Apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati per il targeting delle strutture cerebrali e la valutazione della neuromodulazione chemiogenetica

Riepilogo

Questo protocollo delinea le fasi necessarie per la veicolazione genica attraverso l'apertura della barriera ematoencefalica (BBB) ad ultrasuoni focalizzati, la valutazione dell'espressione genica risultante e la misurazione dell'attività di neuromodulazione dei recettori chemiogenetici attraverso test istologici.

Abstract

La chemiogenetica a bersaglio acustico (ATAC) consente il controllo non invasivo di specifici circuiti neurali. L'ATAC raggiunge tale controllo attraverso una combinazione di apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati (FUS-BBBO), somministrazione genica con vettori virali adeno-associati (AAV) e attivazione della segnalazione cellulare con recettori proteici ingegnerizzati, chemiogenetici e i loro ligandi affini. Con l'ATAC è possibile trasdurre regioni cerebrali grandi e piccole con precisione millimetrica utilizzando un'unica applicazione ecografica non invasiva. Questa trasduzione può successivamente consentire una neuromodulazione a lungo termine, non invasiva e priva di dispositivi in animali che si muovono liberamente utilizzando un farmaco. Poiché FUS-BBBO, AAV e chemiogenetica sono stati utilizzati in più animali, l'ATAC dovrebbe essere scalabile anche per l'uso in altre specie animali. Questo documento espande un protocollo precedentemente pubblicato e delinea come ottimizzare la consegna genica con FUS-BBBO a piccole regioni cerebrali con guida per la risonanza magnetica, ma senza la necessità di un complicato dispositivo FUS compatibile con la risonanza magnetica. Il protocollo, inoltre, descrive la progettazione di componenti di puntamento e contenimento del mouse che possono essere stampati in 3D da qualsiasi laboratorio e possono essere facilmente modificati per diverse specie o attrezzature personalizzate. Per favorire la riproducibilità, il protocollo descrive in dettaglio come le microbolle, gli AAV e la venipuntura sono stati utilizzati nello sviluppo dell'ATAC. Infine, vengono mostrati alcuni dati esemplificativi per guidare le indagini preliminari degli studi che utilizzano l'ATAC.

Introduzione

L'uso di tecnologie di neuromodulazione circuito-specifiche, come l'optogenetica^1,2 e la chemiogenetica 3,4,5^, ha fatto progredire la nostra comprensione delle condizioni psichiatriche come disturbi del circuito neuronale. I circuiti neuronali sono difficili da studiare e ancora più difficili da controllare nel trattamento dei disturbi cerebrali perché sono tipicamente definiti da specifici tipi di cellule, regioni cerebrali, vie di segnalazione molecolare e tempi di attivazione. Idealmente, sia per la ricerca che per le applicazioni cliniche, tale controllo dovrebbe essere esercitato in modo non invasivo, ma è difficile ottenere una neuromodulazione precisa e non invasiva. Ad esempio, mentre i farmaci neuroattivi possono raggiungere il cervello in modo non invasivo, mancano di specificità spaziale agendo in tutto il cervello. D'altra parte, la stimolazione elettrica del cervello profondo può controllare specifiche regioni cerebrali, ma ha difficoltà a controllare specifici tipi di cellule e richiede un intervento chirurgico e il posizionamento di dispositivi⁶.

La chemiogenetica acusticamente mirata⁷ (ATAC) fornisce neuromodulazione con specificità spaziale, di tipo cellulare e temporale. Combina tre tecniche: l'apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati (FUS-BBBO) per il targeting spaziale, l'uso di vettori virali adeno-associati (AAV) per fornire in modo non invasivo geni sotto il controllo di promotori specifici del tipo di cellula e recettori chemiogenetici ingegnerizzati per modulare selettivamente i circuiti neurali trasfettati tramite la somministrazione di farmaci. FUS è una tecnologia approvata dalla FDA che sfrutta la capacità degli ultrasuoni di mettere a fuoco in profondità all'interno dei tessuti, compreso il cervello umano, con precisione spaziale millimetrica. Ad alta potenza, la FUS viene utilizzata per l'ablazione mirata non invasiva, incluso un trattamento approvato dalla FDA per il tremore essenziale⁸. FUS-BBBO combina gli ultrasuoni a bassa intensità con microbolle somministrate per via sistemica, che oscillano nei vasi sanguigni al fuoco dell'ultrasuono, provocando un'apertura localizzata, temporanea (6-24 h) e reversibile della BBB⁹. Questa apertura consente la consegna delle proteine^9,10, delle piccole molecole 11 e dei vettori virali^7,12,13,14 al cervello senza danni tissutali significativi nei roditori ¹⁰ e nei primati non umani ¹⁵. Sono in corso studi clinici per FUS-BBBO^16,17, che indicano possibili applicazioni terapeutiche di questa tecnica.

Anche la somministrazione genica virale con AAV sta rapidamente avanzando nell'uso clinico per i disturbi del sistema nervoso centrale, con le recenti approvazioni normative della FDA e dell'UE come pietre miliari importanti. Infine, i recettori chemiogenetici¹⁸, come i Designer Receptors Activated Exclusively by Designer Drugs (DREADDs), sono ampiamente utilizzati dai neuroscienziati per fornire il controllo farmacologico sull'eccitazione neuronale in animali transgenici o trasfettati ^19,20. I DREADD sono recettori accoppiati a proteine G (GPCR) che sono stati geneticamente modificati per rispondere a molecole chemiogenetiche sintetiche piuttosto che a ligandi endogeni, in modo tale che la somministrazione sistemica di questi ligandi aumenti o riduca l'eccitabilità dei neuroni che esprimono DREADD. Quando queste tre tecnologie vengono combinate in ATAC, possono essere utilizzate per la modulazione non invasiva di circuiti neurali selezionati con precisione spaziale, di tipo cellulare e temporale.

Qui, espandiamo e aggiorniamo un protocollo precedentemente pubblicato per FUS-BBBO¹¹ includendo una metodologia per il targeting accurato delle regioni cerebrali con FUS-BBBO nei topi utilizzando semplici apparecchiature di targeting stampate in 3D. Mostriamo anche un'applicazione di FUS-BBBO ad ATAC. Mostriamo i passaggi necessari per la somministrazione di AAV che trasportano recettori chemiogenetici e la valutazione dell'espressione genica e della neuromodulazione mediante istologia. Questa tecnica è particolarmente applicabile per il targeting di regioni cerebrali grandi o multiple per l'espressione genica o la neuromodulazione. Ad esempio, un'ampia area di una corteccia può essere facilmente trasdotta con FUS-BBBO e modulata utilizzando la chemiogenetica. Tuttavia, la somministrazione genica con una tecnica alternativa, le iniezioni intracraniche, richiederebbe un gran numero di iniezioni invasive e craniotomie. FUS-BBBO e la sua applicazione, ATAC, possono essere adattati ad animali di diverse dimensioni, dove le regioni cerebrali sono più grandi e più difficili da colpire in modo invasivo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti nell'ambito di un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee del California Institute of Technology, dove i dati sono stati originariamente ottenuti da J.O.S.

1. Progettazione e stampa 3D di imbracature per animali e hardware per la guida delle immagini

1. Utilizzare i file del sito Web del laboratorio Szablowski all'indirizzo: https://www.szablowskilab.org/downloads per la stampa 3D dei componenti.
2. Assicurarsi che il materiale di stampa abbia una bassa suscettibilità alla risonanza magnetica, ma che abbia un supporto visibile alla risonanza magnetica. Vedere i dettagli dei materiali utilizzati nella sezione materiali e reagenti.
3. Tenere conto del degrado del materiale con molteplici usi testando ripetutamente il materiale e osservando i siti di usura che dovrebbero essere rinforzati. Assicurarsi che le pareti stampate abbiano uno spessore di almeno 2 mm.
4. Usa stampanti 3D ad alta precisione per migliorare la precisione del targeting.
5. Contrasta la gravità e altre forze per evitare la deviazione dei componenti in plastica stampati in 3D sostenendo i componenti lungo la loro lunghezza e aumentando lo spessore delle pareti stampate in 3D se si osserva una flessione.
6. Tenere conto della precisione in più assi, tra cui anteriore/posteriore, mediale/laterale, dorsale/ventrale, nonché imbardata, beccheggio e inclinazione.
7. Testare l'accuratezza del puntamento eseguendo FUS-BBBO e registrando la deviazione dalla posizione mirata.
8. Se si utilizzano sistemi stereotassici motorizzati, valutare gli effetti del movimento dinamico sull'elasticità del materiale registrando la procedura di targeting FUS-BBBO su video e correggere eventuali deviazioni ispessendo le pareti del materiale stampato in 3D.

2. Descrizione del sistema ad ultrasuoni

1. Utilizzare un sistema a ultrasuoni con un trasduttore anulare a otto elementi (diametro = 25 mm, punto focale naturale = 20 mm; apertura (F) = 0,8)) e accoppiare l'alloggiamento alla testa con gel per ultrasuoni degassati applicando il gel sulla testa del topo rasata.
   NOTA: La frequenza centrale di un trasduttore utilizzato in uno studio precedente⁷ era di 1,5 MHz, la durata dell'impulso era di 10 ms e la frequenza di ripetizione dell'impulso era di 1 Hz su 120 s. Le pressioni sono state calibrate utilizzando idrofono in fibra ottica e mantenute tra 0,36-0,45 MPa. Ipotizzare un'attenuazione acustica del 18% attraverso il cranio²¹ per 1,5 MHz e l'osso parietale. La gamma di condizioni appropriate per un'apertura sicura della BBB e per l'erogazione di AAV è stata descritta altrove in dettaglio ^7,14,22.

3. Preparazione degli animali

1. Anestetizzare un topo utilizzando l'inalazione di isoflurano al 2% con aria di grado medico. Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando un tocco per confermare la mancanza di risposta. Quindi, applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione corneale utilizzando un cotton fioc sterile monouso per prevenire la contaminazione incrociata del tubo dell'unguento.
   NOTA: La procedura tipica di FUS-BBBO può variare da 30 minuti a 2 ore e l'anestesia deve essere mantenuta per tutto il tempo.
2. Dopo che il topo è stato anestetizzato, lavare un catetere pulito con soluzione fisiologica eparinizzata (10 U/ml).
   NOTA: Un catetere appropriato per un topo da 25-35 g ha un ago da 30 g e un tubo in PE10.
3. Successivamente disinfettare la coda del topo con un tampone di etanolo al 70%. Posizionare il catetere della vena caudale in una vena caudale laterale e fissarlo con una colla per tessuti. Osservare un riflusso di sangue dalla vena caudale nel catetere per confermarne il posizionamento.
4. Radere la testa del topo e poi utilizzare la crema depilatoria dopo che la colla del tessuto si è asciugata per ridurre la possibilità che le bolle d'aria rimangano intrappolate sotto il gel ultrasonico durante l'insonazione.
5. Posizionare il mouse in un carrello per risonanza magnetica stampato in 3D, montando i denti anteriori su una barra per morso e la testa all'interno di un ogiva (Figura 1a).
6. Iniettare fino a 10 μL di lidocaina per via sottocutanea nel sito a contatto con le barre auricolari smussate. Quindi, fissare le barre smussate al cranio e applicare quantità sicure di pressione, facendo attenzione a non esercitare pressione sulla trachea poiché impedisce la respirazione. Osservare la respirazione per 30 secondi per confermare che l'animale respiri liberamente a una velocità di 1/s.
7. Collegare la guida di puntamento alle barre auricolari, controllare la respirazione come al punto 3.6 (Figura 1b) e continuare a monitorare visivamente la respirazione durante la procedura ogni minuto. Una frequenza respiratoria elevata al di sopra di 1/s è una delle indicazioni di perdita di anestesia. Continuare a monitorare la risposta al pizzicamento delle dita dei piedi ogni 5 minuti quando i topi non sono nello scanner MRI o se la frequenza respiratoria è elevata al di sopra di 1/s.
8. Trasferire il carrello per risonanza magnetica in un supporto per risonanza magnetica e quindi all'interno del foro di un magnete.
   NOTA: Il design dell'hardware è ottimizzato per una bobina da 72 mm all'interno di una risonanza magnetica 7T.
9. Acquisire una sequenza di risonanza magnetica per localizzare il mouse nello scanner.
10. Selezionare la sequenza di scatto rapido 3D ad angolo basso (FLASH) per acquisire l'intero cervello, utilizzando i seguenti parametri, secondo le istruzioni specifiche del produttore dello strumento. Tempo di eco: 3,9 ms, Tempo di ripetizione: 15 ms, Angolo di impulso di eccitazione: 15°, Dimensioni matrice: 130 x 130 x 114, Risoluzione: 350 x 200 x 200 μm per voxel, Media: 1, Tempo di acquisizione: 3 min 42s
11. Trasferire i file dal sistema MRI a un computer che controlla il sistema FUS.
12. Aprire la sequenza di imaging nel software per eseguire il targeting guidato dalla risonanza magnetica, dove l'immagine dovrebbe apparire come nella Figura 1c.

4. Targeting guidato dalla risonanza magnetica

NOTA: Con l'uso di guide di targeting progettate su misura, non è necessario posizionare il trasduttore a ultrasuoni all'interno di una risonanza magnetica, né è necessario incidere la pelle per eseguire il targeting azzerando la stereotassa sulle linee bregma e lambda. Segui i passaggi seguenti per eseguire il processo di targeting.

1. Posizionare il carrello all'interno di uno strumento stereotassico. Fissarlo in posizione utilizzando un blocco metallico con un nastro biadesivo e premendo il carrello contro due montanti di supporto dello strumento stereotassico.
2. Trasferisci le immagini MRI su un computer con un software di guida FUS in esecuzione selezionando i file in Gestione dati, facendo clic con il pulsante destro del mouse per visualizzare le opzioni di menu e selezionando "Trasferisci immediatamente".
3. Aprire il software di guida FUS e caricare l'immagine facendo clic su "Apri sequenza" e caricando tutti i file della sequenza di imaging.
4. Riformattare l'immagine su tre assi premendo il tasto destro del mouse e "Riformatta".
5. Localizzare il trasduttore sulla guida di puntamento circolare (Figura 1c) facendo clic con il pulsante destro del mouse.
6. Nella vista sagittale, regolare la posizione verticale di un trasduttore virtuale per tenere conto dello spessore del bagno d'acqua e dell'alloggiamento del trasduttore (in questo caso – 8,2 mm verso l'alto, Figura 1d).
7. Puntare l'area o le aree da prendere di mira nel pianificatore di traiettoria e annotare le coordinate in un foglio di calcolo (in questo caso il mesencefalo, come nella Figura 1d).
8. Componi la profondità desiderata del puntamento (valore z nella traiettoria elettronica (Figura 2) e annota le coordinate in un foglio di calcolo.
9. Puntare a ciascuno dei punti premendo 'Invia traiettoria' ed 'Esegui' (Figura 2).
   NOTA: Questa operazione viene eseguita quando un supporto per mouse viene posizionato all'interno dei motori. Tuttavia, lo stesso targeting può essere ottenuto con elevata precisione su uno strumento stereotassico.
10. Per correlare le coordinate di una risonanza magnetica con il telaio stereotassico, posizionare il trasduttore montato su misura su una guida di puntamento e traslare fino a quando ciascuno dei tre bulloni di puntamento (Figura 3, elemento A) può passare attraverso sia il supporto del trasduttore (Figura 3, elemento B) che la guida di puntamento (Figura 3, elemento C). Assicurarsi che i bulloni non siano in tensione o inclinati.
11. Traslare il trasduttore di 10,56 mm in avanti in direzione anteriore/posteriore finché non si trova nello stesso punto in cui appare il centro di una guida di puntamento su una risonanza magnetica.
12. Determinare la distanza da un centro del trasduttore virtuale (Figura 3a, elemento A) alla regione di destinazione (Figura 3a, elemento B) e spostare il trasduttore su queste coordinate utilizzando il frame stereotassico.
13. Procedere alla preparazione della soluzione iniettabile.

5. Preparazione della soluzione iniettabile

NOTA: Le soluzioni di microbolle sono molto sensibili alla pressione. Di conseguenza, una miscelazione vigorosa o un'iniezione rapida attraverso aghi sottili possono far collassare le microbolle e ridurre l'efficacia dell'apertura della BBB. Inoltre, le microbolle sono più leggere dell'acqua e possono galleggiare sulla parte superiore di un tubo, di un catetere o di una siringa (Figura 4), ad esempio in un iniettore automatico. Si raccomanda vivamente di sospendere nuovamente la soluzione di microbolle immediatamente prima di ogni iniezione.

1. Prelevare 0,8 mL di soluzione fisiologica utilizzando una siringa in una provetta da 1,5 mL.
2. Utilizzando una siringa, aggiungere 0,1 mL di mezzo di contrasto per risonanza magnetica nella stessa provetta da 1,5 mL e mescolare.
3. Portare la soluzione di microbolle^23,24 non attivata a temperatura ambiente.
4. Subito prima dell'insonazione, attivare le microbolle per 45 s in un dispositivo di attivazione delle microbolle.
5. Prelevare lentamente (oltre ~3 s) 0,1 mL di microbolle utilizzando una siringa di tubercolina da 1 mL e un ago da 21 G dalla profondità media di un liquido.
6. Aggiungere 0,08 mL di microbolle nella soluzione di mezzo di contrasto e soluzione fisiologica preparata al punto 5.3. Mescolare picchiettando con le mani per 15 s.
7. Con una concentrazione finale di AAV di 0,5-2 x 10 10 particelle virali per grammo di peso corporeo (VP/g), iniettare il carico per la consegna (in questo caso AAV9) attraverso un ago da³⁰ G nel catetere della vena caudale, in caso di ATAC – AAV portatori di recettori chemiogenetici, o di un controllo negativo, come AAV portatori di GFP sotto lo stesso promotore.
8. Mescolare nuovamente le microbolle a mano per 15 secondi per evitare il galleggiamento (Figura 4).
9. Subito dopo, aspirare 200 μL di soluzione di microbolle attraverso una siringa senza ago attaccato. La mancanza di un ago ridurrà le forze di taglio sulle microbolle.
10. Capovolgere la siringa e mescolare premendo lo stantuffo verso l'alto e verso il basso.
11. Attacca l'ago da 30 G e, mentre è ancora capovolto, spingi lentamente fuori le microbolle fino a quando non compaiono delle goccioline all'estremità di un ago.

6. Procedura di insonazione

1. Impostare i parametri per l'insonazione: durata dell'impulso di 10 ms, 120 ripetizioni, ogni s e 0,30-0,45 MPa di pressione sul cranio.
2. Rimuovere la guida di puntamento e applicare il gel ad ultrasuoni degassata sulla testa del topo, assicurandosi di non formare bolle.
3. Abbassate il trasduttore e posizionatelo direttamente sul supporto della barra auricolare e comporre le coordinate negli strumenti stereotassici (Figura 5).
4. Iniettare la soluzione di AAV (0,5-2 x 10¹⁰ VP/g).
5. Miscelare le microbolle e la soluzione di mezzo di contrasto per la risonanza magnetica per 15 secondi e iniettare 80 μL per 30 g di topo.
6. Applicare immediatamente gli ultrasuoni per 120 s premendo 'Invia' ed 'Esegui'.
7. Se è stato scelto come target più di un sito, spostare il trasduttore su quel sito e regolare il targeting in profondità seguendo i numeri nel foglio di calcolo dai passaggi 4.7-4.9. Quindi ripetere i passaggi 6.5-6.6 per ogni sito sonato.

7. Valutazione RM dell'apertura della BBB

NOTA: La valutazione RM dell'apertura della BBB è stata descritta in dettaglio altrove¹¹. La posizione dell'apertura della BBB può essere visualizzata come aree più luminose nei topi che hanno ricevuto un'iniezione di un agente di contrasto Gd pesato in T1.

1. Dopo l'applicazione dell'ecografia, registrare una sequenza di risonanza magnetica come al punto 3.10.
2. Rimuovere il mouse dallo scanner MRI e posizionarlo in una gabbia di recupero per consentire il recupero dall'anestesia. Monitora i topi ogni giorno per segni di angoscia, perdita di peso o altri endpoint umani. Consultare il personale veterinario e le linee guida istituzionali IACUC per procedere con qualsiasi trattamento in caso di eventi avversi imprevisti.

8. Stimolazione DREADD con un ligando chemiogenetico

1. Scegli un recettore chemiogenetico. Per i DREADD, scegliere il recettore hM3Dq per l'attivazione neuronale tramite le vie accoppiate Gq¹⁹, il recettore hM4Di per l'inibizione dell'attività neuronale attraverso le vie accoppiate Gi/o²⁰ o il recettore KORD per l'attivazione dei neuroni tramite le vie accoppiate Gs utilizzando il ligando²⁵ della Salvinorina-B.
2. Sciogliere clozapina-n-ossido (CNO) in soluzione salina sterile alla concentrazione di 1 mg/mL. Conservare il CNO aliquotato a -20 °C.
3. Somministrare CNO¹⁹, o un altro ligando chemiogenetico^26,27,28, per via intraperitoneale a concentrazione compresa tra ^0,3 e 10 mg/kg.
4. Se gli effetti del CNO sul comportamento devono essere registrati, iniziare a registrare l'attività comportamentale entro 15-45 minuti dalla somministrazione del farmaco per ottenere la massima attivazione dei DREADDs¹⁹.
5. Se si desidera un'analisi dell'attivazione neuronale, utilizzare i topi per la valutazione istologica dopo 60-120 minuti dall'iniezione.
6. Procedere all'eutanasia attraverso la perfusione cardiaca (vedere paragrafo 9).

9. Valutazione istologica dell'espressione genica e dell'attivazione chemiogenetica

NOTA: Una volta raggiunto l'endpoint sperimentale (ad esempio, fine dello studio comportamentale, tempo necessario per l'espressione genica), è fondamentale confermare la posizione e la presenza dell'espressione genica.

1. Dopo l'attivazione con un ligando chemiogenetico, eseguire la perfusione cardiaca per preservare i tessuti.
   1. Anestetizzare il topo con una miscela di ketamina (100 mg/kg) / xilazina (10 mg/kg) in soluzione fisiologica sterile attraverso un'iniezione IP. Confermare l'anestesia con un pizzico del dito del piede e assicurarsi che la frequenza respiratoria sia stata abbassata a circa 1/s. Fornire supporto termico attraverso il termoforo fino alla conferma dell'eutanasia.
   2. Preparare formalina tamponata neutra al 10% (NBF) e PBS con 10 unità di eparina per ml.
      NOTA: Le soluzioni devono essere a 4 °C.
   3. Versare ciascun tampone in provette separate da 50 mL e collegare e adescare una pompa peristaltica collegata a un catetere a farfalla da 25 G con soluzione PBS/eparina.
   4. Fissare gli arti a un tampone blu assorbente con del nastro adesivo e assicurarsi che l'animale sia posizionato in posizione supina sul tampone. Disinfettare il pelo per evitare la contaminazione incrociata degli organi periferici nel caso in cui sia necessario raccoglierli.
   5. Aprire la cavità peritoneale con un'incisione trasversale, esponendo il diaframma.
   6. Aprire la gabbia toracica attraverso due tagli di forbici chirurgiche lungo l'asse anteriore/posteriore.
   7. Esporre il cuore e posizionare l'ago in una camera sinistra (lato destro del cuore come visto in posizione supina) e posizionarlo nel catetere a farfalla al punto 9.1.3.
   8. Fai una piccola incisione nel ventricolo destro per consentire il deflusso del sangue.
   9. Accendere la pompa peristaltica per iniziare a risciacquare il sangue con PBS/eparina.
      NOTA: Se questo passaggio non viene eseguito adeguatamente, il sangue si coagulerà durante la fissazione con formalina e impedirà un'appropriata perfusione.
   10. Dopo che tutto il sangue è stato eliminato e il PBS chiaro inizia a fuoriuscire dal ventricolo destro, commutare l'ingresso di una pompa peristaltica con una soluzione NBF e iniziare la perfusione per 25 mL per topo.
   11. Estrarre il cervello, inserire almeno 4 mL di NBF e post-fissare per 24 ore.
2. Sezionare il cervello utilizzando sezioni coronali su un vibratomo utilizzando uno spessore della sezione di 50 μm.
3. Metti ogni sezione in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, conservando le sezioni in tutto il cervello.
4. Valutare l'espressione dei recettori chemiogenetici fusi a proteine fluorescenti (ad esempio, mCherry o mCitrine), al microscopio a fluorescenza per identificare le sezioni che mostrano espressione per confermare la posizione. È probabile che l'espressione sia fioca.
5. Eseguire l'immunocolorazione contro il fluoroforo utilizzando il seguente protocollo:
   1. Mettere 3 sezioni in 0,5 mL di soluzione contenente il 10% di siero di un ospite di un anticorpo secondario e incubare per 30 minuti.
   2. Trasferire le sezioni in una soluzione di un anticorpo primario a diluizione 1:250 – 1:1.000, utilizzando 1:500 come punto di partenza.
   3. Incubare le sezioni con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C in una micropiastra sigillata con una pellicola di paraffina.
   4. Lavare le sezioni con PBS, 3 volte per 5 minuti alla volta.
   5. Aggiungere 0,5 mL per pozzetto della soluzione anticorpale secondaria nel siero al 10%.
   6. Incubare per 4 ore a temperatura ambiente.
   7. Lavare le sezioni con PBS, 3 volte per 5 minuti alla volta.
   8. Montare su vetrini con un mezzo di montaggio acquoso contenente un colorante nucleare (ad es. DAPI).
6. Valutare la localizzazione e la diffusione utilizzando un microscopio confocale eseguendo una scansione delle piastrelle di un'intera sezione.
7. Valutare l'intensità dell'espressione misurando l'intensità dei pixel di fluorescenza nelle regioni cerebrali mirate e confrontarla con un controllo iniettato per via intracranica.
8. In alternativa, valutare la percentuale di neuroni positivi contando le cellule colorate contro i recettori chemiogeneti, rispetto alle cellule DAPI-positive o ai marcatori cellulo-specifici.
9. Valutare il danno tissutale eseguendo la colorazione con ematossilina su una sezione di 50 μm e l'imaging per la perdita di cellule, l'accumulo di detriti cellulari e altri segni di danno grossolano.
10. Per valutare la specificità del targeting cellulare, eseguire una doppia immunocolorazione come descritto di seguito per il recettore chemiogenetico e un marcatore cellulo-specifico. Quindi, eseguire i conteggi positivi delle celle come nel passaggio 9.8.
    1. Mettere 3 sezioni in 0,5 mL di una soluzione contenente il 10% di siero di un ospite di un anticorpo secondario e incubare per 30 minuti.
    2. Trasferire le sezioni in una soluzione di un anticorpo primario contro un marcatore fluorescente di un recettore chemiogenetico a diluizione 1:250 – 1:1.000, utilizzando 1:500 come punto di partenza. Aggiungere un secondo anticorpo primario di una diversa specie ospite che è mirato contro un marcatore di interesse cellulo-specifico (ad esempio, CamkIIa).
    3. Incubare le sezioni con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C in una micropiastra sigillata con pellicola di paraffina.
    4. Lavare le sezioni con PBS, 3 volte per 5 minuti alla volta.
    5. Aggiungere 0,5 mL per pozzetto di soluzione anticorpale secondaria nel siero al 10% della specie ospite di entrambi gli anticorpi secondari.
       NOTA: Ogni anticorpo deve avere un fluoroforo distinto e deve essere reattivo contro gli anticorpi primari al punto 9.10.2.
    6. Incubare per 4 ore a temperatura ambiente.
    7. Lavare le sezioni con PBS, 3 volte per 5 minuti alla volta.
    8. Montare su vetrini e fissare con un mezzo di montaggio acquoso contenente una colorazione nucleare.

10. Valutare l'attivazione neuronale con immunocolorazione per c-Fos

1. Eseguire la colorazione con c-Fos come al punto 9.5 di questo protocollo utilizzando un anticorpo primario c-Fos e un anticorpo secondario con un tag fluorescente distinto dalla colorazione nucleare.
2. Conta la percentuale di cellule che sono positive sia per c-Fos che per la colorazione nucleare nell'area bersaglio di un recettore chemiogenetico.
3. Analizzare la percentuale di nuclei c-Fos positivi in un gruppo di topi che esprimono recettori chemiogenetici e trattati con un ligando chemiogenetico o un controllo del veicolo e in un gruppo di topi wild-type trattati con un ligando chemiogenetico o un controllo del veicolo.

Risultati

Il primo passo per eseguire il protocollo ATAC è il targeting del FUS-BBBO verso le regioni cerebrali desiderate. Ad esempio, seguendo il protocollo descritto, l'ippocampo è stato preso di mira con FUS-BBBO e l'agente di contrasto e i DREADD portatori di AAV9 sono stati iniettati nei topi, seguiti da una sequenza di risonanza magnetica FLASH 3D che acquisisce immagini del cervello del topo. Un miglioramento del segnale T1 è stato ottenuto nella regione dell'ippocampo (Figura 6) e in altre parti del cervello (Figura 7). Dopo diverse settimane, i DREADD sono stati espressi all'interno della regione cerebrale bersaglio. Mentre molti DREADD sono fusi con un reporter fluorescente (ad esempio mCherry), è stato scoperto che il processo di perfusione e fissazione con la formaldeide riduce drasticamente la fluorescenza di queste proteine. L'immunocolorazione contro mCherry o DREADD ha portato a un rilevamento più affidabile dell'espressione (Figura 8) sulla base dell'esperienza precedente. In esperimenti precedenti, ~85% dei topi ha mostrato espressione dopo FUS-BBBO⁷. Un semplice test per livelli sufficienti di espressione dei DREADD è testare la loro funzionalità a livello cellulare. Può essere fatto, ad esempio, fornendo un ligando chemiogenetico o un controllo salino, come CNO 19, descloroclozapina²⁸ o altri²⁹, e attendere 2 ore prima di una perfusione cardiaca e fissazione. Le sezioni cerebrali sono state poi co-immunocolorate per la proteina c-Fos³⁰, che indica una maggiore attività dei neuroni, e per DREADD. L'esperimento è stato considerato un successo se il sito del cervello bersaglio con DREADD ha mostrato un numero significativamente più elevato di nuclei neuronali positivi a c-Fos nel gruppo che ha ricevuto un ligando chemiogenetico rispetto al gruppo che ha ricevuto soluzione fisiologica⁷ o rispetto a un sito controlaterale che non è stato sottoposto a FUS-BBBO. Da notare che c'è la possibilità per alcuni di questi ligandi di attivare i neuroni in modo non specifico senza l'espressione di DREADD. Ad esempio, è stato dimostrato che il CNO viene metabolizzato in bassi livelli di clozapina nei topi, che attraversa la BBB e attiva i DREADD ad alta potenza²⁷. Tuttavia, è stato anche dimostrato che si lega a posizioni non specifiche. Come in ogni esperimento, è fondamentale includere tutti i controlli appropriati negli studi chemiogenetici³¹. Un possibile controllo è la somministrazione del ligando chemiogenetico a topi wild-type, senza procedure, per escludere gli effetti del farmaco da solo sul test comportamentale o istologico desiderato. Un altro controllo potrebbe essere l'inclusione di quattro gruppi: DREADD + ligando, DREADD + veicolo, EGFP + ligando, EGFP + veicolo, che terrà conto di eventuali effetti potenziali sia del rilascio genico con FUS-BBBO che del ligando chemiogenetico.

Figura 1: Il processo di targeting guidato dalla risonanza magnetica di FUS in ATAC. (a) Posizionamento del mouse con barre auricolari, un cono nasale e una piattaforma che può essere inserita all'interno di uno scanner MRI. (b) Una guida stampata in 3D (blu) visibile nella risonanza magnetica è stata attaccata alle estremità del telaio della barra auricolare e quindi fissata in posizione con un supporto di una bobina per risonanza magnetica superficiale che contiene quattro bulloni a scatto (blu semitrasparente). (c) Aspetto della guida stampata in 3D nella risonanza magnetica sagittale (pannello di sinistra), con una parte inferiore della rappresentazione virtuale di un trasduttore allineata (semicerchio giallo) con la parte inferiore della guida. Il pannello di destra mostra l'aspetto della guida stampata in 3D sulla risonanza magnetica dalla vista coronale. Il cerchio luminoso è stato realizzato con un materiale di supporto polyjet che ha un forte contrasto MRI. La croce è stata formata con la plastica. Un cerchio giallo rappresenta la posizione del trasduttore che è stato allineato concentricamente con la guida all'interno di un telaio stereotassico. (d) Per colpire le strutture cerebrali, un trasduttore virtuale è stato spostato in direzione z sopra i topi per abbinare lo spessore di un cono / alloggiamento a ultrasuoni. In questo caso, a causa dello spessore del bagno d'acqua, il trasduttore è stato spostato di 8,2 mm sopra la guida per un puntamento accurato. Le strutture cerebrali sono state selezionate utilizzando i dati di imaging della risonanza magnetica e le loro coordinate della risonanza magnetica sono state quindi annotate e inserite nella macchina stereotassica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Interfaccia del software utilizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Processo di corrispondenza dello spazio delle coordinate della risonanza magnetica allo strumento stereotassico. (a) Tre fori all'interno di un supporto del trasduttore sono stati allineati con tre fori all'interno della guida MRI e tre bulloni di puntamento conici sono stati inseriti senza causare la flessione dell'intero gruppo. (b) Idealmente, tutti e tre i bulloni dovrebbero trovarsi al centro dei fori. (c) Se c'è qualche imprecisione nell'allineamento, non tutti e tre i bulloni si adatterebbero, ad esempio, in caso di piccola imbardata probabilmente impercettibile di 1°, solo un bullone si adatterebbe mentre i bulloni opposti sarebbero bloccati alla guida MRI. In alternativa, potrebbe esserci una flessione visibile dell'intero gruppo quando i bulloni sono stati forzati. (d) Vista ingrandita del bullone. I bulloni devono essere posizionati concentricamente per la massima precisione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rapida ridistribuzione delle microbolle all'interno della siringa. (a) La siringa è stata fotografata 5 secondi dopo la miscelazione. (b) Un minuto dopo, c'era uno strato chiaramente visibile che mostrava alcune delle bolle concentrate vicino alla parte superiore della siringa di tubercolina da 1 ml. Questo esempio, in particolare, ha utilizzato una soluzione di microbolle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Processo di posizionamento del centro di un trasduttore su un centro di una guida MRI. (a) Nei modelli illustrati in questo documento, il supporto rosso è stato progettato per spostarsi di 10,56 mm in avanti dalla posizione mostrata nella Figura 3b a quella mostrata qui. (b) La guida blu per la risonanza magnetica è stata rimossa prima della sonicazione ed è stato applicato un gel ad ultrasuoni tra il topo e il trasduttore (arancione) per garantire il passaggio degli ultrasuoni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Visualizzazione RM dell'apertura della BBB. (a) Vista assiale dell'apertura BBB. L'area più luminosa designata con una punta di freccia mostra lo stravaso di un mezzo di contrasto MRI T₁ . (b) Vista coronale dell'ippocampo dorsale e della corteccia sopra l'ippocampo bersaglio con FUS-BBBO (punte di freccia). (c) Vista coronale dell'ippocampo centrale bersaglio con FUS-BBBO (punte di freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Esempio di targeting di 4 siti cerebrali utilizzando il sistema di targeting a tre bulloni descritto in questo articolo. Le aree con punte di freccia mostravano siti aperti di BBB con diffusione di un mezzo di contrasto per risonanza magnetica. I quattro siti sono stati presi di mira in successione, con ~150 s tra ogni apertura BBB, dal basso verso l'alto. L'immagine è stata scattata entro 2 minuti dall'ultima apertura BBB. La barra della scala è di 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Rilevamento dell'espressione DREADD.  (a) L'immunocolorazione per il fluoroforo attaccato ai DREADD, in questo caso mCherry è stato un metodo affidabile di rilevamento in alcuni studi. (b) In un'altra sezione rappresentativa con DREADDs mirati all'ippocampo utilizzando le stesse condizioni di (a), la fluorescenza di mCherry da sola ha prodotto un forte fondo e un segnale relativamente debole. (c) Come controllo negativo, è stato utilizzato un topo che ha ricevuto un'iniezione sistemica di AAV, ma non è stato sottoposto a FUS-BBBO. Nessuna espressione significativa può essere trovata dall'immunocolorazione mCherry. Le barre della scala sono di 500 mm. (Dati in a, c adattati da⁷ con autorizzazioni, Copyright 2020 Nature-Springer). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'ATAC richiede l'implementazione di successo di diverse tecniche per la neuromodulazione di circuiti neurali specifici, tra cui un targeting accurato guidato dalla risonanza magnetica, FUS-BBBO e la valutazione istologica dell'espressione genica. I componenti stampabili in 3D sono stati sviluppati per semplificare il targeting di piccole strutture cerebrali con FUS-BBBO guidato dall'imaging.

La somministrazione di ultrasuoni focalizzati guidati dalla risonanza magnetica (MRIgFUS) pone una serie di sfide. Innanzitutto, la tipica bobina per risonanza magnetica ha uno spazio limitato, progettato per ospitare solo un campione e non l'hardware a ultrasuoni. I fori più grandi delle risonanze magnetiche aumentano il costo delle apparecchiature e diminuiscono la qualità dell'immagine, poiché il segnale è correlato al fattore di riempimento di una bobina³². Di conseguenza, qualsiasi hardware FUS posizionato sulla parte superiore di un'immagine animale nella risonanza magnetica comprometterà la qualità dell'imaging. In secondo luogo, la progettazione di dispositivi compatibili con la risonanza magnetica è difficile e costosa. I materiali compatibili con la risonanza magnetica devono essere diamagnetici, avere una bassa propensione a creare correnti parassite durante l'irradiazione a radiofrequenza e avere una bassa suscettibilità magnetica in campi magnetici elevati. In qualsiasi materiale conduttivo, anche la creazione di correnti parassite o la sua suscettibilità magnetica influirà negativamente sulla qualità dell'immagine. Infine, i materiali compatibili con la risonanza magnetica disponibili hanno moduli di Young e durata inferiori rispetto ai metalli tipicamente utilizzati nella produzione di macchine di puntamento precise, ad esempio telai stereotassici. I motori utilizzati per le regolazioni di posizione devono essere compatibili con la risonanza magnetica e posizionati al di fuori del foro della risonanza magnetica a causa delle loro dimensioni. Questi motori devono essere collegati a distanza al trasduttore all'interno di un foro per risonanza magnetica utilizzando materiali compatibili con la risonanza magnetica. I problemi di deformazione della plastica, la mancanza di spazio sufficiente all'interno del foro per implementare componenti di dimensioni robuste e lo spazio insufficiente per cambiare le posizioni di puntamento in tutto il cervello hanno influenzato la precisione del puntamento nei lavori precedenti.

Per risolvere questi problemi, è stata presa la decisione di eseguire l'imaging nella risonanza magnetica e la somministrazione di FUS-BBBO al di fuori dello scanner. Per consentire la guida alla risonanza magnetica, i topi sono stati inseriti all'interno di un sistema di ritenuta stampato in 3D che aveva una guida di puntamento visibile alla risonanza magnetica che poteva essere utilizzata per localizzare le strutture cerebrali del topo sia nella risonanza magnetica che nello spazio delle coordinate stereofiscali. Poiché sia il cranio del topo che la guida di puntamento sono saldamente fissati ai supporti della barra auricolare (Figura 1a,b), è possibile utilizzare una guida di puntamento per correlare le coordinate spaziali all'interno dell'immagine RM e azzerare gli strumenti stereotassici. Il sistema di ritenuta non ha parti mobili e non contiene un trasduttore, il che ci ha permesso di renderlo robusto e sufficientemente piccolo da poter essere inserito all'interno di una risonanza magnetica e di rimuovere l'interferenza del segnale dall'elettronica del trasduttore. Lo spazio all'interno della guida di puntamento è stato svuotato poiché il supporto stampato in 3D per alcuni materiali è visibile nella risonanza magnetica (Figura 1c). Sono stati introdotti dei fori nell'assieme per consentire la calibrazione della stereotax (Figura 3). Il trasduttore a ultrasuoni è stato collegato a un portaelettrodo di una stereotassi e il targeting è stato eseguito come descritto nella sezione 4 (Figura 1d). Il trasduttore deve essere supportato per tutta la sua lunghezza dall'alloggiamento di barre auricolari, evitando qualsiasi deviazione dal piano di livello. Il puntamento in direzione dorso-ventrale può essere ottenuto utilizzando sfasamenti in un array anulare.

La precisione pratica del puntamento è determinata dalla messa a fuoco degli ultrasuoni e dall'attenuazione del cranio. La procedura FUS-BBBO è stata descritta in dettaglio per i ratti 11 ed è stata implementata in un certo numero di altri organismi modello^23,33,34 e nell'uomo ^16,17. La relazione tra la dimensione della messa a fuoco degli ultrasuoni è inversamente proporzionale alla frequenza, dove frequenze più elevate possono portare a un'erogazione più precisa. Tuttavia, l'attenuazione del cranio aumenta con frequenze³⁵ che possono portare al riscaldamento del cranio e al danneggiamento delle aree corticali. L'esatta strategia di targeting dipenderà dal sito del cervello. I siti in cui una pressione massima a tutta larghezza si adatta all'interno del tessuto cerebrale consentono un'apertura prevedibile e sicura della BBB in molte strutture cerebrali come lo striato, il mesencefalo e l'ippocampo. Le regioni vicine alla base del cervello rappresentano una sfida specifica nei topi. Il cervello del topo misura circa 8-10 mm in direzione dorso-ventrale, che è paragonabile alla metà della larghezza massima di molti trasduttori disponibili in commercio. Di conseguenza, il targeting nella parte inferiore del cranio può portare alla riflessione degli ultrasuoni dalle ossa e dall'aria presenti nei condotti uditivi, nella bocca o nella trachea, che possono portare a modelli imprevedibili di alte e basse pressioni³⁶. Alcune di queste pressioni possono superare una soglia di cavitazione inerziale che ha dimostrato di causare sanguinamento e danni ai tessuti³⁷. Per colpire le regioni che si trovano vicino alla base del cranio, può essere preferibile utilizzare ATAC⁷ intersezionale, dove la genetica intersezionale³⁸ viene utilizzata per limitare l'espressione genica a un'area più piccola di quella mirata con il fascio FUS. Nell'esempio pubblicato di ATAC intersezionale, un animale transgenico che esprime un enzima di editing genetico (Cre³⁸) nelle cellule dopaminergiche è stato preso di mira con gli ultrasuoni nella sottosezione della regione contenente le cellule dopaminergiche. Infine, le regioni corticali possono essere prese di mira con la FUS, ma la diffrazione e la riflessione degli ultrasuoni possono verificarsi portando a profili di pressione non uniformi. Questo protocollo non copre il targeting delle regioni corticali in quanto dipenderà fortemente dalle specie utilizzate; tuttavia, è stato osservato un certo targeting della corteccia sopra l'ippocampo 7 (ad esempio, la Figura 7) che indica che, almeno nei topi, è possibile.

La scelta di un attivatore chemiogenetico e il dosaggio dipenderanno dalle specifiche esigenze sperimentali. Un certo numero di studi, tra cui uno degli studi degli autori⁷, non ha mostrato alcuna risposta non specifica significativa^39,40, mentre dosi più elevate (ad esempio, ¹⁰ mg/kg) possono produrre effetti collaterali^, almeno in alcuni casi⁴¹. Tuttavia, come per tutti gli esperimenti comportamentali, controlli adeguati³¹ sono essenziali a causa della potenziale attività off-target del CNO e dei suoi metaboliti⁴². Tali controlli potrebbero includere la somministrazione di CNO e controlli salini ad animali che esprimono DREADDs e la somministrazione di CNO ad animali wild-type o, in alcuni casi specifici, un confronto tra siti ipsi- e controlaterali del cervello che esprimono rispettivamente recettori chemiogenetici e non esprimono. Inoltre, una recente ricerca ha rivelato un certo numero di nuovi agonisti DREADD con una migliore specificità^28,29,43. Altri recettori chemiogenetici ^5,25,44 possono anche essere utilizzati in combinazione con la procedura ATAC.

La valutazione istologica dell'espressione genica è necessaria post-mortem per ogni animale. Una piccola frazione di animali mostra una scarsa espressione genica dopo FUS-BBBO⁷. Inoltre, è necessario mostrare l'accuratezza spaziale e la specificità dell'espressione genica poiché è possibile un mis-targeting. Da notare che alcuni AAV possono mostrare capacità di tracciamento retrogrado o anterogrado⁴⁵ e possono causare trasfezione lontano dal sito bersaglio con gli ultrasuoni, nonostante l'accurato targeting ecografico. Se il recettore chemiogenetico espresso è fuso o co-esprime un fluoroforo, l'imaging del fluoroforo in sezioni di tessuto può essere sufficiente per valutare la localizzazione e l'intensità dell'espressione. Tuttavia, molte proteine fluorescenti sono danneggiate dal processo di fissazione tissutale e l'immunocolorazione per la proteina mCherry, che viene spesso utilizzata con i DREADD, ha prodotto un segnale migliore negli studi precedenti⁷. Infine, a causa della densità dei neuroni in alcune parti del cervello (ad esempio, lo strato cellulare granulare nell'ippocampo), l'uso di fluorofori localizzati in modo nucleare espressi sotto IRES, al contrario delle fusioni, per eseguire conteggi cellulari può essere utile poiché i nuclei possono essere facilmente segmentati e controcolorati con coloranti nucleari, come DAPI o TO-PRO-3. Per valutare la neuromodulazione mediante colorazione c-Fos, è fondamentale eseguire la controcolorazione nucleare e contare i nuclei c-Fos positivi, piuttosto che qualsiasi segnale di fluorescenza. In alcuni casi, i detriti cellulari possono mostrare fluorescenza e confondere le misurazioni delle cellule positive.

I limiti del farmaco e della somministrazione genica con FUS-BBBO includono una risoluzione inferiore rispetto alla somministrazione con iniezioni intracraniche invasive e la necessità di maggiori quantità di farmaci iniettati o vettori virali. Inoltre, mentre un'iniezione diretta nel cervello si traduce in una consegna esclusiva in un sito iniettato, FUS-BBBO utilizza una via endovenosa con conseguente possibile consegna ai tessuti periferici. I limiti dell'uso della chemiogenetica per la neuromodulazione includono una scala temporale lenta, che può essere inadeguata ad alcuni protocolli comportamentali che richiedono rapidi cambiamenti nell'intensità della neuromodulazione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
21-gauge needles (BD)	Fisher Scientific	14826C
25-gauge butterfly catheter	Harvard Bioscience	725966
30-gauge needles (BD)	Fisher Scientific	14826F
Absorbent blue pad	Office Depot	902406
Anti-c-Fos antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-253-G
Anti-mCherry antibody	Thermofisher	PA534974
Bruker Biospec 70/30	Bruker	custom	includes the RF coils
Clozapine-n-oxide	Tocris	4936
Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components	ImageGuidedTherapy, Szablowski lab	custom	download from szablowskilab.org/downloads
Custom MRIgFUS machine	ImageGuidedTherapy	N/A
Definity microbubbles	Lantheus	DE4
Degassed aquasonic/ultrasound gel	Fisher Scientific	5067714
Depilation crème	Nair	n/a
Eight-element annular array transducer	Imasonic Inc.	custom
Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)	Office Depot	599893
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-25KU
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Ketamine	Patterson Veterinary	07-890-8598
Neutral buffered formalin (10%)	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Optical fiber hydrophone	Precision Acoustics
PE10 tubing	Fisher Scientific	NC1513314
Peristaltic pump
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	524650-1EA
Prohance contrast agent	Bracco	0270-1111-04
Saline	Fisher Scientific	NC9054335
Secondary antibody, Donkey-anti goat	ThermoFisher	A-11055
Secondary antibody, Donkey-anti rabbit	ThermoFisher	84546
Surgical scissors (straight)	Fisher Scientific	17467480
ThermoGuide Software	ImageGuidedTherapy
Tissue glue (Gluture)	Fisher Scientific	NC9855218
Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)	Fisher Scientific	14823434
VeroClear 3D printable material	Stratasys	RGD810
Vialmix microbubble activation device	Lantheus	VMIX
Vibrating microtome	Compresstome	VF-300
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1251-1G