Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolün amacı, kesme stresi ve döngüsel esnemenin birleşmesini sağlayan bir biyoreaktör kullanarak, malzeme güdümlü doku yenilenmesini araştırmak için tübüler elektrospun iskelelerinde insan makrofajları ve miyofibroblastların dinamik bir ortak kültürünü yürütmektir.

Özet

Resorbe edilebilir biyomalzemelerin doğrudan vücutta yenilenmeyi teşvik etmek için kullanılması, çevirisel açıdan çekici bir stratejidir. Bu tür malzemeler implantasyon üzerine enflamatuar bir yanıta neden olur, bu da malzemenin daha sonra emilmesinin ve yeni dokunun yenilenmesinin sürücüsüdür. Yerinde doku mühendisliği olarak da bilinen bu strateji, doku mühendisliği vasküler greftler gibi kardiyovasküler yedekler elde etmek için izlenmiştir. Hem enflamatuar hem de rejeneratif süreçler, iskeledeki lokal biyomekanik ipuçları (yani, esneme ve kesme stresi) ile belirlenir. Burada, borulu bir iskelede streç ve kesme stresinin ayrıştırılmasını benzersiz bir şekilde sağlayan özel olarak geliştirilmiş bir biyoreaktörün kullanımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu, insan makrofajları ve miyofibroblastları kullanarak dinamik bir ortak kültür deneyine dayanarak gösterdiğimiz iyi kontrol edilmiş mekanik yüklerin etkisi altında tübüler iskelelerin enflamatuar ve rejeneratif kapasitesinin sistematik ve standart olarak değerlendirilmesine izin verir. Bu yaklaşımdaki temel pratik adımlar (biyoreaktörün inşası ve kurulması, iskelelerin ve hücre tohumlamanın hazırlanması, streç ve kesme akışının uygulanması ve bakımı ve analiz için numune hasadı) ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Giriş

Kardiyovasküler doku mühendisliği (TE),1,2,3,4hastalarının büyük kohortları için yetersiz olan şu anda kullanılan kalıcı kardiyovasküler protezlere (örneğin, vasküler greftler, kalp kapak değiştirmeleri) alternatif bir tedavi seçeneği olarak takip edilmektedir. Çok aranan uygulamalar arasında doku mühendisliği yapılmış vasküler greftler (TEVG'ler) 5,6 ve kalp kapakçıkları (TEHV' ler)7,8bulunur. Çoğu zaman, kardiyovasküler TE ....

Protokol

Bu protokolde açıklanan çalışmalarda periferik kan buffy coats'dan izole edilmiş primer insan makrofajları ve koroner by-pass ameliyatından sonra saphenous damardan izole edilmiş insan miyofibroblastlarıkullanılmıştır 44. Buffy paltolar, Sanquin Araştırma Kurumsal Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylanan yazılı bilgilendirilmiş onay sağlayan sağlıklı, anonimleştirilmiş gönüllülerden elde edildi. İnsan vena saphena hücrelerinin (HCSC) kullanımı, Hollanda'daki Tıp Toplulukları Federasyonu (FMWV) tarafından geliştirilen "İnsan Dokusunun Kod Uygun İkincil Kullanımına" uygundu.

1. Biyoreaktör Kurmadan Önce Genel Hazırlıklar....

Sonuçlar

Bu biyoreaktör, 3D biyomalzeme iskelelerinde kesme stresi ve döngüsel esnemenin vasküler doku büyümesi ve yeniden şekillendirilmesi üzerindeki bireysel ve kombine etkilerini incelemek için geliştirilmiştir. Biyoreaktörün tasarımı, çeşitli yükleme koşullarında sekiz vasküler yapının kült örüldürülmesine izin verir (Şekil 1A). Vasküler yapılar, hem çevresel streç hem de WSS'nin bağımsız olarak kontrol edilebildiği bir akış kültürü odasına

Tartışmalar

Burada açıklanan biyoreaktör, borulu rezonanslı iskelelerde kesme stresi ve döngüsel esnemenin iltihaplanma ve doku yenilenmesi üzerindeki bireysel ve kombine etkilerinin sistematik olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda temsili sonuçlar bölümünde de örneklendirildiği gibi damar yapıları üzerinde çok çeşitli analizler yapılmasına olanak sağlamaktadır. Bu sonuçlar, farklı hemodinamik yükleme rejimlerinin (yani, farklı kesme ve esneme kombinasyonlarının) TEVG yapısın.......

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, LSH 2Treat programının (436001003) ve Hollanda Böbrek Vakfı'nın (14a2d507) bir parçası olarak ZonMw tarafından finansal olarak desteklenmektedir. N.A.K. Avrupa Araştırma Konseyi'nin (851960) desteğini kabul eder. Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (024.003.013) tarafından finanse edilen YerÇekim Programı "Materyal Odaklı Rejenerasyon"u minnetle kabul ediyoruz.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)Gibco12491-015cell culture medium for fibroblasts
Aqua StabilJulabo8940012prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogenSigmaF8630to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombinSigmaT4648to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
CentrifugeEppendorf5804to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"AlmedicP-422clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubatorsSanyoMCO-170AIC-PEfor cell culturing
Compressed air reservoirFestoCRVZS-5smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretchesMatlabR2017. The Mathworks, Natick, MAcalculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition boardNational InstrumentsBNC-2090data processing in between amplifier system and computer
EthanolVWRVWRK4096-9005to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)Greiner758087cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushingCustom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technologyn.a.flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipetAssistantHE40567002apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamberCuston made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technologyn.a.part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMaxGibco35050061cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed cameraMotionScopeM-5to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lensNikonJAA616ABto monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clipibidi GmbH10821block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambersCustom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technologyn.a.to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beadsibidi GmbH10902set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)Swann Morton0301; 0933to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW SoftwareNational Instrumentsversion 2018to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV lightLabconco302310001to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishesGreiner664-160for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)SigmaA8960cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500ZeissSchott AGto aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer capsibidi GmbHvarious, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)PEEKEL instruments B.V.n.a.to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holdersibidi GmbH10974medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameterRubber BV1805to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio SoftwareIdtvision2.15.00to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)BD Microlance301700together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driverAdson2429218to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissuesKleenex38044001for cleaning of the equipment with 70% ethanol
ParafilmSigmaP7793-1EAquick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)LonzaDE17-602Ecell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)SigmaP4417-100TABfor storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw capsGreiner206202to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinderFestoAEVC-20-10-I-Pto actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlandsn.a.produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technologyn.a.to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducerBDTC-XX and P 10 EZthe air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensorFestoMPPES-3-1/8-2-010, 159596provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)GibcoA1049101cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)Eppendorf30120086multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%Sigma5030Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.  
Silicone O-ringsTechnirub1250Sto prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)Rubber BV1805to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)Falcon352095multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needleEthicon, Johnson&JohnsonEH7404HProlene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)B. Braun Melsungen AG2057932to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)Satorius17597-Kto filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter capNunc178983to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter capNunc156499to culture static control samples
Teflon bellowCustom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technologyn.a.to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)PolarWare15-248for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
TweezersWironit4910sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure waterStakpureOmniapure UV 18200002to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV lightPhilipsTUV 30W/G30 T8for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding

Referanslar

  1. Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, 119-139 (2009).
  2. Huygens, S. A., et al.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

M hendislikSay 166In situ doku m hendisli ikardiyovask lerdoku m hendisli i vask ler greftler TEVGmakrofajmiyofibroblastortak k lt rgerinimkesme stresihemodinamikiskelein vitrobiyomekanik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır