Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Özet

Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.

Özet

Beta hücrelerinin görüntülenmesi adacık transplantasyonuna yönelik önemli bir adımdır. Beta hücre biyolojisinin kaydı için farklı görüntüleme platformları geliştirilmiş ve in vivokullanılmıştır, tek hücre çözünürlüğü ve sürekli uzunlamasına kayıtlara izin verme açısından sınırlıdır. Korneanın saydamlığı nedeniyle, farelerde gözün ön odası (ACE) iyi insan ve fare pankreas adacık hücre biyolojisi çalışmak için uygundur. Burada bu yaklaşımın aşılama ve bireysel insan adacık greftlerinin revaskülarizasyon sürekli uzunlamasına kayıtları gerçekleştirmek için nasıl kullanılabileceğinibir açıklamasıdır. İnsan adacık greftleri ACE içine yerleştirilir, NOD kullanılarak. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-alıcı olarak fareler. Bu, alıcıya karşı donör hücrelerin genişlemesinin araştırılmasına ve alıcı hücrelerin greftin kapsüllenmesi ve vaskülarizasyonunu teşvik etmedeki katkısına olanak sağlar. Ayrıca, görüntü analizi ve adacık hacmi veya parçalı vaskülatür ve adacık kapsül alıcı hücreleri oluşturan nicelik için adım adım bir yaklaşım özetlenmiştir.

Giriş

Diabetes mellitus, kan şekerinin yükselmesi ile karakterize bir grup metabolik hastalığı pankreas adacık beta hücrelerinin kaybı veya disfonksiyonundan kaynaklanan yetersiz insülin üretiminin sonuçları olarak tanımlar, genellikle insülin direnci ile birlikte. Tip 1 (T1D) ve tip 2 diyabet (T2D) beta hücrelerinin ilerleyici disfonksiyonunun hastalık gelişimine neden olduğu karmaşık hastalıklardır. T1D beta hücrelerine otoimmün bir saldırı ile çökelti, T2D metabolik faktörler tarafından tahrik olarak kabul edilir ken, düşük dereceli sistemik inflamasyon artan kanıtlarla da olsa¹. Özellikle T1D hastalarına donör insan adacıklarının nakli fizyolojik glisemik kontrol sağlama potansiyeli sunar. Ancak, doku donörleri ve kötü adacık engraftment bir sıkıntısı bir ana tedavi seçeneği haline adacık nakli engelledi. Fonksiyonel adacık greftinin önemli bir kısmı hipoksik, inflamatuar, immünojenik konak^ortamı2^,3nedeniyle hemen posttransplantasyon sonrası dönemde (24-48 saat) kaybolur. Adacık sağkalımının iyileştirilmesi için müdahale yöntemlerinin etkinliğini değerlendirmek için bu tür transplantasyonların sürekli izlenmesi gerekmektedir.

Transplantasyon sonrası nakledilen insan pankreas adacıklarının kaderini görüntülemek ve izlemek için in vivo teknikleri hala diyabet araştırma^4,,⁵için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir . Bugüne kadar pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya ultrason (US) dahil olmak üzere noninvaziv görüntüleme teknikleri, deneysel koşullarda nakledilen adacıkların nicelve fonksiyonel değerlendirilmesi için potansiyel göstermektedir⁵. Ancak, küçük adacık boyutları göz önüne alındığında, bu yöntemlere göre nicel ölçümler yetersiz çözünürlük muzdarip. Gözlem için bir transplantasyon sitesi olarak gözün ön odası (ACE) uzun süreler boyunca etkili bir şekilde daha yüksek mekansal çözünürlük ve sık izleme sunan umut verici bir noninvaziv görüntüleme çözümüdür⁶. Bu yöntem başarıyla fare adacık biyolojisi (Yang ve ark.⁷gözden), otoimmün immün yanıtlar^8,yanı sıra insan adacık aşılama^9,10çalışma için istismar edilmiştir.

Burada ACE transplantasyon yöntemi, transplantasyondan sonra 10 aya kadar bireysel adacık greftleri üzerinde sürekli ve tekrarlanan kayıtlar la insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamiklerini araştırmak için 2-foton görüntüleme yaklaşımı ile birleştirilir. Daha fazla görüntüleme derinliği ve azaltılmış genel fotobeyaztma ve foto hasarı multifoton görüntüleme özellikleri konfokal mikroskopi¹¹görüntüleme sınırlamaları aşmak . Floresan görüntülemenin nicelleştirilmesi, adacık numune hazırlama, adacık nakli, görüntü edinimi, adacık gürültüsünü veya arka planı kaldırmak için görüntü filtreleme, segmentasyon, sayısallaştırma ve veri analizi dahil olmak üzere çeşitli aşamaları içerir. En zorlu adım genellikle bir görüntüyü birden çok parçaya veya bölgeye bölmek veya bölmektir. Bu, sinyali arka plan gürültüsünden ayırmayı veya örneğin adacık vaskülature'u temsil eden bir 3B birimin voksellerini algılamak ve etiketlemek için renk veya şekil benzerliklerine dayalı voxels bölgelerini ayırmayı içerebilir. Bölümlere çıkarıldıktan sonra, nesne hacmi boyutları gibi istatistiklerin ayıklanması genellikle kolaydır. Sağlanan segmentasyon ve veri görselleştirme gibi görüntüleme verilerinin sayısallaştırılması ve ayıklanması için bir yöntemdir. Özellikle dikkat insan adacıkları otofloresan ve adacık vaskülatür ve adacık kapsül alıcı hücreleri oluşturan arasındaki ayrım kaldırılması için ödenir.

Protokol

İsveç'in Lund kentinde bulunan Bölgesel Etik Komitesi, Çalışmayı, İnsanlarla İlgili Araştırmaların Etik İncelemesini Içeren Yasa'ya göre onayladı. Hayvan deneyleri İsveç hayvan deneyleri etiğine uygun olarak yapıldı ve Malmö ve Lund etik komiteleri tarafından onaylandı. 6 ila 8 haftalık immünoeksik NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. ROSA-domates. Rag2^-/-) alıcı fareler insan adacıklarının naklinde alıcı olarak kullanılmıştır¹⁰.

1. Transplantasyon için adacık hazırlığı

1. CMRL 1066'da 10 mM HEPES ile desteklenen kültür insan adacıkları, 2 mM L-glutamin, 50 μg/mL gentamisin, 0.25 μg/mL fungizone, 20 μg/mL ciproxfloxacin, 10 mM nikotinamid (NIC) ve %10 ısı yalıtımlı insan serumu 37 °C'de %5 CO₂ ve transplantasyona kadar nemlendirilmiş hava, daha önce açıklandığı üzere¹².
   NOT: Adacıklar ekzonrin dokudan arınmalı ve kültürde birbirine dokunmamalıdır. Ekzonrin dokular yarı saydam görünür.
2. Nakil günü, adacıkları içeren kültür ortamını, çekilen cam kılcal damara bağlı bir aspiratör tüp ütyülü kullanarak yeni bir Petri kabına aktarın.
   NOT: Alternatif olarak, 200 μL'lik bir pipet kullanın. Petri kabının arkasını boyamak, adacıkların stereo mikroskop altında daha kolay ayırt edilebilir hale getirmenize yardımcı olur.
3. Stereo mikroskop kullanarak, transplantasyon başına ~20-40 adacıkları seçin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü en üste, kuvözden gelen kültür medyasıyla doldurun.
4. Tüpleri parafin filmile kapatın ve nakil yapılana kadar buzüzerinde saklayın. Yapılan nakil sayısıiçin uygun miktarda hazırlayın.
5. Alternatif olarak, adacıkları kültürde tutmak ve her nakilden hemen önce almak için ameliyathanede bir CO₂ kuluçka makinesi nin bulunduğundan emin olun.

2. Transplantasyon ekipmanlarının hazırlanması ve cerrahi tablo

NOT: Tüm cerrahi aletler otoklavlı olmalı ve ameliyat masası ve aletler %70 alkol le dezenfekte edilmelidir.

1. Stereotaksik bir baş tutucuyu burun maskesi ile anesteziye bağlayın ve ısıtma yastığını açın.
2. Bir gaz geçirmez Hamilton şırınga polietilen tüp ve künt uç göz kanül bağlayın.
   NOT: Montajdan önce tüm parçaların PBS ile doldurulması önerilir. Sıkışıp hava kabarcıkları için kontrol edin ve varsa kaldırın.
3. Hamilton şırıngayını masaya sıkıca takın(Şekil 1a)veya hareketli bir taban(Şekil 1e)ve tüpü stereo mikroskoba takın, kanül aşağı asılı (yani bekleme pozisyonu).
   NOT: Cerrahi bant kullanın, çünkü kolayca çıkarVe yeniden takın.
4. 0,1 mg/kg buprenorfin çözeltisi ile doldurulmuş 30 G iğneye bağlı 1 mL şırınga hazırlayın.
5. Steril PBS ile bir şırınga hazırlayın. Alternatif olarak, bir pipet kullanın.
6. Isıtma lambası ile temiz bir uyandırma kafesi koyun.

3. Ameliyat için alıcı farelerin anestezisi ve konumlandırılması

NOT: Lund Üniversitesi'ndeki hayvan tesislerinde tüm hayvanlar patojensiz bir ortamda yetiştirildi ve bakımını sürdürdü.

1. Fareyi %40 O₂/60% N₂/3 izofluran ile dolu bir odada anesthetize ve sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde baş tutucu platforma anestezili fare transfer(Şekil 1a). Pedal refleksleri eksikliği olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Isoflurananestezi ameliyat sonrası hızlı iyileşme için tercih edilen anestezi yöntemidir. Mikroskop odası isoflurane kullanmak için düzgün bir şekilde havalandırılmalıdır.
2. Farenin balığını %40 O 2/60%₂N₂/0.9%-1.5% isofluran anestezi makinesine bağlı anestezi maskesine yerleştirin. Başparmağı nızı ve parmağınızı kullanarak başı hafifçe yukarı kaldırın ve yanlarda metalik parçaları kullanarak sabitle. Kulaklıkların başLarı doğrudan kulakların altına sabitlediğinden emin olun. Farenin arkasına deri altında 0.1 mg/kg buprenorfin çözeltisi enjekte edin.
   NOT: Buprenorfin analjezik olarak kullanılır.
3. Başını, ameliyat edilecek gözün yukarı bakacak şekilde eğin ve araştırmacıya yakın olun.
4. Künt forceps kullanılarak nakledilecek gözün göz kapaklarını hafifçe geri çek, gözü dışarı çıkar ve bir çift cımbızla gevşek bir şekilde düzeltin. Cımbızın uçlarının baş tutucu platforma bağlı polietilen bir tüple kaplı olduğundan emin olun(Şekil 1a,insert).
5. Her zaman göz üzerine steril PBS bir damlacık uygulayarak her iki göz ıslak tutun.
6. İnsan adacıklarını mühürlü 1,5 mL borudan (bölüm 1) steril PBS'li bir Petri kabına aktarın ve aktarılan hücre kültürü ortamı miktarını en aza indirmek için adacıkların birbirine yakın olduğundan emin olun(Şekil 1c).
7. Hamilton şırınga polietilen boru ile bağlı göz kanül ~ 20-30 adacıkları pick up.
   NOT: Adacıklarla mümkün olduğunca az sıvı alın.
8. Tüpü baş aşağı asın ve stereo mikroskoba takın (Şekil 1d). Adacıkların tüpün ucuna kadar kanüle doğru batmasını sağlamak için boruları dikkatlice bantlayın.

4. Transplantasyon prosedürü

NOT: Bu yöntem daha önce fare adacıklarının nakli için tanımlanmıştır⁶. Burada biraz değiştirilmiş bir yordam sunulmuştur.

1. Farenin uyuduklarından emin olmak için arka bacaklardaki pedleri çimdikle.
2. Kan akışını bozmadan gözü dizginleyen kasları sıkın ve göze steril PBS damlatın.
3. Neşter olarak 25 G iğne kullanarak, yukarı doğru eğilin, dikkatle kornea ucunun sadece yarısını nüfuz ve tek bir lateral kesi yapmak. Deliği yukarı doğru açıyla yapın; delik nakilden sonra daha kolay mühürlenir (Şekil 1f).
4. Adacıklarla önceden yüklenmiş kanülile korneayı dikkatlice kaldırın ve göze adacıkları yavaşça uygulayın. Irisin zarar görmesini önlemek için kanülön haznesine kanül takılmaktan kaçının, ancak kornea açıklığı ile dikkatlice itin(Şekil 1g).  Yavaşça ACE kanül geri.
   NOT: 3-8 μL enjeksiyon hacmini hedefleyin. Hacim çok büyükse, gözü gereksiz yere yüksek göz içi basıncına maruz bırakır ve enjekte edilen adacıkların ön hazneden reflüolmasına neden olabilir.
5. Göz odasında artan basınç nedeniyle adacıkların takılması ile ilgili zorluklarla karşı karşıya, lateral kesi bölgesitakviye ve adacıklar yeniden uygulayarak kesi bölgesibüyütmek.
   NOT: Bazen, tanıtılan hava kabarcıkları uzay tutucuolarak kullanılabilir.
6. Göze göz jeli uygulayın, göz tutma forsepsgevşetin ve adacıklar ayarlamak için 8-10 dakika boyunca aynı pozisyonda izoflurane fare bırakın.
7. Göz kapağını tutan pçineleri çıkarın ve göz kapağını normal konumuna geri koyun.
8. Fareyi baş tutucudan çıkarın ve uyandırma kafesine aktarın.
9. Fare uyanık ken ve hareket ederken, orijinal kafese geri aktarın ve tarama kadar hayvan muhafaza tutmak (en az 5 gün önerilir).

5. İmplante edilen insan adacıklarının 2-foton mikroskopi ile görüntülenmesi

NOT: 2-foton görüntülemeden 4-5 gün önce transplantasyondan 4-5 gün önce floresan stereoskopik mikroskobu kullanarak gözün genel görüntülerinin alınması, ilgi çekici adacıkların lokalize edilmesi önerilir.Figure 2ac Transplantasyondan sonra gözü bu kadar sıkı bir şekilde dizginlemekten kaçının. Transplantasyon sonrası 6-7 gün 2 foton görüntüleme kullanın.

1. Görüntü edinme yazılımını başlatın (bkz. Malzeme Tablosu). "Laser" menüsünde Mai Tai lazerini (Power "ON") ve "Işık Yolu" menüsünde dalga boyu 900 nm'ye ayarlayın ve %5-10 lazer gücüyle başlayan minimum iletim lazer gücü uygulayın (sürgü kullanın).
   NOT: Tarama sırasında lazer gücünü gerektiği gibi ayarlayın.
2. Yeşil, turuncu ve kırmızı kanallar ayarlayın. Dikronik bir ayna (LBF 760) ve emisyon filtresi bilgilerini kullanarak üç adet nondetcanned dedektöre (NDD) aynı anda emisyon ışığı toplayın: Red/Angiosense 680, 690-730 nm; Yeşil/Otofloresans, 500-550 nm; ve Portakal / Domates, 565-610nm (Şekil 2d).
3. Baş tutucu sahneyi motorlu mikroskop aşamasına yerleştirin ve gaz maskesini anestezi makinesinin ve havalandırma sistemine bağlı boruların borularına bağlayın. Isıtma yastığını açın.
4. Alıcı fareyi anesthetize edin, baş tutucu platformuna aktarın, görüntüleme için gözü dizginleve yukarıda açıklandığı gibi buprenorfin çözeltisini uygulayın (3.1-3.5. adım).
5. Isofluran buharlarını gerektiği gibi ayarlayın. Dakikada ~55-65 nefes hızı (bpm) optimal anesteziyi gösterir. Anestezi çok derin ise, oranı olacak <50 bpm ağır nefes alma veya nefes alma; çok hafif ise, oranı yüzeysel nefes ile >70 bpm olacaktır. Anestezi sırasında fareleri her 15 dakikada bir görsel muayene ile dikkatle izleyin.
   NOT: Anestezi fareden fareye, fare suşları arasında ve anestezi altında zaman ilerledikçe değişir¹³.
6. Kornea ve lens arasında bir daldırma sıvı olarak göze yeterli göz jeli uygulayın, yavaş yavaş birikmesine izin(Şekil 2f, eklemek). Hava kabarcıkları kaçının.
   NOT: Odak noktasını ayarlamak ve adacık greftlerini lokalize etmek için esnek metal hortum lambası ile yan aydınlatma önerilir.
7. Kan damarlarını görselleştirmek için, tek kullanımlık insülin 30 G şırınga kullanarak kuyruk damarına intravenöz olarak görüntüleme maddesinin (örneğin, Angiosense 680) 100 μL'sini uygulayın.
8. "Edinme modunda" çerçeve boyutunu 512 x 512 ve tetkik hızına ayarlayın.
   NOT: Daha yavaş taramalar (yani, çalışma süresini artırmak) sinyal-gürültü oranını artıracaktır.
9. "Kanallar" menüsünde, Canlı tarama modunda ekranda bir görüntü görülene kadar sinyali yükseltmek için Volt'taki her PMT için Master Gain'i ayarlayın. Bu değer ne kadar yüksekse, dedektör sinyal ve gürültüye o kadar duyarlı hale gelir.
   NOT: Tercihen, değerleri 500-800 V arasında tutun.
10. "Z-stack" menüsünde, odak noktasını adacık greftinin üstüne elle taşıyarak z yığınının başlangıcını ve sonunu tanımlayın. "Önce Ayarla" seçeneğini seçerek konumu kaydedin. Adacık greftine odaklanabilen son alt düzleme geçin ve"Son Set"seçeneğini seçerek konumu kaydedin. 2 μm z-adım boyutu kullanın.
11. "Deneyi Başlat" sekmesini tıklatarak son resim yığınını toplayın ve 8 bit czi (yani Carl Zeiss formatı) dosyasını kaydedin.

6. İmplante edilen insan adacıklarının konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi

NOT: Nakledilen adacıkların toplam hacmi, morfolojisi ve plastisiteleri, lazer arka saçılma^{ışığının 10}algılanması yla in vivo saçılma sinyalinin ayrı bir taramalarda (yani ayrı parça) izlenmesi yle değerlendirilebilir.

1. Ana ışın ayırıcısını (yani LBF Filtresi) ve "Işık Yolu" iletişim kutusunda, konfokal görüntüleme için ayrı bir parça ayarlayın. 633 nm dalga boyuna sahip Argon lazerini seçin ve lazer ışığıyla aynı dalga boyunda algılamayı seçin. Z-yığınları, geri saçılma ışık sinyali için 2-3 μm'lik bir adım boyutuile elde edilir.
2. Tüm adacık kaydını yaptığınızdan emin olmak için z yığını ayarlarını düzeltin (bkz. adım 5.10).
3. Görüntü yığınını edinin ve 8 bit CZI dosyası olarak kaydedin.

7. Görüntü analizi

NOT: Bu adım için ticari yazılım (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılmıştır.

1. Adacık otofloresansı çıkarma (Şekil 3b)
   1. "Görüntü işleme" sekmesinde "Kanal aritmetik" ve "ch1-ch2" yazın. Bu yeni bir kanal 4 (ch 4) oluşturur; olarak yeniden adlandırın "Vasculature".
      NOT: Yeşil/Otofloresan kanalı Red/Angiosense kanalından çıkarılır.
   2. Yeni bir kanal (ch 5) oluşturmak için önceki adımı tekrarlayın ve "ch3-ch2" yazın; olarak yeniden adlandırın "Domates (tüm)".
      NOT: Yeşil/Otofloresan kanalı Turuncu/Domates kanalından çıkarılır.
2. Adacık maskesinin manuel çizimle tanımlanması (Şekil 3c)
   1. Yeni bir yüzey (mavi sembol) oluşturun ve sihirbazda "El ile Edit" seçeneğini belirleyin. Bölümleri görselleştirmek için işaretçiyi "Seç" modunda ve 3B görünümde "Volume" (Scenealtında) seçeneğini kdurumunda tutun.
   2. Daha kolay adacık sınır ayrımcılığı için, ch 1-ch 3 dahil olmak üzere tüm kanalları etkinleştirin.
      NOT: Portakal/Domates kanalı, adacık kenarlıklarını Domates kapsülü sinyali ile tanımlamak için yararlıdır. Alternatif olarak, kılavuz olarak çok kanallı adacık otofloresan ve dedektör arka plan sinyalini kullanmak için kanal yoğunluklarını artırın.
   3. "Çizim" sekmesinde "Kontur" seçeneğini belirleyin ve dilim konumundan başlayarak adacık kenarlığı çevresinde kontur çizmeye başlamak için "Çiz "tuşuna basın.
   4. Yeni bir dilim konumuna geçin ve çizim hatlarını tekrarlayın. Adaçayının üstündeki son dilimle bitirin ve "Yüzey oluştur" sekmesine tıklayarak sona erdirin. Genellikle her¹⁰ dilim kontur çizmek için yeterlidir.
3. "Adacık vaskülature" ve "Adacık domatesi" floresanının adacık maskesi kullanılarak segmentasyonu (Şekil 3d).
   1. Önceden tanımlanmış "Adacık maskesi" nesnesini seçin, düzenleme sekmesine(kalem simgesi) gidin ve yeni bir pencere açan "Maske tüm" sekmesine tıklayın.
   2. Kanal seçimi açılır menüsünde daha önce adlandırılmış "Vasculature" (ch 4) kanal ını seçin vemaskeyi uygulamadan önce" Yinelenen kanal ", "Constant iç/dış" seçeneklerini etkinleştirin ve voxel'leri yüzey dışında "0,000" olarak ayarlayın, bu da yeni bir kanal oluşturur; "Adacık vaskülature" (ch 6) olarak yeniden adlandırın.
   3. 7.3.1 ve 7.3.2 adımlarını tekrarlayın ve kanal seçiminde daha önce oluşturulmuş "Tomato (all)" (ch 5) kanal ını seçin ve yeni kanalı oluşturmak için menüden açılır; "Adacık domatesi" (ch 7) olarak yeniden adlandırın.
4. Adacık vaskülatürünün yüzey işlemesi (Şekil 3e)
   1. "Scene" menüsünde yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbazda "Otomatik oluşturma" seçeneğini belirleyin.
   2. Kaynak kanalı daha önce oluşturulmuş "Islet vasculature" (ch 6) olarak ayarlayın ve arka plan çıkarma nızı seçin. Gerekirse otomatik eşik tahmini ayarlanabilir. Yanıt veren floresan kanalıyla karşılaştırın (örneğin, yeni oluşturulan yüzey sekmesini karıştırarak/çıkararak). Sihirbaza devam edin.
   3. İsteğe bağlı olarak, filtreler kullanın. Örneğin, "Birim" seçeneğini belirleyin ve penceredeki filtreyi (sarı) ayarlayarak seçili yüzey nesnelerini kaldırabilen leri ayarlayın. Sihirbazı bitirin ve yeni yüzey nesnesine "Adacık vaskülature" adını verin.
5. "Adacık domates vaskülatür" floresan sinyalinin segmentasyonu (Şekil 3f)
   1. Daha önce oluşturulan "Adacık vaskülature" yüzey nesnesinde düzenleme sekmesine gidin ve yeni bir pencere açan "Maske tüm" sekmesine tıklayın.
   2. Kanal seçimimenüsünde daha önce adı geçen "Islet tomato" (ch 7) kanalını seçin ve yeni kanalı oluşturan "10.000" olarak yüzeyin dışındaki voxel'leri ayarlayın; "Adacık domates vaskülature" (ch 8) olarak yeniden adlandırın.
6. " Domateskapsülü" floresan sinyalinin segmentasyonu (Şekil 3g)
   1. "Görüntü işleme" sekmesinde "Kanal Aritmetik"seçeneğini seçin ve "ch7-ch8" yazın, yeni kanal oluşturma; " Domateskapsülü" (ch 9) olarak yeniden adlandırın.
      NOT: "Adacık domates vaskülature" floresan sinyali toplam "Adacık domates" floresan sinyali çıkarılır.
7. Yüzey işleme "Adacık domates vaskülature" ve "Domates kapsülü" (Şekil 3h)
   1. Adım 7.4 izleyin ve sihirbaz kaynak kanalları seçin "Adacık domates vaskülature" (ch 8) veya "Domates kapsülü" (ch 9) buna göre yeni yüzey nesneleri oluşturmak için.
8. Toplam adacık yüzeyinin yüzey işlemesi (Şekil 3i)
   1. Adacık geri dağılım dosyasını açın ve yeni bir yüzey oluşturun.
   2. Sihirbazda , "Otomatik oluşturma" seçeneğini belirleyin ve " İlgi Alanı " olaraktanımlayın.
      NOT: "İlgi bölgesi" birden fazla adacık sinyallerini ayırmak ve analiz edilecek adacık derinliğini tanımlamak için kullanılır (örn. en iyi 75 μm).
   3. "Mutlak yoğunluk" gerekirse eşiği ayarlayın. Yüzey nesnesi, ilgili kanal yoğunluğuyla çapraz kontrol için tıklanabilir veya kapatılabilir. Sihirbazı kapatın.
9. Niceleme (Şekil 3j)
   1. "Scene" menüsünde oluşturulan bir yüzey nesnesini seçin ve "İstatistikler" sekmesine gidin.
   2. Seçili yüzey nesnesinde ayrıntılı hacim verilerini almak için "Ayrıntılı" sekmesini seçin ve açılır menüden "Belirli değerler" ve "Birim" seçeneğini belirleyin. Seçili yüzey nesnesinin toplam birim değerini almak için "Ayrıntılı" sekmesine gidin ve "Ortalama değerleri" seçin.

Sonuçlar

Etiketsiz insan adacıkları 8 haftalık dişi NOD ACE'ye nakledildi. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. ROSA-domates. Rag2^−/−) alıcı fareler. İnsan dokusunun reddini önlemek için, immün eksik Rag2 nakavt fareler alıcı olarak seçildi. Bu transgenik farelerde, tüm hücre ve dokular alıcı ve donör doku net bir kimlik sağlayan bir membran hedefli domates floresan protein (mT) ifade. Adacık greftlerinin yüksek çözünürlüklü...

Tartışmalar

Bir yöntem alıcı ve donör doku tutulumu gözlemleyerek insan pankreas adacık hücre greftleme süreci çalışma sunulmaktadır. İnsan adacıklarını immünofif fare gözünün ön odasına yerleştiren minimal invaziv bir ameliyattan sonra fare ameliyattan birkaç dakika sonra hızla iyileşir. İşlem tek göze yapılır. Genellikle, 5-7 gün postimplantasyon itibaren kornea yeterince intravital görüntüleme yapmak için iyileşmiş.

Bu protokolde insan adacık greftlerinin kalitesi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M