אולטרסאונד ממוקד המושרה פתיחת מחסום דם-מוח למיקוד מבנים במוח והערכת נוירומודולציה כימוגנטית

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להעברת הגן באמצעות פתיחה ממוקדת של מחסום דם במוח (BBB), הערכה של ביטוי הגנים המתקבל ומדידת פעילות נוירומודולציה של קולטנים כימוגנטיים באמצעות בדיקות היסטולוגיות.

Abstract

כימוגנטיקה ממוקדת אקוסטית (ATAC) מאפשרת בקרה לא פולשנית של מעגלים עצביים ספציפיים. ATAC משיג שליטה כזו באמצעות שילוב של אולטרסאונד ממוקד (FUS) המושרה על ידי פתיחת מחסום דם-מוח (FUS-BBBO), העברת גנים עם וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAV), והפעלה של איתות תאי עם קולטני חלבונים מהונדסים וכימוגנטיים והליגנדים הקוגנטיים שלהם. עם ATAC, ניתן להמיר אזורי מוח גדולים וקטנים בדיוק מילימטרי באמצעות יישום אולטרסאונד יחיד לא פולשני. התמרה זו יכולה מאוחר יותר לאפשר נוירומודולציה ארוכת טווח, לא פולשנית ונטולת מכשירים בבעלי חיים הנעים בחופשיות באמצעות תרופה. מאחר ש-FUS-BBBO, AAVs וכימוגנטיקה שימשו בבעלי חיים רבים, ATAC צריך להיות ניתן להרחבה גם לשימוש במינים אחרים של בעלי חיים. מאמר זה מרחיב פרוטוקול שפורסם בעבר ומתאר כיצד למטב את העברת הגנים עם FUS-BBBO לאזורי מוח קטנים עם הנחיית MRI, אך ללא צורך במכשיר FUS מסובך תואם MRI. הפרוטוקול, גם, מתאר את העיצוב של מיקוד עכבר ורכיבי ריסון שניתן להדפיס בתלת-ממד על ידי כל מעבדה וניתן לשנות אותם בקלות עבור מינים שונים או ציוד מותאם אישית. כדי לסייע ביכולת השחזור, הפרוטוקול מתאר בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרו-בועות, AAV וניפונקטורה בפיתוח ATAC. לבסוף, נתונים לדוגמה מוצגים כדי להנחות את החקירות הראשוניות של מחקרים באמצעות ATAC.

Introduction

השימוש בטכנולוגיות נוירומודולציה ספציפיות למעגלים, כגון אופטוגנטיקה^1,2 וכימוגנטיקה 3,4,5^, קידם את הבנתנו את המצבים הפסיכיאטריים כהפרעות במעגלים עצביים. מעגלים עצביים קשים למחקר וקשים עוד יותר לשליטה בטיפול בהפרעות מוחיות מכיוון שהם מוגדרים בדרך כלל על ידי סוגי תאים ספציפיים, אזורי מוח, מסלולי איתות מולקולריים ותזמון ההפעלה. באופן אידיאלי הן ליישומים מחקריים והן ליישומים קליניים, שליטה כזו תופעל באופן לא פולשני, אך השגת נוירומודולציה מדויקת ולא פולשנית היא מאתגרת. לדוגמה, בעוד תרופות נוירואקטיביות יכולות להגיע למוח באופן לא פולשני, הן חסרות ספציפיות מרחבית על ידי פעולה ברחבי המוח. מצד שני, גירוי חשמלי עמוק במוח יכול לשלוט באזורים מסוימים במוח, אך מתקשה לשלוט בסוגי תאים ספציפיים ודורש ניתוח ומיקום מכשיר⁶.

Acoustically Targeted Chemogenetics⁷ (ATAC) מספק נוירומודולציה עם ספציפיות מרחבית, סוג התא וטמפורלי. הוא משלב שלוש טכניקות: אולטרסאונד ממוקד המושרה על ידי פתיחת מחסום דם-מוח (FUS-BBBO) למיקוד מרחבי, שימוש בווקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) כדי להעביר גנים באופן לא פולשני תחת שליטה של מקדמים ספציפיים לסוג התא, וקולטנים כימוגנטיים מהונדסים כדי לווסת מעגלים עצביים נגועים באופן סלקטיבי באמצעות מתן תרופות. FUS היא טכנולוגיה שאושרה על ידי ה- FDA המנצלת את יכולתו של האולטרסאונד להתמקד עמוק בתוך רקמות, כולל המוח האנושי, בדיוק מרחבי מילימטרי. בעוצמה גבוהה, FUS משמש לאבלציה ממוקדת לא פולשנית, כולל טיפול שאושר על ידי ה- FDA לרעד חיוני⁸. FUS-BBBO משלב אולטרסאונד בעוצמה נמוכה עם מיקרו-בועות מערכתיות, המתנדנדות בכלי הדם במוקד האולטרסאונד, וכתוצאה מכך פתיחה מקומית, זמנית (6-24 שעות) והפיכה של BBB⁹. פתח זה מאפשר העברה של חלבונים^9,10, מולקולות קטנות 11 ווקטורים נגיפיים^7,12,13,14 למוח ללא נזק משמעותי לרקמות במכרסמים 10 ובפרימטים לא אנושיים ¹⁵. ניסויים קליניים נמשכים עבור FUS-BBBO^16,17, המצביעים על יישומים טיפוליים אפשריים של טכניקה זו.

העברת גנים נגיפיים באמצעות AAV מתקדמת במהירות גם לשימוש קליני עבור הפרעות במערכת העצבים המרכזית, עם אישורים רגולטוריים אחרונים של ה- FDA והאיחוד האירופי כאבני דרך עיקריות. לבסוף, קולטנים כימוגנטיים¹⁸, כגון קולטני מעצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (DREADDs), נמצאים בשימוש נרחב על ידי מדעני מוח כדי לספק שליטה פרמקולוגית על עירור עצבי בבעלי חיים טרנסגניים או נגועים ^19,20. DREADDs הם קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) שהונדסו גנטית להגיב למולקולות כימוגנטיות סינתטיות ולא לליגנדות אנדוגניות, כך שמתן מערכתי של ליגנדות אלה מגביר או מפחית את ההתרגשות של נוירונים המבטאים DREADD. כאשר שלוש טכנולוגיות אלה משולבות לתוך ATAC, הן יכולות לשמש לאפנון לא פולשני של מעגלים עצביים נבחרים עם דיוק מרחבי, סוג תא וטמפורלי.

כאן, אנו מרחיבים ומעדכנים פרוטוקול שפורסם בעבר עבור FUS-BBBO¹¹ על ידי הכללת מתודולוגיה למיקוד מדויק של אזורי מוח עם FUS-BBBO בעכברים באמצעות ציוד מיקוד פשוט המודפס בתלת-ממד. אנו מציגים גם יישום של FUS-BBBO ל- ATAC. אנו מראים את הצעדים הדרושים לאספקת AAVs הנושאים קולטנים כימוגנטיים, והערכה של ביטוי גנים ונוירומודולציה על ידי היסטולוגיה. שיטה זו ישימה במיוחד עבור מיקוד אזורי מוח גדולים או מרובים עבור ביטוי גנים או נוירומודולציה. לדוגמה, אזור רחב של קליפת המוח יכול להיות מומר בקלות עם FUS-BBBO ומווסת באמצעות כימוגנטיקה. עם זאת, העברת גנים בטכניקה חלופית, זריקות תוך גולגולתיות, תדרוש מספר רב של זריקות פולשניות וקרניוטומיות. FUS-BBBO והיישום שלו, ATAC, ניתנים להרחבה לבעלי חיים בגדלים שונים, שבהם אזורי המוח גדולים יותר וקשה יותר לתקוף אותם באופן פולשני.