoro (tutti)".
      NOTA: il canale Verde/Autofluorescenza viene sottratto dal canale Orange/Tomato.
2. Definizione della maschera dell'isolotto mediante disegno manuale (Figura 3c)
   1. Creare una nuova superficie (simbolo blu) e nella procedura guidata scegliere "Modifica manualmente". Mantenere il puntatore in modalità "Seleziona" e nella vista 3D non fare clic su "Volume" (in Scena) per visualizzare le sezioni.
   2. Per una discriminazione più facile del confine delle isole, attivare tutti i canali, incluso ch 1–ch 3.
      NOTA: Il canale Arancione/Pomodoro è utile per definire i bordi delle isole dal segnale della capsula di pomodoro. In alternativa, aumentate le intensità del canale per utilizzare l'autofluorescence dell'isolotto multicanale e il segnale di fondo del rilevatore come guida.
   3. Nella scheda "Disegno" scegliere " Contorno "efare clic su "Disegna" per iniziare a disegnare i contorni intorno al bordo dell'isolotto a partire dalla posizione della sezione 1.
   4. Spostarsi in una nuova posizione di sezione e ripetere i contorni del disegno. Terminare con l'ultima sezione nella parte superiore dell'isolotto e terminare facendo clic sulla scheda "Creasuperficie ". Di solito è sufficiente disegnare contorni ogni^{10 th} fetta.
3. Segmentazione dellavascolatura" Islet " e del pomodoro "Islet "mediante la maschera dell'isolotto ( Figura3d).
   1. Scegliere l'oggetto "Maschera islet" definito in precedenza, passare alla scheda di modifica (simbolo dellamatita) e fare clic sulla scheda "Maschera tutto", che apre una nuova finestra.
   2. Scegliete il canale precedentemente denominato "Vasculature" (ch 4) nel menu a discesa di selezione del canale e attivate le opzioni "Duplica canale prima di applicare la maschera", " Costanteall'interno/esterno", e impostate i voxel all'esterno della superficie su "0.000", che crea un nuovo canale; rinominare come "Vasculature islet" (ch 6).
   3. Ripetere i passaggi 7.3.1 e 7.3.2 e scegliere il canale creato in precedenza "Pomodoro (tutti)" (ch 5) nel menu a discesa di selezione del canale per creare il nuovo canale; rinominare come "Pomodoro isolotto" (ch 7).
4. Rendering superficiale della vascolatura dell'isolotto (Figura 3e)
   1. Creare una nuova superficie nel menu "Scena" e nella procedura guidata scegliere "Creazione automatica".
   2. Impostare il canale di origine su "Islet vasculature" (ch 6) creato in precedenza e scegliere la sottrazione dello sfondo. Se necessario, è possibile regolare la stima automatica delle soglie. Confrontare con il canale di fluorescenza di risposta (ad esempio, fondendo o out la scheda della superficie appena creata). Procedere con la procedura guidata.
   3. Facoltativamente, utilizzare i filtri. Ad esempio, scegliere "Volume" e regolare il filtro (giallo) nella finestra, che può rimuovere gli oggetti di superficie selezionati. Completare la procedura guidata e denominare il nuovo oggetto superficie "Islet vasculature".
5. Segmentazione del segnaledi flusculaturadel pomodoro " (Figura3f)
   1. Nell'oggetto di superficie"Islet vasculature" creato in precedenza, passare alla scheda di modifica e fare clic sulla scheda "Maschera tutto", che apre una nuova finestra.
   2. Scegliere il canale precedentemente denominato "Pomodoro isolotto" (ch 7) nel menu a discesa di selezione del canale e impostare i voxel esterni alla superficie su "10.000", che crea il nuovo canale; rinominare come "vasculatura di pomodoro isolotto" (ch 8).
6. Segmentazione della "capsula di pomodoro" segnale di fluorescenza ( Figura3g)
   1. Scegliere "Channel Arithmetic" nellascheda "Elaborazione immagine" e digitare "ch7-ch8", creando il nuovo canale; rinominare come "Capsula di pomodoro" (ch 9).
      NOTA: il segnale difluorescenza" di pomodoro isolotto " viene sottrattodalsegnale totale di fluorescenza " pomodoro isolotto ".
7. Rendering superficiale di "Vasculaturedi pomodoro Islet " e "Capsula di pomodoro" ( Figura3h)
   1. Seguire il passaggio 7.4 e nella procedura guidata scegliere i canali di origine "vasculatura del pomodoro isolotto" (ch 8) o "Capsula di pomodoro" (ch 9) per creare nuovi oggetti di superficie di conseguenza.
8. Rendering superficiale della superficie totale dell'isolotto (Figura 3i)
   1. Aprire il file backscatter dell'isolotto e creare una nuova superficie.
   2. Nella procedura guidata scegliere "Creazione automatica" e definire " Regionedi interesse".
      NOTA: "Regione di interesse" viene utilizzato per separare i segnali di più isolotti e per definire la profondità dell'isolotto da analizzare (ad esempio, i primi 75 m).
   3. In "Intensità assoluta "regolare la soglia se necessario. L'oggetto superficie può essere selezionato o disattivato per eseguire il controllo incrociato con l'intensità del canale corrispondente. Chiudere la procedura guidata.
9. Quantificazione (Figura 3j)
   1. Selezionare un oggetto superficie creato nel menu "Scena" e passare alla scheda"Statistiche ".
   2. Per recuperare dati dettagliati sul volume nell'oggetto superficie selezionato, scegliere la scheda "Dettagliato" e selezionare "Valori specifici" e "Volume" dal menu a discesa. Per recuperare un valore di volume totale dell'oggetto superficie selezionato, passare alla scheda "Dettagliato" e scegliere "Valori medi".

Risultati

Le isole umane non etichettate sono state trapiantate nell'ACE di NOD femmina di 8 settimane. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. ROSA- pomodoro. Rag2^{- / )}topi destinatari. Per prevenire il rigetto del tessuto umano, sono stati scelti come destinatari i topi da urlo Rag2 immunodeficienti. In questi topi transgenici, tutte le cellule e i tessuti hanno espresso una proteina di fluorescenza di pomodoro mirata alla membrana (mT) che consente una chi...

Discussione

Viene presentato un metodo per studiare il processo di innesto delle cellule dell'isolotto pancreatico umano osservando il coinvolgimento del tessuto del ricevente e del donatore. Dopo un intervento chirurgico mini-invasivo che impianta isolotti umani nella camera anteriore di un occhio di topo immunodeficiente, il topo si riprende rapidamente pochi minuti dopo l'intervento chirurgico. La procedura viene eseguita su un occhio. Generalmente, da 5-7 giorni dopo la postimplantazione in poi la cornea è sufficientemente guar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M