ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

Summary

מטרת הפרוטוקול הזה היא לבצע תרבות משותפת דינמית של מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים בפיגומי אלקטרו-ספון צינוריים כדי לחקור התחדשות רקמות מונחית חומרים, באמצעות ביו-ריאה המאפשרת ניתוק של לחץ גיסת ומתיחות מחזוריות.

Abstract

השימוש בביו-חומרים הניתנים למיחזור כדי לגרום להתחדשות ישירות בגוף הוא אסטרטגיה אטרקטיבית מנקודת מבט תרגומית. חומרים כאלה גורמים לתגובה דלקתית עם ההשתלה, שהיא המניע לספיגה מחדש של החומר והתחדשות של רקמה חדשה. אסטרטגיה זו, הידועה גם בשם הנדסת רקמות situ, הוא נרדף כדי להשיג תחליפי לב וכלי דם כגון שתלים וסקולריים מהונדסים רקמות. הן התהליכים הדלקתיים והן התהליכים המתחדשים נקבעים על ידי רמזים ביומכניים מקומיים על הפיגומים (כלומר, מתח מתיחה וגיסת). כאן, אנו מתארים בפירוט את השימוש בביורומטר שפותח בהתאמה אישית המאפשר באופן ייחודי ניתוק של מתח מתיחה וגימה על פיגום צינורי. זה מאפשר הערכה שיטתית ומתוקננת של היכולת הדלקתית וההתחדשותית של פיגומים צינוריים בהשפעת עומסים מכניים מבוקרים היטב, אשר אנו מדגימים על בסיס ניסוי דינמי של תרבות משותפת באמצעות מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים. הצעדים המעשיים העיקריים בגישה זו – בנייתו והקמתו של הביו-רהקטור, הכנת הפיגומים וזריעת התאים, היישום והתחזוקה של זרימת המתיחה וההגשה וקצירת הדגימה לניתוח – נדונים בפירוט.

Introduction

הנדסת רקמות לב וכלי דם (TE) נרדפת כאפשרות טיפול חלופית לתותבות הלב וכלי הדם הקבועות הנמצאות בשימוש כיום (למשל, שתלי כלי דם, תחליפי שסתום לב), שהן תת-אופטימליות עבור קבוצות גדולות של^{חולים 1,2,3,4}. יישומים מבוקשים רבים כוללים שתלים וסקולריים מהונדסים רקמה (TEVGs)^5,6 ושסתומי לב (TEHVs)^7,8. לרוב, מתודולוגיות TE לב וכלי דם לעשות שימוש ביו-חומרים הניתנים למיחזור (טבעי או סינתטי) המשמשים פיגום מאלף עבור הרקמה החדשה להיווצר. היווצרות של רקמה חדשה יכולה להיות מהונדסת לחלוטין במבחנה, על ידי זריעת הפיגומים עם תאים ו culturing ב bioreactor לפני ההשתלה (במבחנה TE)^9,10,11, או ישירות במקום, שבו הפיגומים הסינתטי מושתל ללא פולחן מראש על מנת לגרום להיווצרות של רקמה חדשה ישירות בגוף (במקום TE)^12,13,14. הן במבחנה והן בגישות TE לב וכלי דם במקום, התחדשות תפקודית מוצלחת תלויה באופן דומיננטי הן בתגובה החיסונית המארחת למבנה המושתל והן בטעינה ביומכנית מתאימה.

החשיבות של טעינה ביומכנית עבור TE לב וכלי דם הוא מוכר היטב¹⁵. במקרה של שתלים לב וכלי דם, התאים המאכלסים את הפיגומים חשופים למתיחות מחזוריות וללחצי גיסת המתעוררים כתוצאה מהסביבה המודינמית. מחקרים רבים דיווחו על ההשפעה הממריצת של מתיחה (מחזורית) על היווצרות רכיבי מטריצה, כגון קולגן^16,17,18,19, גליקוזאמינוגליקאנים (GAGs)²⁰, ואלסטין^21,22, על ידי סוגי תאים שונים. לדוגמה, הואנג ואח ' הוכיח כי מתיחה biaxial העלה את התצהיר ואת הארגון של קולגן ואלסטין במבחנה TEVGs באמצעות bioreactor כלי דם²³. בעוד הדגש טמון בדרך כלל על מתיחה כמו עומס דומיננטי, מחקרים אלה לעתים קרובות לעשות שימוש ביו-קטרקטורים מונחה זרימה שבו המדגם חשוף גם לזרימת גיסת. למרות מעט יחסית ידוע על ההשפעה המבודדת של לחצי גיזה על היווצרות רקמות ודלקת בתלת ממד, כמה נתונים זמינים. לדוגמה, Hinderer et al. ו Eoh ואח ' הוכיח כי זרימת הגלד, בנוסף מיקרו פיגומים 3D, היה חשוב להיווצרות של אלסטין בוגר על ידי תאי שריר חלקים כלי דם אנושיים במערכת מודל במבחנה^24,25. בסך הכל, ממצאים אלה ממחישים את הרלוונטיות של מתיחות מחזוריות ומתח גיסת עבור TE לב וכלי דם.

גורם חשוב נוסף להצלחה או לכישלון של שתלי TE הוא התגובה החיסונית של הפונדקאי לשתל המושתל²⁶. זה חשוב במיוחד עבור חומרים מונעים באסטרטגיות TE situ, אשר למעשה מסתמכים על התגובה הדלקתית החריפה לפיגומים כדי להתחיל את התהליכים הבאים של זרם הסלולר היווצרות רקמות אנדוגני ושיפוץ²⁷. המקרופאג ' הוא יוזם קריטי של^{התחדשות רקמות}פונקציונלית, אשר הוכח על ידי מחקרים מרובים 28^,29,30. מקביל לריפוי פצעים, התחדשות הרקמה נשלטת על ידי איתות פרקרינית בין מקרופאגים ותאים המייצרים רקמות כגון פיברובלסטים ומיופיברובלסטים^31,32,33. בנוסף לתיאום תצהיר רקמות חדש, מקרופאגים מעורבים בספיגה פעילה של חומר פיגומים^{זרים 34,35}. ככזה, תגובת המקרופאג' במבחנה לביו-חומרים זוהתה כפרמטר חזוי להצלחת in vivo של שתלים^36,37,38.

תגובת המקרופאג' לפיגומים מושתלים תלויה בתכונות עיצוב פיגומים כגון הרכב חומרים ומיקרו מבנה^35,39,40. בנוסף לתכונות הפיגומים, תגובת המקרופאג' לפיגומים וההצלבה שלהם עם מיופיברובלסטים מושפעת גם מעומסים המודינמיים. לדוגמה, מתיחה מחזורית הוצגה כמאפנן חשוב של פנוטיפ מקרופאג^'41,42,43,44 והפרשת ציטוקינים^43,44,45,46 בפיגומי אלקטרוזופון תלת-ממדיים. באמצעות מערכת תרבית משותפת של מקרופאגים ותאי שריר חלקים וסקולריים, Battiston et al. הוכיח כי נוכחות של מקרופאגים הובילה לרמות גבוהות יותר של אלסטין ו GAGs וכי רמות מתונות של מתיחה מחזורית (1.07-1.10) עוררו את התצהיר של קולגן אני ואלסטין⁴⁷. בעבודות קודמות, הוכחנו כי מתח גיזה הוא דטרמיננטה חשובה לגיוס מונוציטים לתוך פיגומי אלקטרו-ספון תלת מימדיים^48,49, וכי הן מתח גיסת ומתיחה מחזורית משפיעות על האיתות הפרקריני בין מונוציטים אנושיים ותאי סטרומה מזנכימליים⁵⁰. Fahy et al. הראה כי זרימת הגלד הגדילה את הפרשת ציטוקינים פרו דלקתיים על ידי מונוציטים אנושיים⁵¹.

יחד, הראיות לעיל מראות כי הבנה נאותה ושליטה על עומסים hemodynamic הוא חיוני עבור TE לב וכלי דם, וכי חשוב לשקול את התגובה הדלקתית כדי להשיג זאת. ביו-רקטורים רבים תוארו בעבר עבור במבחנה^{52,53,54,55,56,57,58} או ex vivo^59,60,61 תרבות של רקמות לב וכלי דם. עם זאת, כל המערכות הללו נועדו לחקות את תנאי הטעינה ההמודינמית הפיזיולוגיים ככל האפשר. אמנם זה בעל ערך רב לצורך יצירת רקמות לב וכלי דם במבחנה או שמירה על תרביות ex vivo, מערכות כאלה אינן מאפשרות מחקרים שיטתיים לתוך ההשפעות האישיות של רמזים בודדים. הסיבה לכך היא היישום של מתח מחזורי ומתח גיסת אלה מונע על ידי אותה זרימה בלחץ, אשר באופן מהותי מקשר אותם. בעוד מיקרו-מערכות המאפשרות מניפולציה מכנית רב-מדומה מדויקת תוארו עבור מצעים דו-ממדיים⁶² או 3D הגדרות הידרוג'ל^63,64, הגדרות כאלה אינן מאפשרות שילוב של פיגומים ביו-חומריים תלת-חומריים אלסטומרים.

כאן, אנו מציגים את היישום של מערכת bioreactor צינורית המאפשרת באופן ייחודי ניתוק של מתח גיסת ומתיחה מחזורית ומסייעת לחקור באופן מכני את ההשפעות האישיות והמשולבים שלהם. מערכת זו מאפשרת בדיקה של מגוון רחב של שתלי כלי דם מהונדסים רקמה (למשל, מקור סינתטי או טבעי, מיקרו-ארכיטקטורה שונה, נקבוביות שונות). כדי לנתק ביעילות את היישום של מתח הגיה ומתיחה, מושגי המפתח שבהם משתמש הביו-ריאקטור הם (1) הפרדה של השליטה בלחץ הגיסה ומתיחה באמצעות מערכות משאבה נפרדות ו-(2) גירוי של הפיגומים באופן 'מבפנים החוצה' עם ממדים מונעים חישובית. הזרימה מוחלת על פני השטח החיצוניים של הפיגומים הצינוריים באמצעות משאבת זרימה, ואילו מתיחה היקפית של הפיגומים מושרה על ידי הרחבת צינור סיליקון שעליו מותקן הפיגומים באמצעות משאבת מאמץ נפרדת. הממדים של צינור הסיליקון וצינור הזכוכית המכיל את המבנה נבחרים בקפידה ומאומתים באמצעות סימולציות דינמיקה של נוזלים חישוביים, כדי להבטיח כי לחץ הגיזה על הפיגומים (עקב זרימה) והמתיחת ההיקפית (עקב הרחבת הצינור) אינם משפיעים באופן משמעותי זה על זה. לעיצוב מבפנים החוצה זה יש כמה רציונלים מעשיים. אם המתיחה מוחלת על ידי לחץ הנוזלים הזוהרים (בדומה לטעינה פיזיולוגית), היא דורשת מטבעה שעיצוב המדגם יהיה נטול דליפות. בנוסף, הלחץ הנדרש כדי למתוח את המדגם ייקבע לחלוטין על ידי נוקשות המדגם, אשר עשוי להשתנות בין דגימות בתוך מדגם לאורך זמן, מה שמקשה על השליטה במתיחה. ביו-ריקטור זה מרכיב את השתל המהונדס על הרקמה סביב צינור סיליקון ומאפשר ליישום מתח גזיזת קיר (WSS) על הקיר החיצוני של השתל ולוחץ על השתל מבפנים. בדרך זו, תנאי טעינה שווים בין דגימות ובתוך דגימות לאורך זמן ניתן להבטיח, יתר על כן, הדגימות מותר להיות דולף, כמקובל עבור פיגומים כלי דם נקבובי¹⁹. ביו-ריאקטור מבפנים החוצה זה מיועד במיוחד למחקרים שיטתיים על ההשפעות של גיזום ו/או מתיחה, ולא ההנדסה של כלי דם דמוי יליד במבחנה, שעבורו תצורות ביו-ריאקטור כלי דם מסורתיות מתאימות יותר. ראה איור 1A-B עבור ציורי העיצוב של הביו-ריאקטור, ואת הטבלה המתאימה 1 לתיאור פונקציונלי ורציונל מאחורי המרכיבים העיקריים של הביו-ריאקטור.

השימוש bioreactor הוא הודגם על בסיס סדרה של מחקרים אחרונים על ידי הקבוצה שלנו שבו חקרנו את ההשפעות הפרט והשילוב של מתח גזוז ומתיחה מחזורית על דלקת היווצרות רקמות פיגומי אלקטרו-ספון resorbable עבור רקמת לב וכלי דם במקום^19,43,44. כדי לכך, השתמשנו במקרופלגות אנושיות ובמיאופיברובלסטים במונו או בתרבות משותפת כדי לדמות את השלבים השונים של מפל ההתחדשות במקום. הוכחנו כי הפרשת ציטוקינים על ידי מקרופאגים אנושיים מושפעת באופן מובהק הן על ידי מתח מתיחה מחזורית והן על ידי לחץ גיסת, המשפיעים על תצהיר המטריצה וארגון על ידי מיופיברובלסטים אנושיים בפיגומים אלה, הן באמצעות איתות פרקרין והן על מגע ישיר^19,43,44. ראוי לציין, מחקרים אלה גילו כי במקרה של יישום משולב של מתח גיסת ומתיחה, ההשפעות על היווצרות רקמות ודלקת נשלטים על ידי אחד משני העומסים, או שיש השפעות סינרגטיות של שני העומסים. ממצאים אלה ממחישים את הרלוונטיות של ניתוק שני העומסים כדי להבין טוב יותר את תרומת הסביבה המכנית בתהליכי TE. הבנה זו יכולה להיות מיושמת כדי לייעל באופן שיטתי את הפרמטרים של עיצוב פיגומים במשטרי טעינה המונמיים רלוונטיים. בנוסף, הנתונים המכניסטיים מסביבות מבוקרות כגון עשויים לשמש קלט עבור מודלים מספריים המפותחים כדי לחזות את מהלך שיפוץ רקמת situ, כפי שדווח לאחרונה עבור TEVGs⁶⁵ או TEHVs⁶⁶, כדי לשפר עוד יותר את יכולת החיזוי.

Protocol

במחקרים המתוארים בפרוטוקול זה, מקרופאגים אנושיים ראשוניים מבודדים מעילי דם היקפיים ומיופיברובלסטים אנושיים מבודדים מן הווריד saphenous לאחר ניתוח עובר כלילי שימשו⁴⁴. מעילי באפי התקבלו ממתנדבים בריאים, אנונימיים שסיפקו הסכמה מדעת בכתב, שאושרה על ידי ועדת האתיקה הרפואית המוסדית של Sanquin Research. השימוש בתאי וינה סאפנה אנושיים (HVSCs) היה בהתאם ל"שימוש משני תקין בקוד ברקמה האנושית" שפותח על ידי הפדרציה של חברות רפואיות (FMWV) בהולנד.

1. הכנות כלליות ופעולות נדרשות לפני הקמת הביו-ריאקטור

הערה: לקבלת פרטים על פרוטוקולי הבידוד והפולחן המתאימים, עיין בעבודה מוקדמת יותר^19,43,44. כל החישובים בפרוטוקול ניתנים כדוגמאות לניסוי תרבות משותפת עם מונוציטים ומיופיברובלסטים, המושרשים ב-8 פיגומים טעונים בהודינמיקה ו-2 פקדים סטטיים (n=10).

1. התחל בידוד תאים ותרבית תאים. צפיפות הזריעה של הדגימות המתרבתות המשותפות של מונוציטים ומיופיברבלסטים (עם יחס זריעה של 2:1) הן 30 × 10⁶ מונוציטים/ס"מ³ ו-15 × 10⁶ מיופיברובלסטים/ס"מ^3,בהתאמה.
   הערה: לחומר האלקטרו-ספון יש נקבוביות גבוהה (>90%). כדי להעריך את המספר הנדרש של תאים לשתל, נפח הפיגומים מחושב עם הנוסחה לנפח של גליל חלול: π*(עובי)^{2 *אורך}≈ 0.04 ס"מ³. הכמות הכוללת של תאים לשתל היא 1.2 × 10⁶ מונוציטים ו 0.6 × 10⁶ מיופיברובלסטים. עבור 10 דגימות, לפחות 12 × 10⁶ מונוציטים ו 6 × 10⁶ myofibroblasts נדרשים; התחל עם עד ~ 10-15% תאים נוספים כדי להסביר שגיאות pipetting אפשריות.
2. Degas המדיום תרבית התא שישמש לניסויים מעורבים bioreactor.
   1. הכן את המדיום לתרבויות משותפות, המורכב מ- RPMI-1640:aDMEM (1:1), בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו- 0.5% L-גלוטמין.
   2. מניחים את המדיום למשך הלילה (O/N) באינקובטור בבקבוק תרבית תאים עם מכסה מסנן לדגה.
   3. החלף את מכסה המסנן במכסה הדוק לאוויר ואחסן ב- 4 °C (70 °F).
   4. רגע לפני השימוש, להוסיף 0.25 מ"ג / מ"ל L-חומצה אסקורבית 2-פוספט (ויטמין C) למדיום.
      הערה: עבור חישובים, כמות המדיום הנדרש לכל תא תרבות זרימה היא 50 מ"ל. רענן את המדיום שלוש פעמים בשבוע; מדיום ישן 25 מ"ל מוחלף על ידי 25 מ"ל בינוני טרי. עבור 10 דגימות; לאחר זריעה, נדרש מדיום טרי של 500 מ"ל, ועל כל שינוי בינוני עוקב, נעשה שימוש במדיום טרי של 250 מ"ל. תמיד להכין בינוני טרי, במיוחד, ויטמין C צריך להתווסף רק לפני שינוי המדיום.
3. הכן פיגומי אלקטרו-ספון איזוטרופיים (קוטר זוהר 3 מ"מ, עובי קיר של 200 מיקרומטר) כמתואר על ידי ואן האפטן ואח '¹⁹ (איור 1G-I). בקצרה, פיגומי פוליפקולקטון בי-סוריה (PCL-BU) צינוריים מיוצרים על ידי אלקטרוספין מפתרונות כלורופורם-פולימר 15% (w/w). פתרונות הפולימר הם אלקטרו-ספון בטמפרטורת החדר ו-30% לחות יחסית, בקצב זרימה של 40 μL/min, מרחק של 16 ס"מ מהיעד הגלילי המסתובב (Ø 3 מ"מ, 500 סל"ד), ומתח יישומי של 16 קילוואט על הזרבובית האלקטרו-ספינינג ו-1 כ"ס ביעד.
   הערה: למרות שתלים PCL-BU שימשו לניסויים אלה, מגוון רחב של שתלים מהונדסים רקמה אלסטומית ניתן להרכיב ביו-ריקטור זה (למשל, ממקור סינתטי או טבעי שונה, microarchitecture שונה, נקבוביות שונות)
   1. הסר את פיגומי האלקטרו-ספון מהגברת.
      1. לעשות חור קטן בכובע של צינור 15 מ"ל כדי "להחזיק" את המנדרל במרכז ולמנוע ממנו לגעת בקיר הצינור.
      2. מניחים את המנדרל עם פיגום האלקטרו-ספון בצינור הבז וממלאים אותו במים דה-יוניים.
      3. להקפיא את הצינורות O / N ב -20 °C (50 °F).
      4. מניחים את הצינורות בטמפרטורת החדר (RT) ושולפים את המנדרלים לאחר מספר דקות, ומשאירים את השתלים האלקטרו-ספון בקרח.
      5. תן לקרח להפשיר לחלוטין, הסר את צינור האלקטרו-ספון מהמים המופשרים, ו'נתלה' להתייבש אנכית למשך מספר שעות. ודאו שהפיגומים לא 'מתמוטטים' תחת משקלם.
   2. פיגומים יבשים תחת ואקום O/N.
   3. תמונה מדגם קטן של השתלים אלקטרו-ספון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) כדי להעריך את המיקרו מבנים שלהם (למשל, מורפולוגיה סיבים, קוטר סיבים). השתלים במחקרים לדוגמה יש כיוון סיבים איזוטרופיים וקוטר סיבים של 5 מיקרומטר(איור 1H–I).
4. יום אחד לפני תחילת הניסוי, הניחו את המאגר ההידראולי מלא במים דה-יונים באינקובטור. סגור את כל שמונת החיבורים לתאי תרבות הזרימה עם כובעי לוהר לבנים. התחבר למערכת האוויר הדחוסה והכנס חיישן לחץ. הפעל את משאבת המתח (ראה שלב 5.6) O/N כדי לאפשר הרחבה קטנה של מפוח הטפלון.
   הערה: ודא שכל החומרים והציוד הדרושים מנוקים ו/או משועבדים אוטומטית (ראה טבלת חומרים, עמודת הערות/תיאור שעבורה מותר להשתמש אוטומטית בחומרים), בהתאם לפרוטוקול היצרן או כמתואר בשלבים 7.3-7.6.
5. ודא תנאי עבודה סטריליים למשך שארית הפרוטוקול.
   1. ביצוע שלבים 2-5.3 (הגדרת המערכת), שלב 6.3 (שינוי בינוני) ושלבים 7.1-7.2 (קציר מבני כלי דם) בארון זרימה למינאר סטרילי.
   2. מניחים חומרים שאינם נחוצים ישירות לשלבים הבאים במנות פטרי סגורות כדי לשמור על הכל נקי ככל האפשר.
   3. משטחי חומר נקיים או יבשים באופן קבוע על ידי השריית רקמת נייר עם 70% אתנול, ומנגבים את המשטחים של רכיבי הביו-ריאקטור וארון הזרימה למינארי.

2. הקמת הביו-ריאקטור

הערה: בצע את שלב 2 בארון זרימה למינארי.

1. חותכים את פיגומי האלקטרו-ספון לצינורות באורך של כ-25 מ"מ, ומתעדים אותם לפני השימוש (למשל, צילום לאורך, שוקלים באיזון את המסה הראשונית).
2. לטהר את פיגומי אלקטרו-מפון.
   1. מניחים את פיגומי האלקטרו-ספון מוטים בצלחת באר או צלחת פטרי, עם פתח אחד הפונה למקור האור האולטרה סגול (UV), כדי לאפשר לאור UV (253.7 ננומטר) להאיר את החלק הפנימי של הפיגומים.
   2. לחשוף את פיגומי אלקטרו-ספון לאור UV במשך 5 דקות.
   3. סובבו את כל הפיגומים וחזרו על תאורת ה-UV לפתיחה השנייה.
      הערה: לאחר שלב זה, רק לגעת פיגום אלקטרו-ספלון בעת הצורך. תמיד להשתמש פינצטה נקייה או כפפות נקיות.
   4. קח את צינורות הזכוכית של תאי תרבות הזרימה המאוחסנים ב -70%, לשטוף את צינורות הזכוכית במים אולטרה-תפומיים, יבש, ומניחים בצלחת פטרי גדולה וסגורה.
      הערה: השלבים הבאים, במיוחד שלבים 2.3-2.5, מבוצעים באופן אידיאלי על ידי שני ניסויים.
3. הר את פיגומי האלקטרו-ספון על צינורות הסיליקון.
   1. חבר את התפר 5-0 נוטה לקצה אחד של צינורות הסיליקון על ידי לקיחת התפר דרך צד אחד של הצינור ומחוץ לצד השני, משאיר שני תפרים מתוחים מנוגדים המשתרעים על פני החלק הצולב של הצינורות. הפוך קשר קטן משני צידי הצינור תוך דחיסת הצינור על מוקד הקשרים ולהשאיר כ 10 ס"מ של חוט על שני הקשרים. הפוך קשר שלישי בסוף שני חוטים 10 ס"מ שנותרו.
      1. חותכים את מחט התפר ואת כל החוטים החופשיים שעלולים להתבלט ולפגוע בחלק הפנימי של פיגום האלקטרו-ספון. חותכים את הקצוות של צינורות הסיליקון לצורה משולשת כדי לסייע במשיכת צינורות הסיליקון דרך פיגום האלקטרו-ספון.
   2. טובלים את פיגום האלקטרו-ספון ב-30% אתנול (זה משמש כצעד טיהור נוסף ומסייע בהזזת פיגום האלקטרו-ספון מעל צינורות הסיליקון) ומניחים את פיגום האלקטרו-ספון מעל חוט ה-10 ס"מ החינמי. הנסיין A מותח את צינורות הסיליקון על ידי משיכה עדינה הן על צינורות הסיליקון והן על הקשר של חוט התפר 10 ס"מ, בעוד הנסיין B מחליק בעדינות את פיגום האלקטרו-ספון מעל צינורות הסיליקון באמצעות פינצטה עם קצה פנימי חלק כדי למנוע פגיעה בפיגומים.
   3. שחררו לאט את המתיחה על צינורות הסיליקון, ובמקביל חלקו את פיגום האלקטרו-ספון עם פינצטה. טובלים את פיגום האלקטרו-ספון על צינורות הסיליקון במים אולטרה-תותים פעמיים.
      הערה: ייתכן כי כמה קמטום של פיגום אלקטרו-ספון מתרחשת. מקומט זה ייעלם במהלך המתיחה מראש מיושם ממש לפני תיקון הפיגומים לצינורות הלחץ בשלב 2.5.3.
   4. חזור על שלבים 2.3.2 ו- 2.3.3 עבור פיגומי האלקטרו-ספון האחרים. בהתאם לאורך צינורות הסיליקון, פיגומים אלקטרו-ספון מרובים יכולים להיות מותקנים על אותו צינורות סיליקון.
   5. כאשר כל פיגומי האלקטרו-ספון מותקנים על צינורות הסיליקון, חותכים את צינורות הסיליקון סביב הפיגומים, כולם באותו אורך (5.5 ס"מ); בצד אחד, קרוב לסוף פיגום האלקטרו-ספון, בצד השני, משאיר ~ 2-3 ס"מ של צינורות סיליקון חינם.
4. בנו את התא התחתון של תא תרבות הזרימה (איור 1A–B).
   1. קח את החלק העליון של התא התחתון המכיל את שקע הזרימה, וסגור את שקע הזרימה עם תקע Luer זכר.
   2. לדחוף את צינור הלחץ עם חורים דרך התא התחתון, ומניחים O-טבעת סיליקון סביב הקצה התחתון של צינור הלחץ כדי למנוע דליפה. בורג החלק התחתון של התא התחתון לחלק העליון של התא התחתון כדי לאבטח את צינור הלחץ. ודא כי החריץ החרוט התחתון של צינור הלחץ הוא כ 3-5 מ"מ מעל קצה התותב מתאם של התא התחתון; זה מאוחר יותר "להחזיק" את הקשר הדוק של חוט התפר, תיקון פיגום אלקטרו-ספון מעל צינורות הסיליקון.
      הערה: אם צינור הלחץ ניתן לתמרן בקלות למעלה ולמטה, הוא מציין כי התא התחתון אינו מאובטח היטב. חזור על שלב 2.4.2 כדי למנוע דליפה בשלבים מאוחרים יותר (איור 2D).
5. אבטחו את צינורות הסיליקון עם פיגום האלקטרו-ספון לצינור הלחץ.
   1. משוך את צינור הסיליקון עם פיגום אלקטרו-ספון מעל צינור הלחץ.
   2. הפוך קשר עם חוט התפר בקצה התחתון של פיגום אלקטרו-ספון במיקום החריץ החרוט על צינור הלחץ. צור קשר שני בצד הנגדי כדי לאבטח היטב את צינורות הסיליקון עם שתל האלקטרו-ספון.
      זהירות: זהו צעד קריטי. ודא כי הקשר בדיוק "נופל" לתוך החריץ חרוט של צינור הלחץ כדי למנוע דליפת מים מן המאגר ההידראולי לתאי תרבות הזרימה. אם לא בטוח, נסו להדק את חוט התפר במספר עמדות, מעל או מתחת למיקום הצפוי של החריץ, כדי להבטיח שהקשרים הסופיים נמצאים בדיוק בחריץ החרוט(איור 2A).
   3. מניחים את מהדק המספריים בקצה העליון של צינור הסיליקון, ולמתוח את צינורות הסיליקון כלפי מעלה (זה יבדוק ישירות את הקשר הראשון, אם אפשר להזיז את צינורות הסיליקון עם פיגום האלקטרו-ספון מעל צינור הלחץ, הוא לא היה מהודק מספיק טוב). עם כוח המשיכה, צינורות הסיליקון נמתחים מראש. כדי להבטיח שצינורות הסיליקון עקביים בין הדגימות השונות, חברו סרגל להידוק המספריים. משכו את מהדק המספריים כלפי מעלה עד שהקצה התחתון של הסרגל מגיע לגובה הקצה התחתון של הפיגומים.
      הערה: חשוב לשמור על טרום מתיחה בכל מדגם בערך אותו (~ 5%) משתי סיבות: (1) אם צינורות סיליקון הוא מתוח מראש, זה יגרום התרחבות הומוגנית יותר לאורך המדגם בעת לחיצה; (2) טרום המתיחה תשפיע על המאפיינים המכניים של הסיליקון, ולכן זה צריך להיות זהה על פני כל הדגימות כדי להבטיח תנאי מתיחה שווים בין הדגימות.
   4. הסר קמטים בפיגום האלקטרו-ספון על ידי משיכה עדינה של פיגום האלקטרו-ספון. שוב, לעשות שני קשרים משני הצדדים עם חוט תפר בקצה העליון של הפיגומים במיקום של החריץ החרוט העליון על צינור הלחץ.
   5. שחררו את מהדק המספריים, וחתכו את עודף צינורות הסיליקון בסכין, והותירו 20%-30% מחוט הבורג מכוסה בצינורות סיליקון, כדי למנוע דליפה כאשר חרוט האף מותקן על חוט הבורג.
      הערה: חזור על שלבים 2.4 ו- 2.5 עבור כל הדגימות הדינמיות.
   6. עבור דגימות הבקרה הסטטית, אבטחו את פיגום האלקטרו-ספון המותקן על צינורות הסיליקון על צינורות לחץ ללא חורים. צינורות אלה ניתן לשמור בנפרד בצינור 15 מ"ל עד זריעה (שלב 4) ואין צורך להרכיב בתאי תא תרבות הזרימה.
6. לטהר את תאי תרבות הזרימה שנבנו חלקית עם פיגום אלקטרו-ספון על ידי חשיפתו לאור UV במשך 10 דקות. להפוך את תאי תרבות הזרימה עם פיגומי אלקטרו-ספון לצד השני, ולחזור על חשיפה לאור UV במשך 10 דקות.
7. בורג קונוסים האף על חוט הבורג של צינורות הלחץ עם חורים עבור הדגימות הדינמיות.
   1. ודאו שהקצה העליון של צינורות הסיליקון מתאים לקונוס האף כדי למנוע דליפה בשלבים מאוחרים יותר. אם יש יותר מדי צינורות סיליקון, לחתוך את עודף הצינורות משם עם סכין.
   2. מניחים את תאי תרבות הזרימה שנבנו חלקית בצלחת פטרי גדולה, ומכוונים את חרוט האף לכיוון מקור האור UV. החל תאורת UV במשך 5 דקות.
8. בנייה מלאה של תא תרבות הזרימה עם צינור הזכוכית והתא העליון של תא תרבות הזרימה (איור 1A-B).
   1. הרטיבו מראש את פיגומי האלקטרו-ספון על ידי טבילת צינור הלחץ עם צינורות הסיליקון ופיגומי האלקטרו-ספון ב-30% אתנול, ולאחר מכן טבילה במים אולטרה-טורפים פעמיים.
   2. מניחים את צינור הזכוכית מעל צינור הלחץ, ודוחפים בעדינות בתא התחתון ומאבטחים אותו בעדינות.
   3. קחו את התא העליון המכיל את פתח הזרימה, הניחו טבעת O מסיליקון, מחליק הזרימה ואת תוחבי המתאם בסדר הנכון (איור 1A–B),והנחו מעל הקצה הפתוח של צינור הזכוכית ואבטחו אותו בעדינות.
   4. בורג כובע Luer לבן על זרם של התא העליון.
   5. הסר את תקע Luer זכר משקע הזרימה של התא התחתון, ולנקות את פני השטח סביבו עם רקמת נייר ספוג אתנול.
   6. מניחים מזרק עם 10 מ"ל של מים אולטרה-סבר בשקע הזרימה, פתחו את כובע הלואר הלבן בתא העליון ומלאו את התא במים אולטרה-סבר. סגור שוב את כובע הלואר הלבן, הסר את המזרק, נקה שוב עם אתנול, וסגור את שקע הזרימה עם תקע Luer זכר.
      הערה: חזור על שלבים 2.6-2.8 עבור כל תאי תרבות הזרימה.
   7. עבור פקדים סטטיים, להוסיף 10 מ"ל של מים אולטרה-תול לצינורות 15 מ"ל מחזיק את הדגימות רכוב על צינורות הלחץ ללא חורים.
9. מקם את כל תאי תרבות הזרימה באינקובטור. החלף את המים האולטרה-תותביים במדיום תרבית יום אחד לפני זריעת התא באותו אופן המתואר בשלבים 2.8.5 ו- 2.8.6 (הקפד לאסוף את המים האולטרה-ספוגים 'הישנים' עם רקמת נייר ספוגה באתנול המונחת ישירות על שקע הזרימה).

[הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן]

3. הכנות להתקנת משאבת הזרימה

הערה: בצע את שלב 3 בארון זרימה למינארי.

1. לאסוף את כל חומרי הגדרת המשאבה ולהתכונן לשימוש.
   הערה: הנסיינים מופנים לפרוטוקול היצרן לתיאור מפורט של הגדרת המשאבה, היחידות הנוזליות והצינורות הבינוניים דרך השסתומים של היחידה הנוזלית.
   1. הגדר את המשאבה לקיבולת של 200 מ"ר.
   2. בורג מחזיקי המאגר עבור מאגרים 60 מ"ל ליחידות הנוזלים.
   3. נקו את מסנני אוויר הגומי שמיש מחדש עם רקמת נייר ספוגה באתנול, ודאו שמסנן האוויר נשאר יבש.
2. מניחים את מאגרי 60 מ"ל במחזיקי המאגר, ומניחים את הצינורות הבינוניים הסטנדרטיים דרך שסתומי היחידה הנוזלית. חברו את הצינורות הבינוניים בקוטר פנימי גדול יותר עם מצמדי מנעול לוקר ללולאה סגורה.
3. מהדקים את הצינור הבינוני עם קליפ צינור, ישירות מתחת למאגרים.
4. מלא את המאגרים עם 25 מ"ל של בינוני תרבות לכל 60 מ"ל מאגר. שחררו את מהדק הצינור, ותנו למדיום להיכנס לצינורות.
5. סוגרים את המאגרים הבינוניים עם מסנני אוויר הגומי, ומניחים את מערך משאבת הזרימה באינקובטור עד לשלב 4.

4. זריעת תאים באמצעות פיברין כמנשא תא

הערה: בצע את שלב 4 בארון זרימה למינארי.

1. הכן את ג'ל הפיברין לשלב זריעת התא. לפרטים, ראה מול ואח^{' 67} עבור ג'ל פיברין, פתרון פיברינוגן צריך להיות ריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל (נכון לטוהר של מלאי החלבון), ואת פתרון תרומבין צריך להיות ריכוז סופי של 10 U / mL.
   1. להפשיר פיברינוגן ל RT, לפני שקילה ~ 50 מ"ג (מספיק עבור 10 דגימות) במיכל פלסטיק עם מכסה אדום.
   2. הוסף תרבית התא בינוני כדי להכין את פתרון פיברינוגן (בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל, נכון לטוהר של מלאי החלבון). מערבבים היטב ומסננים כדי לעקר את פתרון הפיברינוגן עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל. שמור את פתרון פיברינוגן מסונן על קרח.
      הערה: הימנע מהכנת פתרון פיברינוגן זמן רב מדי מראש, אחרת הפיברינוגן עלול לקריש באופן ספונטני.
   3. להפשיר תרומבין ולעשות פתרון תרומבין (בריכוז של 10 U / mL) בתרבית התא בינוני ומניח על קרח. הכן 20 μL תרומבין + פתרון תאים לכל דגימה. עבור n = 10 דגימות, 200 μL יש צורך; לכן, להכין פתרון תרומבין 250 μL כדי להסביר שגיאות pipetting אפשריות.
2. לאסוף ולספור את התאים מבקבוקי התרבות. מערבבים את התאים ביחס ובכמות הרצויים (1.2 × 10⁶ מונוציטים ו-0.6 × 10⁶ מיופיברובלסטים לפיגומים). ודא שיש מספיק תאים עבור דגימות n+1 לתיקון עבור שגיאות pipetting. צנטריפוגה ב 350 × גרם במשך 10 דקות ב RT. הסר את supernatant.
3. הפוך תערובת של התאים המושעים תרומבין.
   1. עבור כל דגימה, השתמש 20 μL של פתרון תרומבין. לקבלת n = 10 דגימות, להוסיף 200 μL תרומבין לכדור התא ולערבב. למדוד את הנפח של השעיית התא (תאים + תרומבין), ולחשב כיצד לחלק באופן שווה על כל 10 פיגומים (למשל, אם התרומבין + השעיית התא יש נפח של 260 μL, כל דגימת אלקטרו-ספון תקבל 260 μL / 10 דגימות = 26 μL תרומבין + השעיית תא).
   2. כמו זריעת הפיגומים מבוצע בשני שלבים, להכין שני צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל שיחזיק חצי מתלה התא עבור כל פיגום (בחישוב לדוגמה של השלב הקודם: להכין שני צינורות עם 13 μL של תרומבין + השעיית תא). מניחים על קרח.
      הערה: השלבים הבאים, במיוחד שלב 4.4, מבוצעים באופן אידיאלי על ידי שני ניסויים.
4. יבשו את פיגומי האלקטרו-ספון הרטובים מראש עם ואקום כדי להתכונן לזריעת תאים.
   1. חברו צינור פסטר מזכוכית למערכת הוואקום של ארון הזרימה למינארי, והכניסו בצינור ריק של 50 מ"ל לאחסון זמני סטרילי.
   2. קח את תאי תרבות הזרימה מהאינקובטור, הסר את תקע הלואר הזכר משקע הזרימה, והסר את המדיום לאחר פתיחת כובע הלואר הלבן והנחת רקמת נייר ספוגה באתנול מול שקע הזרימה.
   3. הורידו את התא העליון ואת צינור הזכוכית, ומניחים בצלחת פטרי סטרילית לאחסון זמני.
   4. מניחים את צינור פסטר הוואקום על פיגום האלקטרו-ספון, ומסירים כמה שיותר בינוני.
      אזהרה: שואב אבק לייבש את פיגום אלקטרו-ספלון בעדינות רבה. במקום תנועה ליניארית הלוך ושוב מעל הפיגומים, הנח את צינור הוואקום במספר מיקומים. מהדקים את צינורות הוואקום על גבי הצינור של פסטר בין האצבעות לשליטה טובה יותר.
   5. מערבבים את פתרון הפיברינוגן ביחס של 1:1 עם השעיית תרומבין + תאים (למשל, מערבבים 13 μL של פיברינוגן עם 13 μL של תרומבין + השעיית תאים). כדי לוודא כי הפיברין פולימר בפיגומים ולא בצינור microfuge, pipet פיברינוגן, להפוך את גלגל הצינור עבור "נפח נוסף" של תרומבין + השעיית התא, וצינור למעלה ולמטה פעם אחת בצינור microfuge עם מתלה תא לערבב.
   6. באופן הומוגני ישירות לטפטף את הפתרון על פני כל אורכו של פיגום אלקטרו-ספון. מומלץ כי Experimenter A מטפטף את תערובת הפיברין, בעוד הנסיין B מחזיק את התא התחתון עם פיגום אלקטרו-ספון רכוב על צינור הלחץ.
   7. לאחר הפיברין עם התאים מטפטף על פיגום אלקטרו-ספון, Experimenter B מזיז לאט את הפיגומים, משמאל לימין ולמעלה ולמטה, כדי לחלק את התאים באופן שווה על הפיגומים.
   8. חזור על שלב 4.4.5 - 4.4.7 בצד השני של פיגום האלקטרו-ספון.
   9. הר את תא תרבות הזרימה שוב על ידי הצבה זהירה של צינור הזכוכית (למנוע דבק פיברין וקרישת בצד הפנימי של צינור הזכוכית), ולדחוף בחזרה את התא העליון של תא תרבות הזרימה. מניחים ישירות את המבנה המוזרע ללא תמיסת מלח בינונית או פוספט (PBS) בתא תרבות הזרימה באינקובטור.
   10. חזור על שלבים 4.4.1–4.4.9 עבור כל הדגימות הדינמיות. עבור דגימות סטטיות רכוב צינורות לחץ ללא חורים, זרע על פי שלבים 4.4.1-4.4.8, ומניחים בצינור 15 מ"ל לאחר מכן.
   11. תן פיברין פילמור במשך 60 דקות באינקובטור.

[הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן במשך 30-60 דקות.]

5. לאחר פילמור, מלא את תאי תרבות הזרימה (דגימות דינמיות) או את צינורות 15 מ"ל (דגימות סטטיות) עם בינוני.

5. צימוד של מערכות הביו-ריאקטור ומשאבת הזרימה לפני תחילת הניסוי

הערה: בצע את השלבים 5.1-5.3 בארון זרימה למינארי.

1. קח את המגש הנושא את תאי תרבות הזרימה ואת היחידות הנוזליות עם מאגרים בינוניים מלאים וצינורות בינוניים מחוברים בתוך ארונות הזרימה למינאר.
2. מקם את תאי תרבות הזרימה בבסיס הביו-ריאקטור עבור קבוצות הניסוי העמוסות במתיחות מחזוריות ועם עומסים המודינמיים משולבים(איור 1E).
   1. הטה את תא תרבות הזרימה הפוך, ומלא את צינור הלחץ מלמטה במים אולטרה-תפותיים באמצעות מזרק עם צינורות דקים (זה יכול להיות מכל סוג שהוא, כל עוד הוא גמיש ודק, בניסוי זה, חוט קוטר פנימי באורך 10 ס"מ, 0.15 מ"מ היה מחובר למחט).
   2. מניחים את הצינורות הדקים בתוך צינור הלחץ, ובעוד צינור הלחץ מלא במים אולטרה-סבר על ידי דחיפת המים בהדרגה אל מחוץ למזרק, הוציאו את החוט מצינור הלחץ בו זמנית, כדי לוודא שאין בועות אוויר בתוך צינור הלחץ.
   3. הנח את תא תרבות הזרימה על אחד משמונת חוטי הברגים בבסיס הביו-ריאלקטור. הנח טבעת O מסיליקון בין בסיס הביו-ריאקטור למחבר הלואר הלבן כדי למנוע דליפה אפשרית, והידק את מחבר הלואר הלבן מהתא התחתון.
   4. חזור על שלבים 5.2.2 ו- 5.2.3 עבור כל הדגימות הנמתחות מחזורית.
3. חבר את תאי תרבות הזרימה לכל קבוצות הניסוי, למעט השליטה הסטטית, למערכת משאבת הזרימה.
   1. מניחים קליפ צינור על הצינור הבינוני. הסר את כובע Luer הלבן המכסה את זרם הזרימה של התא העליון של תא תרבות הזרימה. הסר את מצמד Luer הנשי של הצינורות הבינוניים, וחבר את הצינורות הבינוניים בצד אחד עם זרם הזרימה בתא העליון, ואת הצד השני של הצינורות הבינוניים עם שקע זרימה בתא התחתון.
   2. חזור על שלב 5.3.1 עבור כל תאי תרבות הזרימה. בשלב זה, הביו-ריאקטור ותאי תרבות הזרימה מלאים במדיום ומחוברים למערכות הזרימה.
   3. עבור דגימות הבקרה הסטטית, מקם את הדגימות אנכית בבקבוק תרבית תאים עם מכסה מסנן באמצעות מהדק המספריים. ממלאים את בקבוקון תרבית התאים במדיום ומניחים באינקובטור.
4. מעבירים את ההתקנה המלאה מארון הזרימה למינארי לאינקובטור, ומחברים את היחידות הנוזליות לצינורות לחץ האוויר והכבל החשמלי.
5. הפעל את התוכנה ואתחל את משאבות הזרימה. התחל את הזרימה הבינונית עבור הדגימות אחת אחת.
   1. בדוק אם השסתומים של היחידה הנוזלית לוחצים.
   2. הסר את מהדק הצינור מן הצינור הבינוני.
   3. התחל את משאבת הזרימה עם 100 מ"ר וזמן מיתוג של 10.
   4. בדוק בקפידה את כיוון הזרימה עבור דליפת בועות אוויר או אפשריות. ניתן להסיר בועות אוויר לכודות על ידי הפיכת תא תרבות הזרימה.
      הערה: ודאו שהרמות הבינוניות במאגרים הבינוניים מאוזנות, כדי למנוע שאיבה של אוויר למערכת ובועות אוויר בתאי תרבות הזרימה, ולא לאפשר למאגרים להתייבש(איור 2C).
   5. חזור על שלב 5.5 עבור כל היחידות הנוזליות אחת אחת.
6. אתחל את משאבת המתח.
   1. חבר את המשאבה המופעילה הפנאומטית דרך פתח האוויר על הגליל הפנאומטי לאוויר הדחוס. חברו את שקע האוויר התחתון עם הצינורות הכחולים לאוויר בחוץ(איור 1F).
   2. פתח תוכנת LabVIEW, הפעל את סקריפט LabVIEW ומערכת יישומים לחץ אוויר דחוס, כפי שתואר על ידי ואן Kelle ואח^'68, להיכנס עקירה ותדירות (להתחיל בתדר נמוך של 0.2 הרץ). השהה את המשאבה כאשר מפוח הטפלון נמצא ברמה הנמוכה ביותר שלו.
   3. הנח את חיישן הלחץ בכניסת חיישן הלחץ על המאגר ההידראולי.
7. שנה את הגדרות המשאבה להגדרות הרצויות (עבור 1.5 Pa, השתמש ב- 150 מ"ר, זמן מיתוג של 10).
8. התחל את משאבת המתח והפעל את ההגדרה המועדפת (למשל, 0.5 הרץ, מתיחה של 1.05).

6. ניסוי ריצה במשך מספר ימים; ניטור גיהה ומתיחה במהלך תרבות והחלפה בינונית

1. חשב את ה-WSS בקיר הפיגומים.
   1. הקלט את גודל הזרימה כל יומיים (עיין במדריך של יצרן משאבת הזרימה לקבלת פרטים). בקיצור, לבחון את השינוי ברמות הנוזל (ב- mL) במאגרים הבינוניים בין המעבר של מאגר היחידה הנוזלית עבור 10 s. לבצע לפחות חמש מדידות, לחשב את הערך הממוצע, ולהכפיל ב 6 כדי לקבל את קצב הזרימה Q ב mL / min.
   2. הזרימה מתוארת על ידי זרימת Poiseuille דרך ערוץ טבעתי. בהנחה שתרבית בינונית כנוזל ניוטוני, חשב את ה- WSS בקיר הפיגומים, r₁, לפי משוואה 1.
      (1)
      כאשר WSS τ_w בקיר הפיגומים (r_1;כאן r₁ = 1.7 מ"מ), הנובע מזרימת מצב יציבה, נקבע על ידי p הלחץ המופעל והרדיוס הפנימי של צינור הזכוכית r₂ (כאן r₂ = 2.3 מ"מ). שיפוע הלחץ בכיוון צירי נחשב אחיד בין כניסת הזרימה לשקע הזרימה, והוא ניתן על-ידי משוואה 2 (איור 1J).
      (2)
      עם μ הצמיגות הדינמית (כאן צמיגות בינונית נחשב קבוע, μ = 0.7 × 10^-3 Pa∙s ב 37 °C (C) ו Q קצב הזרימה המוחל.
2. לפקח על המתיחה מוחל על הפיגומים כל יומיים.
   1. מניחים רקע כהה מאחורי תא תרבות הזרימה כדי להגביר את הניגוד בין הפיגומים לרקע. מקם את מנורות תאורת ה- LED, המצביעות לכיוון הפיגומים, כדי לסייע בהדמיה של הפיגומים.
   2. קח צילומי זמן לשגות של הפיגומים בתדר של 30 הרץ עבור 6 s (כלומר, 3 מחזורי מתיחה) עם מצלמה במהירות גבוהה.
      הערה: תדירות הקלטה נמוכה יותר עשויה להספיק אם המצלמה מאפשרת זאת. עם זאת, התדירות המינימלית הנדרשת לא נקבעה.
   3. קבעו ידנית את הקוטר המינימלי והמקסימלי של הפיגומים מהתמונות.
   4. חשב את הקוטר החיצוני המינימלי והמקסימום של פיגום האלקטרו-ספון כדי לחשב את המתיחות המרביות לפי משוואה 3.
      (3)
      כאשר המתיחה ההיקפית (λ_θ) ניתנת על ידי היחס בין הקוטר החיצוני של הפיגומים, d_1,לקוטרו ההתחלתי, ד_0.
3. תקן לאידוי בינוני ורענן בינוני שלוש פעמים בשבוע.
   1. עצור ופרק את הכבלים עבור מערכות הזרימה ומשאבת המתח.
   2. מניחים מהדקי צינור על הצינור הבינוני.
   3. קבע כמה בינוני התאדה בהתבסס על סימני המחוון של אמצעי האחסון במאגרים הבינוניים.
   4. מעבירים את המגש עם הביו-ריאה והיחידות הנוזליות לארון הזרימה למינארי.
   5. הסר את מסנני אוויר הגומי של המאגרים הבינוניים; מוסיפים מים אולטרה-טחון אוטומטיים כדי לפצות על הנפח המתאדה של בינוני. סוגרים שוב את המאגרים הבינוניים, ומתחברים שוב למשאבה כדי לערבב את המדיום עם המים האולטרה-תיבול.
   6. חזור על שלבים 6.3.1–6.3.5. הסר את מסנני אוויר גומי שוב, להוציא 25 מ"ל של בינוני תרבות, ולהסתובב למטה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב RT.
      1. לאסוף 1.5 מ"ל supernatant, ולאחסן ב -30 °C לניתוח של פרופילי הפרשה (לניתוח עם חיסון הקשורים לאנזים (ELISA)).
      2. לאסוף את הנפח הרצוי של supernatant עבור מחקרי איתות paracrine, באמצעות supernatant כמו בינוני מותנה⁴³.
   7. יש להוסיף 25 מ"ל של בינוני טרי למאגרים הבינוניים.
   8. מניחים מסנני אוויר גומי בחזרה על המאגרים הבינוניים.
   9. מניחים את ההתקנה המלאה בחזרה באינקובטור; חברו את כל הכבלים וצינורות האוויר למשאבה ומשאבת המתח. שחררו את מהדקי הצינור וחזרו על שלבים 5.4-5.8.
4. בדוק אם חרוזי ייבוש סיליקה בבקבוקי הייבוש המחוברים למשאבה לחים (מראה לבן), והחליפו בחרוזי סיליקה יבשים במידת הצורך (מראה כתום).

7. סיום ניסוי, איסוף דוגמאות וניקוי ואחסון ציוד

1. ביום האחרון של הניסוי, נכון לאידוי בינוני כמתואר בשלבים 6.3.1-6.3.5, וקוצר את הדגימות אחד אחד.
   1. כדי לקצור את הדגימות אחד אחד, משאבת הזרימה ומשאבת המתח צריכים להיות מושהים מספר פעמים. מניחים קליפ צינור על צינורות בינוניים. עצור זמנית את משאבת הזרימה ואת משאבת המתח. נתק תא תרבות זרימה אחד מבסיס הביו-ריאלקטור; להחליף על ידי כובע Luer לבן על בסיס bioreactor. קח את תא תרבות הזרימה והיחידה הנוזלית לארון הזרימה למינאר. התחל את משאבת הזרימה ואת משאבת המתח שוב כדי להחיל את העומס המודינמי על הדגימות האחרות עד הקציר.
   2. לאסוף מדיום מן המאגרים הבינוניים לניתוח ייצור ציטוקינים paracrine באמצעות ELISA.
2. יחידות זרימה מניתקות ומבנה צינורי קציר. סעיף על פי ערכת החיתוך הרצויה. חלקים של המבנה ניתן לאחסן ב 4 °C (לאחר 15 דקות קיבעון ב 3.7% פורמלדהיד ו 3 x 5 דקות כביסה PBS) או -30 °C (לאחר הצמד הקפאה בחנקן נוזלי) עד ניתוח נוסף.
3. נקה את רכיבי הביו-רה-קטור והמשאבה. בנוסף, שיטת הניקוי המומלצת לפריט מוזכרת בטבלת החומרים.
   1. נקה את מסנני אוויר הגומי עם 70% אתנול. היזהר מאוד לא להטות את המסנן הפנימי!
   2. לאסוף את כל הרכיבים הנפרדים: צינורות בינוניים, מאגרים בינוניים, צינורות זכוכית, תקעים Luer זכר ומנעולי Luer הנשי, כובעי Luer לבן, צינורות לחץ, גביעי האף, סיליקון O-טבעות, תותבות מתאם, מחליקי זרימה (למעט משאבות, יחידות נוזלים, מסנני אוויר גומי, בסיס bioreactor), ולשטוף במי ברז זורמים.
   3. מניחים את O/N ב-0.1% נתרן דודצילספט במים דה-יונים.
      הערה: אין להשתמש במים אולטרה-טעם מכיוון שהחלקים עשויים להחליד.
   4. יש לשטוף במי ברז ובסבון לשטיפת כלים.
   5. לטבול במים deionized, ואחריו 70% אתנול פעמיים, ואחריו מים deionized.
   6. מניחים את כל החומרים בנפרד על רקמות נייר ולתת להם להתייבש. השתמש באוויר לחוץ כדי לייבש צינורות.
   7. נקו את כל החומרים שאינם ניתנים להפעלה אוטומטית עם רקמת נייר ספוגה ב-70% אתנול. זה כולל את מסנן אוויר הגומי (יש לזכור כי מסנן האוויר צריך להישאר יבש) ואת בסיס bioreactor (מפוח טפלון וצילינדר פנאומטי).
   8. תכלול אוטומטית את רכיבי התא הנוזלי (כולל טבעת הסיליקון), הצינורות הבינוניים, המאגרים הבינוניים (ללא מסנן אוויר הגומי), תקעים זכרים של לואר ומצמדי לואר נשיים, כובעי Luer לבנים, מהדקי צינור וציוד סטנדרטי (למשל, פינצטה, מספריים מהדקים)
   9. לשימוש נוח במהלך הניסויים הבאים, שלב את הרכיבים הנפרדים עבור תא נוזלי אחד שלם בקופסה הניתנת להפעלה אוטומטית.
4. הסר מים מהמאגר ההידראולי. נקי עם 70% אתנול, ואחריו מים דה-יוניים. תן לזה להתייבש. יש למלא במים דה-יאון וכמה טיפות של חומר חיטוי לשימור אמבט מים.
5. לאחסן את צינורות הזכוכית לתא תרבות הזרימה ב 70% אתנול.
6. מניחים את חרוזי ייבוש סיליקה לחים (מראה לבן) בתנור O /N ב 120 °C כדי לאפשר להם להתייבש (מראה כתום), ולאחסן בקבוקון אוויר הדוק.

תוצאות

bioreactor זה פותח כדי לחקור את ההשפעות הפרטניות והמשולבים של מתח גיסת ומתיחות מחזוריות על צמיחת רקמת כלי הדם ושיפוץ פיגומים ביו-חומרים תלת-ממדיים. העיצוב של הביו-ריאקטור מאפשר פולחן של עד שמונה מבני כלי דם בתנאי טעינה שונים(איור 1A). מבני כלי הדם ממוקמים בתא תרבות זרימה (

Discussion

הביו-ריאקטור המתואר כאן מאפשר הערכה שיטתית של תרומתו של האדם וההשפעות המשולבות של לחץ גזוז ומתיחות מחזוריות על דלקת והתחדשות רקמות בפיגומים צינוריים הניתנים לשחזור. גישה זו מאפשרת גם לבצע מגוון רחב של ניתוחים על מבנים וסקולריים, כפי שמדגים בסעיף התוצאות הייצוגיות. תוצאות אלה מראות את ההש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding