前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

要約

このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sor^tm4-Rag2^-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。

要約

ベータ細胞のイメージングは、小子移植を理解するための重要なステップです。ベータ細胞生物学の記録のための異なるイメージングプラットフォームが 開発され、インビボで利用されているが、それらは単一細胞分解能および連続的な縦断記録を可能にするという点で限られている。角膜の透明性のために、マウスの眼前房(ACE)は、ヒトおよびマウス膵島細胞生物学の研究に適している。ここでは、このアプローチを使用して、個々のヒト小口移植片の移植および再血管化の連続的な縦方向の記録を行うことができる方法の説明を示す。ヒトの小子移植片は、NODを使用して、ACEに挿入される。(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-マウスをレシピエントとして使用する。これにより、レシピエント対ドナー細胞の拡張の調査と、移植片のカプセル化および血管化を促進するレシピエント細胞の寄与を可能にする。また、レシピエント細胞を形成する島の体積またはセグメント化された血管系および小島カプセルの画像分析および定量化のためのステップバイステップのアプローチが概説されている。

概要

糖尿病は、膵島ベータ細胞の喪失または機能不全からのインスリン産生不十分な結果として、血糖のレベルの上昇を特徴とする代謝疾患のグループを記述し、しばしばインスリン抵抗性を伴う。1型(T1D)および2型糖尿病(T2D)は、ベータ細胞の進行性機能障害が疾患の発症を引き起こす複雑な疾患である。T1Dはベータ細胞に対する自己免疫攻撃によって沈殿し、一方T2Dは代謝因子によって駆動されると考えられるが、低位の全身炎症の証拠は増加する¹である。ドナーヒト小島の移植は、特にT1D患者に、生理的血糖コントロールを提供する可能性を提供する。しかし、組織ドナーの不足と貧しい小地の生着は、主流の治療オプションになるための小地移植を妨げている。機能的な小子移植片のかなりの割合は、低酸素、炎症性、免疫原性宿主環境^22、33のために、即時の移植後期間(24〜48時間)で失われる。イレット生存率の改善のための介入方法の効率を評価するためには、このような移植の継続的なモニタリングが必要である。

移植後に移植されたヒト膵島の運命を画像化および追跡するin vivo技術は、糖尿病研究^4,55に依然として⁴課題である。現在までに、非侵襲的イメージング技術は、陽電子放出断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、または超音波(US)を含む、実験条件⁵における移植された小島の定量化および機能評価の可能性を示す。しかし、小さな小さな小さな小さな小さな小さい小さい小さいと、それらのモダリティによる定量的な測定は、不十分な解像度に苦しむ。眼前室(ACE)を観察用の移植部位としては、長期間にわたって効果的に高い空間分解能と頻繁なモニタリングを提供する有望な非侵襲的イメージングソリューション^である。この方法は、マウスの小子生物学(ヤンら⁷でレビュー)、自己免疫免疫応答^8、ならびにヒトの小子移植^9,9、10を研究するためにうまく利用されている。

ここでACE移植法を2光子イメージング手法と組み合わせて、移植後最大10ヶ月間、個々の膵島移植片に対する連続的かつ繰り返しの記録によってヒト膵島の生着プロセスのダイナミクスを調べる。より大きな撮像深度の多光子イメージング特性と、全体的な光漂白および光損傷の減少は、共焦点顕微鏡¹¹のイメージング限界を克服する。蛍光イメージングの定量化には、小島サンプル調製、小島移植、画像取得、島のノイズや背景を除去するための画像フィルタリング、セグメンテーション、定量、データ分析など、いくつかの段階が含まれます。最も困難な手順は、通常、イメージを複数のパーツまたはリージョンに分割または分割することです。これには、バックグラウンドノイズから信号を分離することや、色や形状の類似性に基づいてボクセルの領域をクラスタリングして、たとえば、アイレット血管系を表す3Dボリュームのボクセルを検出してラベル付けすることが含まれます。セグメント化されると、オブジェクトのボリュームサイズなどの統計は、通常、簡単に抽出できます。提供される方法は、セグメンテーションやデータ可視化などのイメージングデータの定量・抽出方法である。特に注意は、ヒト小島における自己蛍光の除去と、受け手細胞を形成する小島の血管系と小島カプセルの区別に関する。

プロトコル

スウェーデンのルンドにある地域倫理委員会は、人間を含む研究の倫理的見直しに関する法律に従って研究を承認した。動物実験は、スウェーデンの動物実験の倫理に厳密に従って行われ、マルメとルンドの倫理委員会によって承認されました。6〜8週齢の免疫不全NOD。(Cg)-Gt(ローザ)26Sor^tm4-ラグ2^-/- (NOD.ローザトマト。^Rag2-/-)レシピエントマウスは、ヒト小島¹⁰の移植のレシピエントとして使用した。 Rag2

1. 移植のための小子の準備

1. 培養ヒト小島をCMRL 1066で10 mM HEPESで補い、 2 mM L-グルタミン、50 μg/mLゲンタマイシン、0.25 μg/mL真菌、20μg/mLシプロフロキサシン、10 μg/mLチクロキシフロキサキシン、10 mMニコ₂チンアミド(NIC)、および10%熱不活化ヒト血清(5%CO2で37°C)、^{および移植まで}空気を加湿した。
   注:島は外分泌組織を含まないと培養中に互いに触れ合うべきではありません。外分泌組織は半透明に見える。
2. 移植の日に、引っ張られたガラスの毛細管に接続された吸引管アセンブリを使用して、新しいペトリ皿に小島を含む培養培地を移す。
   注:または、200 μL ピペットを使用してください。ペトリ皿の裏を着色すると、小島をステレオ顕微鏡で区別しやすくなります。
3. ステレオ顕微鏡を使用して、移植ごとに約20~40個の小島を摘み取り、1.5mLチューブに移します。チューブをインキュベーターの培養培地で上部に充填します。
4. パラフィンフィルムでチューブを密封し、移植まで氷の上に保管してください。移植の回数に応じて適量を準備する。
5. あるいは、培養で島を保ち、各移植の直前にそれらを選ぶために手術室で_CO2 インキュベーターが利用できることを確認してください。

2. 移植装置・手術台の準備

注:すべての外科用ツールはオートクレーブされ、手術台と器具は70%のアルコールで汚染される。

1. ステレオタックスヘッドホルダーをノーズマスクで麻酔に接続し、暖房パッドをオンにします。
2. ガス密ハミルトンシリンジをポリエチレンチューブと鈍いエンドアイカニューレに接続します。
   注: すべての部品をPBSで埋めるのは、アセンブリの前に行うことをお勧めします。閉じ込められた気泡を確認し、存在する場合は取り外します。
3. ハミルトンのシリンジをテーブル(図1a)または可動ベース(図1e)にしっかりと取り付け、カニューレを垂れ下ろして、チューブをステレオ顕微鏡に取り付けます(すなわち、待機位置)。
   メモ:取り外しや再び取り付けやすいので、外科テープを使用してください。
4. 0.1 mg/kg ブプレノルフィン溶液で満たされた30G針に接続された1 mLの注射器を準備します。
5. 滅菌PBSで注射器を準備します。あるいは、ピペットを使用します。
6. 暖房ランプ付きの清潔なウェイクアップケージを脇に置きます。

3. 手術のためのレシピエントマウスの麻酔と位置付け

注:すべての動物は、ルンド大学の動物施設で病原体のない環境で飼育され、維持されました。

1. 40%O₂/60%N 2/3%イソフルランで₂満たされたチャンバー内でマウスを麻酔し、麻酔付きマウスを温かい加熱パッドのヘッドホルダープラットフォームに移します(図1a)。ペダル反射の欠如を確認してください。
   注:イソフルラン麻酔は、手術後の速い回復のための麻酔の好ましい方法です。顕微鏡室はイオブルランを使用するために適切に換気されなければならない。
2. マウスのスナを40%O2 /60%N2/0.9%~1.5%₂イソフルラン麻酔機に接続された麻酔マスクに入れます。₂親指と指を使って頭を少し上げ、側面の金属片を使用して固定します。耳の部分が耳の真下に固定されていることを確認します。マウスの背面に0.1mg/kgブプレノルフィン溶液を皮下に注入する。
   メモ:ブプレノルフィンは 鎮痛薬として使用されます。
3. 手術する目が上向きになり、研究者に近いように頭を傾けます。
4. 鈍い鉗子を使用して移植する目のまぶたを穏やかに引き込み、目を飛ばしてピンセットでゆるく固定します。ピンセットの先端がヘッドホルダープラットフォームに取り付けられたポリテーンチューブで覆われていることを確認します(図1a、挿入)。
5. 滅菌PBSの液滴を目に塗布することで、常に両眼を濡らしてください。
6. 密閉された1.5mLチューブ(セクション1)から滅菌PBSのペトリ皿にヒト小島を移し、細胞培養培地の移動量を最小限に抑えるために小島が互いに近いであることを確認する(図1c)。
7. ハミルトンシリンジにポリテーンチューブを介して接続された眼カニューレの〜20〜30の小島を拾います。
   注:小島でできるだけ少ない液体を取ります。
8. チューブを上下逆さまに掛け、ステレオ顕微鏡に取り付けます(図1d)。チューブを慎重にテープで貼り付け、小島をカニューレに向かってチューブの端に沈めます。

4. 移植手順

注:この方法は、マウス島の移植のために以前に説明されています⁶.ここでは、少し変更された手順を示します。

1. 後ろ足のパッドをつまんで、マウスが眠っていることを確認します。
2. 血流を乱さずに目を抑制する鉗子を締め、無菌PBSの液滴を目に当てなさい。
3. メスとして25G針を使用して、上向きにベベル、慎重に角膜の先端の半分だけを貫通し、単一の側面切開を行います。上向きの角度で穴を作ります。穴は移植後より容易に密封する(図1f)。
4. カニューレに小島をプリロードして角膜を慎重に持ち上げ、ゆっくりと目に小島を塗布します。虹彩の損傷を防ぐために前房にカニューレを挿入することを避けるが、むしろ角膜の開口部に対して慎重に押す(図1g)。 ACE からカニューレをゆっくりと引き込む。
   注:3~8 μLの注入量を目指します。体積が大きすぎると、眼が不必要に高い眼圧にさらされ、前房から注入された小島の還流を招く可能性があります。
5. 眼室内の圧力の増大による小島の挿入に伴う困難に直面した場合、側面切開部位を補強して切開部位を拡大し、島を再適用する。
   注:時折、導入された気泡は、スペースホルダーとして使用することができます。
6. 目に目ジェルを塗布し、目を抑制する鉗子を緩め、イオブルランの上にマウスを8〜10分間同じ位置に置いて、島をセットさせます。
7. まぶたを保持している鉗子を取り外し、まぶたを通常の位置に戻します。
8. ヘッドホルダーからマウスを取り外し、目覚めのケージに移します。
9. マウスが目を覚まして移動したら、元のケージに戻し、スキャンするまで動物のハウジングに保管してください(少なくとも5日間は推奨)。

5. 2光子顕微鏡による埋め込みヒト小島のイメージング

注:2光子イメージングの前に移植後4〜5日の蛍光立体顕微鏡(図2a–c)を用いて眼の概要画像を撮ることを、関心の高い島を局所化することを推奨します。移植後の早い段階で目をしっかりと拘束しすぎないようにしてください。2光子イメージング6~7日の移植を使用してください。

1. イメージ取得ソフトウェアを起動します( 資料一覧を参照)。「レーザー」メニューでマイタイレーザー(電源"ON")をアクティブにし、「ライトパス」メニューで波長を900nmに設定し、5%~10%レーザーパワー(スライダーを使用)から最小限の伝送レーザーパワーを適用します。
   メモ:スキャン中に、必要に応じてレーザーパワーを調整します。
2. 緑、オレンジ、および赤のチャンネルを設定します。次のように、非スキャントディテクタ(NDD)と放出フィルタ情報を使用して、同時に3つの非スキャン検出器(NDD)に発光光を収集します。緑/自己蛍光、500〜550 nm;オレンジ/トマト,565-610nm(図2d)。
3. ヘッドホルダーステージを電動顕微鏡ステージに設置し、ガスマスクを麻酔機のチューブと換気システムに接続されたチューブに接続します。暖房パッドをオンにします。
4. 受け取り側マウスを麻酔し、ヘッドホルダープラットフォームに移し、目を拘束してイメージングを行い、上記のブプレノルフィン溶液を投与します(ステップ3.1~3.5)。
5. 必要に応じて、イオブルランの蒸気を調整します。1分間に55~65回の呼吸速度(bpm)は最適な麻酔を示します。麻酔が深すぎる場合、速度は、重い呼吸やあえぎで<50 bpmになります。明るすぎると、速度は表面呼吸で70bpmになります。15分ごとに目視検査を行い、麻酔中のマウスを注意深く監視します。
   注:麻酔はマウスからマウス、マウスの緊張、および麻酔下の時間が¹³に進行するにつれて異なります。
6. 角膜とレンズの間の浸漬液として眼に十分な眼ゲルを投与し、ゆっくりと蓄積することを可能にする(図2f、挿入)。気泡を避けてください。
   注:柔軟な金属ホースランプを備えたサイド照明は、焦点を調整し、小子移植片を局所化することをお勧めします。
7. 血管を可視化するために、使い捨てインスリン30Gシリンジを用いて、100μLの画像化剤(例えば、アンジオセンス680)を尾静脈内に静脈内投与する。
8. 「取得モード」では、フレームサイズを512 x 512、スキャン速度に調整します。
   注意:スキャンが遅い(すなわち、ドウェル時間を増やす)信号対雑音比が向上します。
9. 「チャンネル」メニューでは、ライブスキャンモードで画面上に画像が表示されるまで信号を増幅するために、ボルトの各PMTのマスターゲインを調整します。この値が大きいほど、検出器は信号とノイズに対する感度が高くなります。
   注: 500 ~ 800 V の値を使用することをお勧めします。
10. 「Zスタック」メニューでは、手動でフォーカスを小子移植片の上部に移動して、zスタックの始まりと終わりを定義します。「最初に設定」を選択して位置を保存します。「最後に設定」を選択して、左寄りの移植片に焦点を合わせることができる最後の底面に移動し、位置を保存します。z ステップサイズは 2 μm で使用します。
11. [実験の開始] タブをクリックして最終的なイメージ スタックを収集し、8 ビット CZI (カール ツァイス形式) ファイルとして保存します。

6. 共焦点顕微鏡による移植ヒト小島のイメージング

注:移植された小島の総体積、形態、可塑性は、レーザー後方散乱光¹⁰の検出により別のスキャン(すなわち、別のトラック)でin vivo散乱信号を監視することによって評価することができる。

1. メインビームスプリッター(LBFフィルタ)を取り出し、「ライトパス」ダイアログで、共焦点イメージング用の別のトラックを設定します。633 nmの波長とレーザー光と同じ波長の検出を有するアルゴンレーザーを選択してください。Zスタックは、後方散乱光信号用のステップサイズ2~3μmで取得します。
2. z スタック設定をリジャストして、すべての小子を記録するようにします (ステップ 5.10 を参照)。
3. イメージスタックを取得し、8ビットCZIファイルとして保存します。

7. 画像解析

注: この手順では、商用ソフトウェア (「 資料表」を参照) が使用されました。

1. イレットの自己蛍光を除去する(図3b)
   1. [画像処理] タブで "チャンネル算術" を選択し、 "ch1-ch2" と入力します。これにより、新しいチャンネル4(ch 4)が作成されます。として名前を変更 "血管構造"
      メモ:緑/自己蛍光チャネルは、レッド/アンジオセンスチャンネルから差し引かれます。
   2. 前の手順を繰り返し、"ch3-ch2"と入力して新しいチャンネルを作成します (ch 5)。「トマト (すべて)」と改名します。
      注: オレンジ/トマトチャンネルから緑/自己蛍光チャンネルを差し引きます。
2. 手動描画によるアイレットマスクの定義 (図 3c)
   1. 新しいサーフェス (青いシンボル) を作成し、ウィザードで [手動で編集]を選択します。ポインタを [選択]モードで、3D ビューで [ボリューム] ([シーン]の下) をクリック解除してセクションを視覚化します。
   2. 簡単に小子の境界の識別のために、ch 1–ch 3を含むすべてのチャネルをアクティブにします。
      注:オレンジ/トマトチャンネルは、トマトカプセル信号で小海峡の境界を定義するのに便利です。あるいは、チャネル強度を高くして、マルチチャンネルの小子自己蛍光と検出器のバックグラウンド信号をガイダンスとして使用します。
   3. [描画] タブで [輪郭] を選択し、[描画] をクリックして、スライス位置 1 から始まる、小地の境界線の周囲の輪郭の描画を開始します。
   4. 新しいスライス位置に移動し、描画の輪郭を繰り返します。最後のスライスを小水の上に置き終え、[サーフェスの作成] タブをクリックして終了します。通常は、10^番目 のスライスごとに輪郭を描くのに十分です。
3. 「小子脈管構造」と「アイレットトマト」のセグメンテーションは、アイレットマスクを用いた蛍光(図3d)
   1. 定義済みの"Islet マスク" オブジェクトを選択し、編集タブ (鉛筆 の記号) に移動して、新しいウィンドウを開く [すべてマスク] タブをクリックします。
   2. チャンネル選択ドロップダウンメニューで以前に命名したチャンネル"Vasculature"(ch4)を選択し、マスクを適用する前に「チャンネルを複製する」を有効にして、サーフェス外のボクセルを"0.000"に設定すると、新しいチャネルが作成されます。「小子脈管構造」(ch 6)と改名します。
   3. ステップ 7.3.1 と 7.3.2 を繰り返し、チャンネル選択ドロップダウンメニューで以前に作成したチャンネル"Tomato(すべて)"(ch 5)を選択して新しいチャンネルを作成します。「小子トマト」(ch 7)と改名します。
4. 小地血管系の表面レンダリング(図3e)
   1. [シーン] メニューで新しいサーフェスを作成し、ウィザードで [自動作成] を選択します。
   2. ソースチャネルを以前に作成した「Islet血管構造」(ch 6)に設定し、バックグラウンド減算を選択します。自動しきい値推定は、必要に応じて調整できます。応答蛍光チャネルと比較します(例えば、新しく作成されたサーフェスタブをブレンド/ブレンドして)。ウィザードを続行します。
   3. 必要に応じて、フィルターを使用します。たとえば、[ボリューム] を選択し、選択したサーフェス オブジェクトを削除できるウィンドウでフィルタ (黄色) を調整します。ウィザードを終了し、新しいサーフェス オブジェクトに"Islet 血管構造"という名前を付けます。
5. 「小子トマト脈管系」蛍光シグナルのセグメンテーション(図3f)
   1. 以前に作成した"Islet 血管構造" サーフェス オブジェクトで、編集タブに移動し、新しいウィンドウを開く [すべてマスク] タブをクリックします。
   2. チャンネル選択ドロップダウンメニューで、以前に名前が付けられたチャンネル"Islet tomato"(ch 7) を選択し、新しいチャンネルを作成する「10.000」に外表面のボクセルを設定します。「小子トマト血管構造」(ch 8)と改名します。
6. 「トマトカプセル」蛍光シグナルのセグメンテーション(図3g)
   1. [ 画像処理] タブで [チャンネル演算] を選択し、 "ch7-ch8" と入力して、新しいチャネルを作成します。「トマトカプセル」(ch 9)と改名します。
      注: "小子トマト脈管系"蛍光シグナルは、全「アイレットトマト」蛍光シグナルから差し引かれます。
7. 「小地トマトの脈管」と「トマトカプセル」(図3h)の表面レンダリング
   1. 手順 7.4 に従い、ウィザードでソース チャンネル "アイレット トマト血管構造" (ch 8) または "トマト カプセル" (ch 9) を選択して、それに応じて新しいサーフェス オブジェクトを作成します。
8. 総小水界の表面レンダリング (図 3i)
   1. 小子の後方散乱ファイルを開き、新しいサーフェスを作成します。
   2. ウィザードで [自動作成] を選択し、対象地域を定義します。
      注: 「対象領域」は、複数の島の信号を分離し、分析する島の深さを定義するために使用されます(例えば、上位75μm)。
   3. "絶対強度" では、必要に応じてしきい値を調整します。サーフェス オブジェクトをクリックまたはオフにして、対応するチャネル強度とクロスチェックできます。ウィザードを閉じます。
9. 定量化 (図 3j)
   1. [シーン] メニューで作成したサーフェス オブジェクトを選択し、[統計情報] タブに移動します。
   2. 選択したサーフェス オブジェクトの詳細なボリューム データを取得するには、[詳細]タブを選択し、ドロップダウン メニューから [特定の値] と [ボリューム] を選択します。選択したサーフェス オブジェクトの合計ボリューム値を取得するには、[詳細]タブに移動し、[平均値] を選択します。

結果

非標識ヒト小島を8週齢の雌NODのACEに移植した。(Cg)-Gt(ローザ)26Sor^tm4-ラグ2^-/-(NOD.ローザトマト。Rag2^-/−)レシピエントマウス。ヒト組織拒絶反応を防ぐために、免疫不全Rag2ノックアウトマウスをレシピエントとして選んだ。これらのトランスジェニックマウスにおいて、全ての細胞および組織は、レシピエントおよびドナー組織の明確?...

ディスカッション

レシピエントとドナー組織の関与を観察することによってヒト膵島細胞移植プロセスを研究する方法を提示する。免疫不全マウス眼の前房にヒトの小島を移植する最小限の侵襲手術の後、マウスは手術後数分以内に迅速に回復する。手順は片目で行われます。一般に、5~7日以降、角膜は、生体内イメージングを行うのに十分に治癒する。

このプロトコルでは、ヒトの小?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M