Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

Resumo

O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.

Resumo

As células beta de imagem são um passo fundamental para entender o transplante de ilhotas. Embora diferentes plataformas de imagem para o registro da biologia celular beta tenham sido desenvolvidas e utilizadas in vivo,elas são limitadas em termos de permitir resolução de células únicas e gravações longitudinais contínuas. Devido à transparência da córnea, a câmara anterior do olho (ACE) em camundongos é bem adequada para estudar biologia de células ilhotas pancreáticas humanas e de camundongos. Aqui está uma descrição de como essa abordagem pode ser usada para realizar gravações longitudinais contínuas de enxerto e revascularização de enxertos de ilhotas humanas individuais. Enxertos de ilhotas humanas são inseridos no ACE, usando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-ratos como destinatários. Isso permite a investigação da expansão das células receptoras versus doadoras e a contribuição das células receptoras na promoção do encapsulamento e vascularização do enxerto. Além disso, é delineada uma abordagem passo a passo para análise de imagens e quantificação do volume de ilhotas ou vasculatura segmentada e cápsula de ilhota formando células receptoras.

Introdução

Diabetes mellitus descreve um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por níveis elevados de glicose no sangue como resultado da produção insuficiente de insulina de perda ou disfunção de células beta de ilhotas pancreáticas, muitas vezes acompanhadas pela resistência à insulina. Diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D) são doenças complexas nas quais a disfunção progressiva das células beta causa o desenvolvimento da doença. O T1D é precipitado por um ataque autoimune nas células beta, enquanto o T2D é considerado impulsionado por fatores metabólicos, embora com evidências crescentes de inflamação sistêmica de baixo grau¹. O transplante de ilhotas humanas doadoras, particularmente para pacientes com T1D, oferece o potencial para fornecer controle fisiológico glicêmico. No entanto, a escassez de doadores de tecidos e o enxerto de ilhotas pobres impediram o transplante de ilhotas para se tornar uma opção terapêutica convencional. Uma proporção substancial do enxerto de ilhota funcional é perdida no período pós-transplantação imediato (24-48 h) devido ao ambiente hospedeiro hipóxico, inflamatório e imunogênico^2,3. Para avaliar a eficiência dos métodos de intervenção para a melhoria da sobrevida de ilhotas, é necessário o acompanhamento contínuo desses transplantes.

Técnicas in vivo para imagem e rastrear o destino das ilhotas pancreáticas humanas transplantadas após o transplante ainda permanecem um desafio para a pesquisa sobre diabetes^4,5. Até o momento, técnicas não invasivas de imagem, incluindo tomografia de emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) ou ultrassom (EUA) mostram potencial para quantificação e avaliação funcional de ilhotas transplantadas em condições experimentais⁵. No entanto, dado o pequeno tamanho de ilhotas, as medições quantitativas por essas modalidades sofrem de resolução insuficiente. A câmara anterior do olho (ACE) como local de transplante para observação é uma promissora solução de imagem não invasiva que oferece efetivamente maior resolução espacial e monitoramento frequente ao longo dos longos períodos⁶. Este método foi explorado com sucesso para estudar a biologia da ilhota do rato (revisada em Yang et al.⁷), respostas imunes autoimunes⁸, bem como enxerto de ilhotas humanas^9,,10.

Aqui, o método de transplante ACE é combinado com uma abordagem de imagem de 2 fótons para investigar a dinâmica do processo de enxerto de ilhotas pancreáticas humanas por gravações contínuas e repetidas em enxertos de ilhotas individuais por até 10 meses após o transplante. As propriedades de imagem multifotíferas de maiores profundidades de imagem e redução do fotobleaching geral e danos fotográficos superam as limitações de imagem da microscopia confocal¹¹. A quantificação da imagem fluorescente envolve várias etapas, incluindo preparação da amostra de ilhotas, transplante de ilhotas, aquisição de imagens, filtragem de imagens para remover ruído ou fundo de ilhotas, segmentação, quantificação e análise de dados. O passo mais desafiador é geralmente particionar ou segmentar uma imagem em várias partes ou regiões. Isso pode envolver a separação do sinal do ruído de fundo, ou regiões de agrupamento de voxels com base em semelhanças em cor ou forma para detectar e rotular voxels de um volume 3D que representa vasculatura ilhota, por exemplo. Uma vez segmentadas, estatísticas como tamanhos de volume de objeto são tipicamente simples de extrair. Fornecido é um método para quantificação e extração dos dados de imagem, como segmentação e visualização de dados. Atenção especial é dada à remoção da autofluorescência em ilhotas humanas e à distinção entre vasculatura de ilhotas e cápsula de ilhota formando células receptoras.

Protocolo

O Comitê regional de Ética em Lund, Suécia, aprovou o estudo de acordo com o Ato relativo à Revisão Ética da Pesquisa Envolvendo Humanos. Os experimentos em animais foram realizados em estrita conformidade com a ética sueca dos experimentos em animais e aprovados pelos comitês de ética de Malmö e Lund. NOD imunodeficente de 6 a 8 semanas. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. Rosa-tomate. Os camundongos receptores rag2^-/-foram utilizados como receptores para transplante de ilhotas humanas¹⁰.

1. Preparação de ilhotas para transplante

1. Cultura ilhotas humanas em CMRL 1066 suplementadas com 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 μg/mL gentamicina, 0,25 μg/mL fungizone, 20 μg/mL ciproxfloxacina, 10 mM de nicotinamida (NIC) e soro humano inativado a 37 °C em 5% CO₂ e ar umidificado até o transplante, como descrito anteriormente¹².
   NOTA: As ilhotas devem estar livres de tecido exócrino e não se tocarem na cultura. Os tecidos exócrinos parecem translúcidos.
2. No dia do transplante, transfira a mídia cultural contendo as ilhotas para uma nova placa de Petri usando um conjunto de tubos aspiradores conectados a um capilar de vidro puxado.
   NOTA: Alternativamente, use uma pipeta de 200 μL. Colorir a parte de trás da placa de Petri ajuda a tornar as ilhotas mais facilmente distinguíveis sob o microscópio estéreo.
3. Usando um microscópio estéreo, escolha ~20-40 ilhotas por transplante e transfira para um tubo de 1,5 mL. Encha o tubo até o topo com mídia cultural da incubadora.
4. Sele os tubos com filme de parafina e guarde no gelo até o transplante. Prepare uma quantidade adequada para o número de transplantes realizados.
5. Alternativamente, certifique-se de que uma incubadora de CO₂ esteja disponível na sala de cirurgia para manter ilhotas na cultura e escolhê-las imediatamente antes de cada transplante.

2. Preparação de equipamentos de transplante e mesa de cirurgia

NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas devem ser autoclavadas, e a mesa de cirurgia e os instrumentos desinfetados com 70% de álcool.

1. Conecte um suporte de cabeça estereotaxic à anestesia através de uma máscara de nariz e ligue a almofada de aquecimento.
2. Conecte uma seringa Hamilton gasosa à tubulação de polietileno e uma cânula de olho final sem cortes.
   NOTA: Recomenda-se encher todas as peças com PBS antes da montagem. Verifique se há bolhas de ar presas e remova se estiver presente.
3. Conecte a seringa hamilton firmemente à mesa (Figura 1a) ou uma base móvel(Figura 1e) e conecte a tubulação ao microscópio estéreo, com cânula pendurada para baixo (ou seja, posição de espera).
   NOTA: Use fita cirúrgica, pois é fácil de remover e recolocar.
4. Prepare uma seringa de 1 mL conectada a uma agulha de 30 G recheada com solução de buprenorfina de 0,1 mg/kg.
5. Prepare uma seringa com PBS estéril. Alternativamente, use uma pipeta.
6. Reserve uma gaiola de despertar limpa com lâmpada de aquecimento.

3. Anestesia e posicionamento de camundongos receptores para cirurgia

NOTA: Todos os animais foram criados e mantidos em um ambiente livre de patógenos nas instalações de animais da Universidade de Lund.

1. Anestesiar o mouse em uma câmara cheia de 40% O₂/60% N₂/3% isoflurane e transferir o mouse anestesiado para a plataforma porta-cabeça em uma almofada de aquecimento quente(Figura 1a). Verifique a falta de reflexos do pedal.
   NOTA: A anestesia isoflurane é o método preferido da anestesia para recuperação rápida após a cirurgia. A sala do microscópio deve ser devidamente ventilada para o uso de isoflurano.
2. Coloque o focinho do mouse na máscara de anestesia conectada a 40% O₂/60% N₂/0,9%-1,5% máquina de anestesia isoflurane. Use o polegar e o dedo para levantar a cabeça ligeiramente e fixá-la usando as peças metálicas nas laterais. Certifique-se de que os fones de ouvido fixam a cabeça diretamente abaixo das orelhas. Injete 0,1 mg/kg de solução de buprenorfina subcutânea na parte de trás do mouse.
   NOTA: Buprenorfina é usada como analgésico.
3. Incline a cabeça para que o olho a ser operado esteja voltado para cima e fique perto do pesquisador.
4. Retraia suavemente as pálpebras do olho para serem transplantadas usando fórceps contundentes, estoure o olho para fora e conserte livremente com um par de pinças. Certifique-se de que as pontas das pinças estejam cobertas com um tubo de polietileno preso à plataforma do porta-cabeça(Figura 1a, insira).
5. Mantenha sempre os dois olhos molhados aplicando uma gota de PBS estéril no olho.
6. Transfira as ilhotas humanas do tubo de 1,5 mL selado (seção 1) para uma placa de Petri com PBS estéril e certifique-se de que as ilhotas estejam próximas umas das outras para minimizar a quantidade de mídia de cultura celular transferida(Figura 1c).
7. Pegue ~20-30 ilhotas na cânula do olho conectadas através de tubos de polietileno à seringa Hamilton.
   NOTA: Tome o mínimo de líquido possível com as ilhotas.
8. Pendure o tubo de cabeça para baixo e conecte-se ao microscópio estéreo(Figura 1d). Tape a tubulação cuidadosamente para deixar as ilhotas afundar até o final do tubo em direção à cânula.

4. Procedimento de transplante

NOTA: Este método foi descrito anteriormente para o transplante de ilhotas de camundongos⁶. Um procedimento ligeiramente modificado é apresentado aqui.

1. Aperte as almofadas nas patas traseiras para ter certeza de que o mouse está dormindo.
2. Aperte os fórceps que restringem o olho sem interromper o fluxo sanguíneo e aplique uma gota de PBS estéril no olho.
3. Usando uma agulha de 25 G como bisturi, bisel para cima, penetrar cuidadosamente apenas metade da ponta na córnea e fazer uma única incisão lateral. Faça o buraco em um ângulo ascendente; o orifício sela mais facilmente após o transplante(Figura 1f).
4. Levante cuidadosamente a córnea com a cânula pré-carregada com ilhotas e aplique lentamente ilhotas no olho. Evite a inserção da cânula na câmara anterior para evitar danos da íris, mas empurre cuidadosamente contra a abertura da córnea(Figura 1g).  Retraia lentamente a cânula do ACE.
   NOTA: Aponte para um volume de injeção de 3-8 μL. Se o volume for muito grande, ele vai expor o olho à pressão intraocular desnecessariamente alta e pode resultar em refluxo das ilhotas injetadas para fora da câmara anterior.
5. Ao enfrentar dificuldades com a inserção das ilhotas devido ao aumento da pressão na câmara ocular, amplie o local da incisão reforçando o local de incisão lateral e reaplicando ilhotas.
   NOTA: Ocasionalmente, bolhas de ar introduzidas podem ser usadas como suportes espaciais.
6. Aplique gel ocular no olho, solte os fórceps de contenção dos olhos e deixe o rato na isoflurano na mesma posição por 8-10 minutos para deixar as ilhotas definidas.
7. Remova as pórceps segurando a pálpebra e coloque a pálpebra de volta à sua posição normal.
8. Retire o mouse do suporte da cabeça e transfira-o para uma gaiola de despertar.
9. Quando o rato estiver acordado e em movimento, transfira-o de volta para a gaiola original e mantenha-o na carcaça dos animais até a varredura (pelo menos 5 dias são recomendados).

5. Imagem de ilhotas humanas implantadas por microscopia de 2 fótons

NOTA: Ter imagens de visão geral do olho usando um microscópio estereoscópico fluorescência(Figura 2a–c)4-5 dias após o transplante antes da imagem de 2 fótons é recomendado para localização das ilhotas de interesse. Evite conter o olho muito fortemente tão cedo após o transplante. Use imagens de 2 fótons de 6 a 7 dias após a transferência.

1. Inicie o software de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais). No menu "Laser" ativar o laser Mai Tai (Power "ON") e no menu "Light Path" definir o comprimento de onda para 900 nm e aplicar uma potência laser de transmissão mínima começando com 5%-10% de potência laser (use controles deslizantes).
   NOTA: Durante a varredura, ajuste a potência do laser conforme necessário.
2. Coloque canais verdes, laranjas e vermelhos. Colete a luz de emissão simultaneamente em três detectores não pesquisados (NDD) usando um espelho dicrônico (LBF 760) e informações do filtro de emissão da seguinte forma: Vermelho/Angiosense 680, 690-730 nm; Verde/Autofluorescência, 500-550 nm; e Laranja/Tomate, 565-610nm (Figura 2d).
3. Coloque o estágio do porta-cabeça no estágio do microscópio motorizado e conecte a máscara de gás ao tubo da máquina de anestesia e tubos conectados ao sistema de ventilação. Ligue a almofada de aquecimento.
4. Anestesiar o mouse receptor, transferir para a plataforma do suporte principal, conter o olho para imagem e administrar a solução de buprenorfina conforme descrito acima (etapas 3.1-3.5).
5. Ajuste os vapores isoflurane conforme necessário. Uma taxa de respiração de ~55-65 respirações por minuto (bpm) indica anestesia ideal. Se a anestesia for muito profunda, a taxa será de <50 bpm com respiração pesada ou ofegante; se muito leve, a taxa será >70 bpm com respiração superficial. Monitore cuidadosamente os ratos durante a anestesia por inspeção visual a cada 15 minutos.
   NOTA: A anestesia varia de mouse para mouse, entre cepas de camundongos, e à medida que o tempo sob anestesia progride¹³.
6. Administre gel ocular suficiente no olho como um líquido de imersão entre a córnea e a lente, permitindo que ele se acumule lentamente(Figura 2f, insira). Evite bolhas de ar.
   NOTA: Recomenda-se a iluminação lateral com uma lâmpada de mangueira de metal flexível para ajustar o foco e localização de enxertos de ilhotas.
7. Para visualizar os vasos sanguíneos, administre 100 μL do agente de imagem (por exemplo, Angiosense 680) por via intravenosa na veia traseira usando uma seringa de insulina descartável de 30 G.
8. Em "Modo aquisição" ajuste o tamanho do quadro para 512 x 512 e a velocidade de varredura.
   NOTA: As varreduras mais lentas (ou seja, o aumento do tempo de moradia) melhorarão a relação sinal-ruído.
9. No menu "Canais" ajuste o Ganho Mestre para cada PMT em Volts para amplificar o sinal até que uma imagem seja vista na tela no modo de digitalização ao vivo. Quanto maior esse valor, mais sensível o detector se torna ao sinal e ao ruído.
   NOTA: De preferência, mantenha valores entre 500-800 V.
10. No menu "Z-stack" definir o início e o fim da pilha z movendo manualmente o foco para a parte superior do enxerto de ilhota. Salvar posição selecionando "Definir Primeiro". Mova-se para o último plano inferior que pode ser focado no enxerto de ilhota e salvar a posição selecionando"Set Last". Use um tamanho de passo z de 2 μm.
11. Colete a pilha de imagens final clicando na guia "Iniciar experimento" e salvar como arquivo CZI de 8 bits (ou seja, formato Carl Zeiss).

6. Imagem de ilhotas humanas implantadas por microscopia confocal

NOTA: O volume total, a morfologia e a plasticidade das ilhotas transplantadas podem ser avaliados monitorando o sinal de dispersão in vivo em uma varredura separada (ou seja, faixa separada) pela detecção da luz do backscatter laser¹⁰.

1. Pegue o divisor de feixe principal (ou seja, filtro LBF) e no diálogo "Light Path" configure uma faixa separada para imagens confocal. Escolha o laser argon com comprimento de onda de 633 nm e detecção no mesmo comprimento de onda que a luz laser. As pilhas Z são adquiridas com um tamanho de passo de 2-3 μm para sinal de luz backscatter.
2. Reajuste as configurações de pilha de z para ter certeza de gravar toda a ilhota (ver passo 5.10).
3. Adquira a pilha de imagens e salve como arquivo CZI de 8 bits.

7. Análise de imagem

NOTA: O software comercial (ver Tabela de Materiais) foi utilizado para esta etapa.

1. Remoção da autofluorescência da ilhota (Figura 3b)
   1. Na aba "Processamento de imagem" escolha " Canalaritmética" e digite "ch1-ch2". Isso cria um novo canal 4 (ch 4); renomear como "Vasculatura".
      NOTA: O canal Verde/Autofluorescência é subtraído do canal Vermelho/Angiosense.
   2. Repita a etapa anterior e digite "ch3-ch2" para criar um novo canal (ch 5); renomear como "Tomate (todos)".
      NOTA: O canal Verde/Autofluorescência é subtraído do canal Laranja/Tomate.
2. Definição de máscara de ilhota por desenho manual(Figura 3c)
   1. Crie uma nova superfície (símbolo azul) e no assistente escolha "Editar manualmente". Mantenha o ponteiro no modo "Selecionar" e na exibição 3D despresoar "Volume" (em Cena) para visualizar seções.
   2. Para facilitar a discriminação na fronteira de ilhéus, ative todos os canais, incluindo ch 1-ch 3.
      NOTA: O canal Laranja/Tomate é útil para definir bordas de ilhotas pelo sinal da cápsula de tomate. Alternativamente, aumente a intensidade do canal para usar a autofluorescência de ilhotas multicanais e o sinal de fundo do detector como orientação.
   3. Na aba "Drawing" escolha "Contorno" e clique em "Desenhar" para começar a desenhar contornos ao redor da borda da ilhota começando na posição de fatia 1.
   4. Mova-se para uma nova posição de fatia e repita os contornos de desenho. Finalize com a última fatia na parte superior da ilhota e finalize clicando na guia "Criar superfície". Normalmente é suficiente para desenhar contornos a cada 10^fatias.
3. Segmentação de "Vasculatura de ilhotas" e fluorescência detomate ilhotausando máscara de ilhota(Figura 3d).
   1. Escolha o objeto "Máscara de Ilhota" previamente definido, vá para a guia de edição (símbolode lápis) e clique na guia "Máscara all", que abre uma nova janela.
   2. Escolha o canal anteriormente nomeado "Vasculatura" (ch 4) no menu suspenso da seleção do canal e ative as opções "Duplicate channel before applying mask", "Constant inside/outside", e defina voxels fora da superfície para "0.000", que cria um novo canal; renomear como "Vasculatura ilhota" (ch 6).
   3. Repita as etapas 7.3.1 e 7.3.2 e escolha o canal previamente criado "Tomate (todos)" (ch 5) no menu suspenso da seleção do canal para criar o novo canal; renomear como "Tomate ilhota" (ch 7).
4. Renderização superficial de vasculatura de ilhotas (Figura 3e)
   1. Crie uma nova superfície no menu "Cena" e no assistente escolha "Criação automática".
   2. Defina o canal de origem para "Islet vasculatura" (ch 6) e escolha subtração de fundo. A estimativa automática do limiar pode ser ajustada se necessário. Compare com o canal de fluorescência que responde (por exemplo, misturando entrada/saída da guia de superfície recém-criada). Prossiga no mago.
   3. Opcionalmente, use filtros. Por exemplo, escolha "Volume" e ajuste o filtro (amarelo) na janela, que pode remover objetos de superfície selecionados. Termine o assistente e nomeie o novo objeto de superfície "Vasculatura de ilhota".
5. Segmentação do sinal de fluorescência detomate ilhota(Figura 3f)
   1. No objeto de superfície "Islet vasculatura" criado anteriormente, vá para a guia de edição e clique na guia "Mascarar tudo", que abre uma nova janela.
   2. Escolha o canal anteriormente nomeado "Islet tomate" (ch 7) no menu de seleção do canal e defina voxels fora da superfície para "10.000", que cria o novo canal; renomear como "Vasculatura de tomate ilhota" (ch 8).
6. Segmentação do sinal de fluorescência da" cápsulade tomate "(Figura 3g)
   1. Escolha "Channel Aithmetic's" na guia "processamento de imagem" e digite "ch7-ch8", criando o novo canal; renomear como "Cápsula de Tomate" (ch 9).
      NOTA: O sinal de fluorescência de tomate deilhotaé subtraído do sinal total de fluorescência de" tomate ilhota".
7. Renderização superficial de "Vasculatura de tomate ilhota" e "cápsula de tomate"(Figura 3h)
   1. Siga o passo 7.4, e no assistente escolha os canais de origem "Vasculatura de tomate ilhota" (ch 8) ou "Cápsula de Tomate" (ch 9) para criar novos objetos de superfície em conformidade.
8. Renderização superficial da superfície total da ilhota(Figura 3i)
   1. Abra o arquivo backscatter da ilhota e crie uma nova superfície.
   2. No mago, escolha "Criação automática" e defina " Regiãode interesse".
      NOTA: "Região de interesse" é usada para separar os sinais de múltiplas ilhotas e para definir a profundidade da ilhota a ser analisada (por exemplo, topo 75 μm).
   3. Em "Intensidade absoluta" ajuste o limiar, se necessário. O objeto de superfície pode ser clicado ligado ou desligado para cruzar com a intensidade correspondente do canal. Feche o feiticeiro.
9. Quantificação (Figura 3j)
   1. Selecione um objeto de superfície criado no menu "Cena" e vá para a guia "Estatísticas".
   2. Para recuperar dados de volume detalhados no objeto de superfície selecionado, escolha a guia "Detalhada" e selecione "Valores específicos" e "Volume" no menu suspenso. Para recuperar um valor total de volume do objeto de superfície selecionado, vá para a guia "Detalhado" e escolha "Valores médios".

Resultados

Ilhotas humanas não rotuladas foram transplantadas no ACE de uma mulher de 8 semanas de idade. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. ROSA-tomate. Rag2^−/−) camundongos receptores. Para evitar a rejeição do tecido humano, os camundongos de rag2 imunodeficientes foram escolhidos como receptores. Nestes camundongos transgênicos, todas as células e tecidos expressaram uma proteína de fluorescência de tomate (mT) direcionada à membrana que p...

Discussão

Um método é apresentado para estudar o processo de enxerto de células de ilhotas pancreáticas humanas, observando o envolvimento do receptor e do tecido doador. Após uma cirurgia invasiva mínima implantando ilhotas humanas na câmara anterior de um olho de rato imunodeficente, o rato se recupera rapidamente em poucos minutos após a cirurgia. O procedimento é realizado em um olho. Geralmente, de 5 a 7 dias de postimplantação em diante a córnea é suficientemente curada para realizar imagens intravitais.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M