Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Zusammenfassung

Die Bildgebung von Betazellen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Letentransplantation. Obwohl verschiedene Bildgebungsplattformen für die Aufzeichnung der Beta-Zellbiologie entwickelt und in vivogenutzt wurden, sind sie in Bezug auf die Zulassung von Einzelzellauflösung und kontinuierlichen Längsaufnahmen begrenzt. Aufgrund der Transparenz der Hornhaut eignet sich die vordere Augenkammer (ACE) bei Mäusen gut, um die Biologie der menschlichen und Mauspankreasinsel zu untersuchen. Hier ist eine Beschreibung, wie dieser Ansatz verwendet werden kann, um kontinuierliche Längsschnittaufnahmen von Transplantationen und Revaskularisation enterblichen menschlichen Islettransplantaten durchzuführen. Menschliche Islettransplantate werden mit NOD in den ACE eingeführt. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-Mäuse als Empfänger. Dies ermöglicht die Untersuchung der Expansion von Empfänger- gegen Spenderzellen und den Beitrag von Empfängerzellen zur Förderung der Verkapselung und Vaskularisation des Transplantats. Darüber hinaus wird ein Schritt-für-Schritt-Ansatz für die Bildanalyse und Quantifizierung des Ischenvolumens oder der segmentierten Vaskulatur und der Isletkapsel bildenden Empfängerzellen skizziert.

Einleitung

Diabetes mellitus beschreibt eine Gruppe von Stoffwechselerkrankungen, die durch erhöhte Blutzuckerwerte gekennzeichnet sind, als Ergebnis unzureichender Insulinproduktion durch Verlust oder Dysfunktion von Betazellen der Pankreas-Islet, oft begleitet von Insulinresistenz. Typ-1 -Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) sind komplexe Krankheiten, bei denen die fortschreitende Dysfunktion der Betazellen die Entwicklung von Krankheiten verursacht. T1D wird durch einen Autoimmunangriff auf die Beta-Zellen gefällt, während T2D als durch metabolische Faktoren angetrieben wird, wenn auch mit zunehmenden Beweisen für eine niedriggradige systemische Entzündung¹. Die Transplantation von menschlichen Spenderinseln, insbesondere für T1D-Patienten, bietet das Potenzial zur physiologischen glykämischen Kontrolle. Ein Mangel an Gewebespendern und eine mangelhafte Islet-Transplantation haben jedoch verhindert, dass die Letentransplantation zu einer gängigen therapeutischen Option wird. Ein erheblicher Teil des funktionellen Islettransplantats geht in der unmittelbaren Posttransplantationsphase (24–48 h) aufgrund der hypoxischen, entzündlichen, immunogenen Wirtsumgebung^2,3verloren. Um die Effizienz der Interventionsmethoden zur Verbesserung des Überlebens der Leten zu bewerten, ist eine kontinuierliche Überwachung solcher Transplantationen erforderlich.

In-vivo-Techniken, um das Schicksal transplantierter menschlicher Pankreasinseln nach der Transplantation abzubilden und zu verfolgen, bleibt für die Diabetesforschung nach^{wie vor}eine Herausforderung 4^,5. Bislang zeigen nichtinvasive bildgebende Verfahren, einschließlich Positronenemissionstomographie (PET), Magnetresonanztomographie (MRT) oder Ultraschall (US), Potenzial für die Quantifizierung und funktionelle Bewertung transplantierter Inselchen unter experimentellen Bedingungen⁵. Angesichts der geringen Isätsgrößen leiden quantitative Messungen nach diesen Modalitäten jedoch unter unzureichender Auflösung. Die Vorderkammer des Auges (ACE) als Transplantationsstelle zur Beobachtung ist eine vielversprechende nichtinvasive bildgebende Lösung, die eine effektiv höhere räumliche Auflösung und häufige Überwachung über lange Zeiträume^{bietet 6}. Diese Methode wurde erfolgreich genutzt, um Maus Inselbiologie zu studieren (überprüft in Yang et al.⁷), Autoimmunimmunreaktionen⁸, sowie menschliche Insel Pfropfung^9,10.

Hier beiderageniert wird die ACE-Transplantationsmethode mit einem 2-Photon-Bildgebungsansatz, um die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantatprozesses durch kontinuierliche und wiederholte Aufnahmen an einzelnen Islettransplantaten bis zu 10 Monate nach der Transplantation zu untersuchen. Die Multiphotonen-Bildgebungseigenschaften größerer Bildtiefe und reduzierter Photobleich- und Fotoschäden überwinden die bildgebenden Grenzen der konfokalen Mikroskopie¹¹. Die Quantifizierung der fluoreszierenden Bildgebung umfasst mehrere Phasen, einschließlich der Vorbereitung von Inselproben, der Inseltransplantation, der Bildaufnahme, der Bildfilterung zur Entfernung von Inselrauschen oder -hintergrund, der Segmentierung, Quantifizierung und Datenanalyse. Der schwierigste Schritt ist in der Regel die Partitionierung oder Segmentierung eines Bildes in mehrere Teile oder Regionen. Dies kann die Trennung von Signal und Hintergrundrauschen oder Clustering-Bereiche von Voxeln auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in Farbe oder Form beinhalten, um Voxel eines 3D-Volumens zu erkennen und zu kennzeichnen, das beispielsweise die Vaskulatur der Islet darstellt. Nach der Segmentierung sind Statistiken wie Objektvolumengrößen in der Regel einfach zu extrahieren. Zur Verfügung gestellt wird eine Methode zur Quantifizierung und Extraktion der Bilddaten, wie Segmentierung und Datenvisualisierung. Besonderes Augenmerk wird auf die Entfernung der Autofluoreszenz bei menschlichen Inselchen und die Unterscheidung zwischen Inselvaskulatur und Inselkapsel bildenden Empfängerzellen.

Protokoll

Die regionale Ethikkommission in Lund, Schweden, genehmigte die Studie gemäß dem Gesetz über die ethische Überprüfung von Forschung unter Einbeziehung von Menschen. Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit der schwedischen Ethik der Tierversuche durchgeführt und von den Ethikkommissionen von Malmö und Lund genehmigt. 6 bis 8 Wochen alte immundefiziver NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. ROSA-Tomate. Rag2^-/-) Empfängermäuse wurden als Empfänger für die Transplantation menschlicher Inselchen¹⁰verwendet.

1. Inselvorbereitung für die Transplantation

1. Kultur menschliche Inselchen in CMRL 1066 ergänzt mit 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 50 g/ml Gentamycin, 0,25 g/ml-Pilzzone, 20 g/ml Ciproxfloxacin, 10 mM Nicotinamid (NIC) und 10 % hitzeinaktiviertes humanes Serum bei 37 °C in 5 %_CO2 und befeuchteter Luft bis zur Transplantation, wie zuvor^{beschrieben 12}.
   HINWEIS: Inselchen sollten frei von Exokringewebe sein und sich in der Kultur nicht berühren. Exokringewebe erscheinen durchscheinend.
2. Übertragen Sie am Tag der Transplantation Kulturmedien, die die Inselchen enthalten, mit einer Aspiratorrohr-Baugruppe, die mit einer gezogenen Glaskapillare verbunden ist, auf eine neue Petrischale.
   HINWEIS: Alternativ können Sie eine 200-L-Pipette verwenden. Das Färben der Rückseite der Petrischale trägt dazu bei, dass die Inselchen unter dem Stereomikroskop leichter zu unterscheiden sind.
3. Mit einem Stereomikroskop wählen Sie 20 bis 40 Inselchen pro Transplantation und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml-Rohr. Füllen Sie die Röhre nach oben mit Kulturmedien aus dem Inkubator.
4. Versiegeln Sie die Rohre mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bis zur Transplantation auf Eis. Bereiten Sie einen angemessenen Betrag für die Anzahl der durchgeführten Transplantationen vor.
5. Alternativ können Sie₂ sicherstellen, dass im Operationssaal ein CO2-Inkubator zur Verfügung steht, um Inselchen in Kultur zu halten und sie unmittelbar vor jeder Transplantation zu pflücken.

2. Vorbereitung von Transplantationsgeräten und Operationstisch

HINWEIS: Alle chirurgischen Werkzeuge sollten autoklaviert und der Operationstisch und die Instrumente mit 70% Alkohol desinfiziert werden.

1. Schließen Sie einen stereotaxic Kopfhalter über eine Nasenmaske an die Anästhesie an und schalten Sie das Heizkissen ein.
2. Schließen Sie eine gasdichte Hamilton-Spritze an Polyethylenschläuche und eine stumpfe Augenkanüle an.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, alle Teile vor der Montage mit PBS zu füllen. Überprüfen Sie, ob die Luftblasen eingeschlossen sind, und entfernen Sie sie, falls vorhanden.
3. Befestigen Sie die Hamilton-Spritze fest am Tisch (Abbildung 1a) oder eine bewegliche Basis (Abbildung 1e) und befestigen Sie die Schläuche am Stereomikroskop, wobei die Kanüle nach unten hängt (d. h. die Warteposition).
   HINWEIS: Verwenden Sie chirurgisches Klebeband, da es leicht zu entfernen und wieder anzubringen ist.
4. Bereiten Sie eine 1 ml Spritze vor, die mit einer 30 G Nadel verbunden ist, die mit 0,1 mg/kg Buprenorphinlösung gefüllt ist.
5. Bereiten Sie eine Spritze mit sterilem PBS vor. Alternativ können Sie eine Pipette verwenden.
6. Legen Sie einen sauberen Weckkäfig mit Heizlampe beiseite.

3. Anästhesie und Positionierung von Empfängermäusen für die Operation

HINWEIS: Alle Tiere wurden in einer pathogenenfreien Umgebung in den Tieranlagen der Universität Lund gezüchtet und gepflegt.

1. Anästhetisieren Sie die Maus in einer Kammer gefüllt mit 40% O₂/60% N₂/3% Isofluran und übertragen Sie die anästhesierte Maus auf die Kopfhalterplattform auf einem warmen Heizpad (Abbildung 1a). Prüfen Sie, ob keine Pedalreflexe mehr zur Zeit sind.
   HINWEIS: Isoflurane Anästhesie ist die bevorzugte Methode der Anästhesie für eine schnelle Genesung nach der Operation. Der Mikroskopraum muss für die Verwendung von Isofluran ordnungsgemäß belüftet werden.
2. Legen Sie die Schnis der Maus in die Anästhesiemaske, die mit 40% O₂/60% N₂/0,9%–1,5% Isoflurananästhesiemaschine verbunden ist. Verwenden Sie Daumen und Finger, um den Kopf leicht nach oben zu heben und ihn mit den Metallteilen an den Seiten zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Ohrhörer den Kopf direkt unter den Ohren fixieren. 0,1 mg/kg Buprenorphinlösung subkutan auf der Rückseite der Maus injizieren.
   HINWEIS: Buprenorphin wird als Schmerzmittel verwendet.
3. Neigen Sie den Kopf so, dass das zu operierende Auge nach oben zeigt und dem Forscher nahe ist.
4. Ziehen Sie vorsichtig die Augenlider des Auges zurück, um mit stumpfer Zange transplantiert zu werden, knallen Sie das Auge heraus und fixieren Sie locker mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Pinzette mit einem Polythenrohr bedeckt sind, das an der Kopfhalterplattform befestigt ist (Abbildung 1a, Einsatz).
5. Halten Sie immer beide Augen nass, indem Sie ein Tröpfchen sterilen PBS auf das Auge auftragen.
6. Übertragen Sie die menschlichen Inselchen aus dem versiegelten 1,5 ml Rohr (Abschnitt 1) auf eine Petrischale mit sterilem PBS und stellen Sie sicher, dass die Inselchen nahe beieinander liegen, um die Menge der übertragenen Zellkulturmedien zu minimieren (Abbildung 1c).
7. Nehmen Sie 20-30 Inselchen in der Augenkanüle auf, die über Polythene-Schläuche mit der Hamilton-Spritze verbunden ist.
   HINWEIS: Nehmen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich mit den Inseln auf.
8. Hängen Sie die Schläuche auf den Kopf und befestigen Sie sie am Stereomikroskop (Abbildung 1d). Kleben Sie die Schläuche sorgfältig, damit die Inselchen bis zum Ende der Röhre in Richtung der Kanüle sinken.

4. Transplantationsverfahren

HINWEIS: Diese Methode wurde zuvor für die Transplantation von Mausinseln⁶beschrieben. Hier wird ein leicht modifiziertes Verfahren vorgestellt.

1. Kneifen Sie die Pads an den Hinterbeinen, um sicherzustellen, dass die Maus schläft.
2. Ziehen Sie die Zange, die das Auge zurücksperrt, ohne den Blutfluss zu stören, und tragen Sie ein Tröpfchen steriler PBS auf das Auge auf.
3. Mit einer 25 G Nadel als Skalpell nach oben abschrägen, vorsichtig nur die Hälfte der Spitze in der Hornhaut durchdringen und einen einzigen seitlichen Schnitt machen. Machen Sie das Loch in einem Aufwärtswinkel; das Loch wird nach der Transplantation leichter versiegeln (Abbildung 1f).
4. Heben Sie die Hornhaut vorsichtig mit der mit Inselchen vorinstallierten Kanüle an und tragen Sie die Inselchen langsam ins Auge. Vermeiden Sie das Einsetzen der Kanüle in die vordere Kammer, um eine Beschädigung der Iris zu verhindern, sondern drücken Sie vorsichtig gegen die Hornhautöffnung (Abbildung 1g).  Ziehen Sie die Kanüle langsam vom ACE ab.
   HINWEIS: Ziel für ein Injektionsvolumen von 3–8 l. Wenn das Volumen zu groß ist, setzt es das Auge einem unnötig hohen Augeninnendruck aus und kann zu einem Rückfluss der injizierten Inselchen aus der vorderen Kammer führen.
5. Bei Schwierigkeiten beim Einsetzen der Inselchen aufgrund des erhöhten Drucks in der Augenkammer, vergrößern Sie die Einschnittstelle durch Verstärkung der seitlichen Einschnittstelle und erneute Anwendung der Inselchen.
   HINWEIS: Gelegentlich können eingeführte Luftblasen als Raumhalter verwendet werden.
6. Tragen Sie Augengel auf das Auge auf, lösen Sie die augenberuhigenden Zangen und lassen Sie die Maus auf Isofluran in der gleichen Position für 8–10 min, um die Inselchen setzen zu lassen.
7. Entfernen Sie die Zange, die das Augenlid hält, und bringen Sie das Augenlid wieder in seine normale Position.
8. Entfernen Sie die Maus aus dem Kopfhalter und übertragen Sie sie in einen Weckkäfig.
9. Wenn die Maus wach ist und sich bewegt, übertrage sie zurück in den ursprünglichen Käfig und halte bis zum Scannen im Tiergehäuse auf (mindestens 5 Tage werden empfohlen).

5. Bildgebung von implantierten menschlichen Inseln durch 2-Photonenmikroskopie

HINWEIS: Es wird empfohlen, die interessierten Inselchen 4–5 Tage nach der Transplantation 4–5 Tage nach der Transplantation mit einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2a–c) zu erstellen. Vermeiden Sie es, das Auge so früh nach der Transplantation zu fest zu halten. Verwenden Sie 2-Photonen-Bildgebung 6–7 Tage nach der Transplantation.

1. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware (siehe Tabelle der Materialien). Aktivieren Sie im Menü"Laser" den Mai Tai Laser (Power "ON") und im Menü "Lichtpfad" die Wellenlänge auf 900 nm und wenden Sie eine minimale Übertragungslaserleistung ab 5%–10% Laserleistung an (verwenden Sie Schieberegler).
   HINWEIS: Stellen Sie beim Scannen die Laserleistung nach Bedarf ein.
2. Setzen Sie grüne, orange und rote Kanäle. Sammeln Sie Emissionslicht gleichzeitig auf drei nicht descanned Detektoren (NDD) mit einem dichronen Spiegel (LBF 760) und Emissionsfilterinformationen wie folgt: Rot/Angiosense 680, 690–730 nm; Grün/Autofluoreszenz, 500–550 nm; orange/Tomato, 565–610nm (Abbildung 2d).
3. Stellen Sie die Kopfhalterstufe auf die motorisierte Mikroskopstufe und schließen Sie die Gasmaske an die Schläuche der Anästhesiemaschine und der mit dem Lüftungssystem angeschlossenen Schläuche an. Schalten Sie das Heizkissen ein.
4. Anästhesisieren Sie die Empfängermaus, übertragen Sie sie auf die Kopfhalterplattform, halten Sie das Auge für die Bildgebung zurück und verabreichen Sie buprenorphinlösung wie oben beschrieben (Schritte 3.1–3.5).
5. Stellen Sie isoflurane-Dämpfe nach Bedarf ein. Eine Atemrate von 55 bis 65 Atemzügen pro Minute (bpm) deutet auf eine optimale Anästhesie hin. Wenn die Anästhesie zu tief ist, wird die Rate <50 bpm mit schwerem Atmen oder Vergasen sein; wenn zu leicht, wird die Rate >70 bpm mit oberflächlicher Atmung sein. Sorgfältige Überwachung von Mäusen während der Anästhesie durch visuelle Inspektion alle 15 min.
   HINWEIS: Die Anästhesisierung variiert von Maus zu Maus, zwischen Mausstämmen und mit fortschreitender Zeit unter Anästhesie¹³.
6. Verabreichen Sie genügend Augengel auf das Auge als Tauchflüssigkeit zwischen der Hornhaut und der Linse, so dass es sich langsam ansammeln kann (Abbildung 2f, einfügen). Vermeiden Sie Luftblasen.
   HINWEIS: Seitenbeleuchtung mit einer flexiblen Metallschlauchlampe wird empfohlen, um den Fokus einzustellen und Islettransplantate zu lokalisieren.
7. Zur Visualisierung der Blutgefäße werden 100 l des Bildgebungsmittels (z. B. Angiosense 680) intravenös in die Schwanzvene mit einer Einweg-Insulin-30-G-Spritze verabreicht.
8. Passen Sie imErfassungsmodusdie Bildgröße auf 512 x 512 und die Scangeschwindigkeit an.
   HINWEIS: Langsamere Scans (d. h. erhöhung der Verweilzeit) verbessern das Signal-Rausch-Verhältnis.
9. Passen Sie im Menü "Kanäle" Master Gain für jedes PMT in Volt s an, um das Signal zu verstärken, bis ein Bild im Live-Scanmodus auf dem Bildschirm angezeigt wird. Je höher dieser Wert, desto empfindlicher wird der Detektor signal- und geräuscharm.
   HINWEIS: Bewahren Sie vorzugsweise Werte zwischen 500–800 V auf.
10. Definieren Sie im Menü "Z-Stack" den Anfang und das Ende des Z-Stacks, indem Sie den Fokus manuell an die Spitze des Islettransplantats verschieben. Position speichern, indem Sie "Set First" auswählen. Wechseln Sie zur letzten unteren Ebene, die im Islettransplantat fokussiert werden kann, und speichern Sie die Position, indem Sie"Letzte festlegen"auswählen. Verwenden Sie eine Z-Schritt-Größe von 2 m.
11. Sammeln Sie den endgültigen Bildstapel, indem Sie auf die Registerkarte"Experiment starten"klicken und als 8-Bit-CZI-Datei (d. h. im Carl Zeiss-Format) speichern.

6. Bildgebung implantierter menschlicher Inselchen durch konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Das Gesamtvolumen, die Morphologie und die Plastizität transplantierter Inselchen können durch Überwachung des In-vivo-Streusignals in einem separaten Scan (d. h. separater Spur) durch Detektion von Laser-Rückstreulicht¹⁰beurteilt werden.

1. Nehmen Sie den Hauptstrahl-Splitter (d. h. LBF-Filter) heraus und richten Sie im Dialog "Lichtpfad" eine separate Spur für die konfokale Bildgebung ein. Wählen Sie den Argon-Laser mit einer Wellenlänge von 633 nm und einer Detektion bei der gleichen Wellenlänge wie das Laserlicht. Z-Stacks werden mit einer Schrittgröße von 2–3 m für Das Rückstreulichtsignal erworben.
2. Passen Sie die Z-Stack-Einstellungen an, um sicherzustellen, dass die gesamte Islet aufzeichnet (siehe Schritt 5.10).
3. Erfassen Sie den Image-Stack und speichern Sie ihn als 8-Bit-CZI-Datei.

7. Bildanalyse

HINWEIS: Für diesen Schritt wurde kommerzielle Software (siehe Materialtabelle)verwendet.

1. Entfernen der Selbstfluoreszenz der Islet (Abbildung 3b)
   1. Wählen Sie auf der Registerkarte "Bildverarbeitung" "Kanalarithmetik" und geben Sie "ch1-ch2" ein. Dadurch entsteht ein neuer Kanal 4 (ch 4); Umbenennung in "Vaskulature".
      HINWEIS: Der Grün/Autofluoreszenzkanal wird vom Red/Angiosense-Kanal subtrahiert.
   2. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt und geben Sie "ch3-ch2" ein, um einen neuen Kanal zu erstellen (ch 5); Umbenennen in "Tomate (alle)".
      HINWEIS: Der Grün/Autofluoreszenzkanal wird vom Orange/Tomato-Kanal subtrahiert.
2. Definieren der Skelettmaske durch manuelles Zeichnen (Abbildung 3c)
   1. Erstellen Sie eine neue Oberfläche (blaues Symbol) und wählen Sie im Assistenten "Manuell bearbeiten" aus. Halten Sie den Zeiger im Modus"Wählen" und deaktivieren Sie in der 3D-Ansicht "Volume" (unter Szene), um Abschnitte zu visualisieren.
   2. Um die Diskriminierung an der Grenze der Iseue zu erleichtern, aktivieren Sie alle Kanäle, einschließlich ch 1–ch 3.
      HINWEIS: Der Orange/Tomaten-Kanal ist nützlich, um Inselränder durch das Tomato Capsule Signal zu definieren. Alternativ können Sie die Kanalintensität erhöhen, um die Autofluoreszenz der Multikanal-Insel und das Hintergrundsignal des Detektors als Anleitung zu verwenden.
   3. Wählen Sie auf der Registerkarte "Zeichnung""Kontur " aus und klicken Sie auf "Zeichnen", um Konturen um den kleinen Rahmen zu zeichnen, beginnend mit Schnittposition 1.
   4. Wechseln Sie zu einer neuen Slice-Position, und wiederholen Sie Zeichnungskonturen. Beenden Sie das Segment mit dem letzten Slice oben auf der Kleinen und enden, indem Sie auf die Registerkarte "Oberfläche erstellen"klicken. In der Regel reicht es aus, konturen alle^10. Scheiben zu zeichnen.
3. Segmentierung von "Islet Vasculature" und "Islet Tomato" Fluoreszenz mit Islet-Maske (Abbildung 3d).
   1. Wählen Sie das zuvor definierte Objekt"Islet-Maske", gehen Sie zur Bearbeitungsregisterkarte (Bleistiftsymbol), und klicken Sie auf die Registerkarte"Maske alle", die ein neues Fenster öffnet.
   2. Wählen Sie den zuvor benannten Kanal "Vasculature" (ch 4) im Dropdown-Menü der Kanalauswahl und aktivieren Sie die Optionen "Duplizieren Sie den Kanal, bevor Sie Maske anwenden", " Konstanteinnen/außen", und setzen Sie Voxel außerhalb der Oberfläche auf" 0.000", wodurch ein neuer Kanal erstellt wird; Isletvasculature(ch 6) umbenennen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 7.3.1 und 7.3.2 und wählen Sie den zuvor erstellten Kanal"Tomate (alle)" (ch 5) im Dropdown-Menü der Kanalauswahl aus, um den neuen Kanal zu erstellen; IsletTomato(ch 7) umbenennen.
4. Oberflächenwiedergabe der Ispaltung (Abbildung 3e)
   1. Erstellen Sie eine neue Oberfläche im Menü "Szene" und wählen Sie im Assistenten "Automatische Erstellung".
   2. Legen Sie den Quellkanal auf"Islet Vasculature" (ch 6) fest und wählen Sie die Hintergrundsubtraktion aus. Die automatische Schwellenwertschätzung kann bei Bedarf angepasst werden. Vergleichen Sie mit dem antwortenden Fluoreszenzkanal (z. B. durch Ein-/Ausblenden der neu erstellten Oberflächenregisterkarte). Fahren Sie im Assistenten fort.
   3. Optional verwenden Sie Filter. Wählen Sie beispielsweise "Volumen" und passen Sie den Filter (gelb) im Fenster an, wodurch ausgewählte Flächenobjekte entfernt werden können. Beenden Sie den Assistenten, und benennen Sie das neue Oberflächenobjekt "Islet vasculature".
5. Segmentierung von "Islet Tomato Vasculature" Fluoreszenzsignal (Abbildung 3f)
   1. Wechseln Sie im zuvor erstellten Oberflächenobjekt"Islet vasculature" zur Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie auf die Registerkarte"Maske alle", die ein neues Fenster öffnet.
   2. Wählen Sie den zuvor benannten Kanal "Islet tomato" (ch 7) im Dropdown-Menü der Kanalauswahl und setzen Sie Voxel außerhalb der Oberfläche auf "10.000", wodurch der neue Kanal erstellt wird; Umbenennung in "Islet tomato vasculature" (ch 8).
6. Segmentierung von "Tomatenkapsel" Fluoreszenzsignal (Abbildung 3g)
   1. Wähle "Channel Arithmetic's" in der Registerkarte" Bildverarbeitung" und tippe "ch7-ch8" ein, um den neuen Kanal zu erstellen; Umbenennen in "Tomatenkapsel" (ch 9).
      HINWEIS: Das Fluoreszenzsignal "Islet Tomato Vasculature" wird vom gesamten "Islet Tomato" Fluoreszenzsignal subtrahiert.
7. Oberflächendarstellung von "Islet Tomato Vasculature" und "Tomato capsule" (Abbildung 3h)
   1. Folgen Sie Schritt 7.4, und wählen Sie im Assistenten quellkanäle "Islet Tomato Vasculature" (ch 8) oder "Tomato capsule" (ch 9), um neue Oberflächenobjekte entsprechend zu erstellen.
8. Oberflächendarstellung der gesamten Isletoberfläche (Abbildung 3i)
   1. Öffnen Sie die Rückstreudatei der Islet, und erstellen Sie eine neue Oberfläche.
   2. Wählen Sie im Assistenten "Automatische Erstellung" und definieren Sie " Regionof interest".
      ANMERKUNG:"Region of interest" wird verwendet, um die Signale mehrerer Inselchen zu trennen und die Tiefe der zu analysierenden Insel zu definieren (z. B. oben 75 m).
   3. Passen Sie in "Absolute Intensität" den Schwellenwert bei Bedarf an. Das Oberflächenobjekt kann an- oder abgeklickt werden, um es mit der entsprechenden Kanalintensität abzukreuzen. Schließen Sie den Assistenten.
9. Quantifizierung (Abbildung 3j)
   1. Wählen Sie ein erstelltes Oberflächenobjekt im Menü "Szene" aus, und wechseln Sie zur Registerkarte "Statistiken".
   2. Um detaillierte Volumendaten im ausgewählten Oberflächenobjekt abzurufen, wählen Sie die Registerkarte "Detaillierte" und "Spezifische Werte" und "Volumen" aus dem Dropdown-Menü aus. Um einen Gesamtvolumenwert des ausgewählten Flächenobjekts abzurufen, wechseln Sie zur Registerkarte "Detaillierte" und wählen Sie "Durchschnittswerte".

Ergebnisse

Nicht gekennzeichnete menschliche Inselchen wurden in den ACE der 8 Wochen alten Hündin NOD transplantiert. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. ROSA-Tomate. Rag2^{-Empfängermäuse.} Um eine Abstoßung menschlichen Gewebes zu verhindern, wurden immundefiziende Rag2-Knockout-Mäuse als Empfänger ausgewählt. Bei diesen transgenen Mäusen exprimierten alle Zellen und Gewebe ein membranspezifisches Tomatenfluoreszenzprotein (mT), das eine klare Iden...

Diskussion

Eine Methode wird vorgestellt, um den Prozess der Pfropfzelltransplantation der menschlichen Pankreas-Islet-Zell-Transplantation zu untersuchen, indem die Beteiligung von Empfänger- und Spendergewebe beobachtet wird. Nach einer minimalinvasiven Operation, bei der menschliche Inselchen in die vordere Kammer eines immungeschwächten Mausauges implantiert wurden, erholt sich die Maus innerhalb weniger Minuten nach der Operation schnell. Das Verfahren wird auf einem Auge durchgeführt. In der Regel wird die Hornhaut ab 5–...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M