ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

Summary

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

Abstract

קולטנים וחלבוני אנזימים הם ביומולקולות חשובות הפועלים כמטרות מחייבות למולקולות קטנות ביו-אקטיביות. לכן, האימות המהיר והעולמי של אינטראקציות חלבון התרופה רצוי מאוד לא רק להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס היעילות הטיפולית, אלא גם להערכת מאפייני סמים, כגון ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה ורעילות (ADMET) לשימוש קליני. כאן, אנו מציגים אסטרטגיית תפוקה גבוהה מבוססת biosensor עבור ביופאנינג של פפטידים קצרים T7 פאג', כי ניתן להציג בקלות על capsid פאג'. ניתוח מאוחר יותר של רצפי חומצות האמינו של פפטידים המכילים קטעים קצרים, כמו "שרידים שבורים", של אתרי איגוד סמים באמצעות תוכניות bioinformatics בחבילת מגע ליגנד קולטן (RELIC), מוצג גם. על ידי יישום שיטה זו על שתי תרופות שאושרו קלינית, irinotecan אנטי גידול, ו oseltamivir נגד שפעת, התהליך המפורט לאיסוף רצפי פפטיד זיהוי סמים והדגשת האתרים מחייבי התרופה של חלבוני היעד מוסברים במאמר זה. האסטרטגיה המתוארת בזאת יכולה להיות מיושמת עבור כל מולקולות קטנות של עניין.

Introduction

זיהוי מטרות מחייבות תרופות הוא חיוני לפיתוח תרופות, כמו גם להבנת המנגנונים המולקולריים של מחלות. בפרט, קולטן וחלבוני אנזים הם המטרות המולקולריות החשובות ביותר של מולקולות קטנות ביו^{אקטיביות 1}. למרות לכידת זיקה היא טכניקה מבוססת היטב לזיהוי חלבונים מחייבי סמים², מגבלות טכניות, כגון מסיסות נמוכה של חלבונים, לעתים קרובות לעכב את האימות של מטרות סמים². והכי חשוב, המולקולות הקטנות משותק לאבד את מידת החופש הדרושה לעגינה ועלול להיות נגיש לאתרי קשירה הממוקמים פנימי על חלבוני יעד גדולים יותר. יתר על כן, חוסר יכולת לנתח תנאי התגבשות משותפת, ומגבלות בשל גודל מולקולרי לעתים קרובות לעכב את השימוש בקריסטלוגרפיה רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (NMR), וניתוחים ניסיוניים אחרים כגון לחקר אינטראקציות חלבון תרופה.

השימוש ב- Biopanning של תצוגת פאג 'T7 הוא דרך יעילה לקביעת אתר האיגוד בחלבונים לפיתיונות מולקולות קטנות³. בפרט, ספריית פפטיד אקראית שהוצגה על ידי T7 phage, אשר ניתן לבנות על ידי החדרת DNA סינתטי לתוך אתר רב שיבוט, יעיל. בהשוואה לספריית הפאג'ים T7 המציגה חלבונים, ניתן לתכנן בקלות את הפפטידים הקצרים שיוצגו על קפסיד הפאג ' T7 ללא הגבלות פיזיות, אשר יכול ליצור קשר סטרטי עם כל תרופה מולקולה קטנה קבוע על תמיכה מוצקה². יתר על כן, כניסתה של microbalance גביש קוורץ (QCM) biosensor לתוך פלטפורמת biopanning התצוגה T7 פאג מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלשות אך ספציפיות כאלה של פפטידים קצרים עם תרופות על ידי ניטור הירידה בתדר QCM^4,5. פאג' T7 מאוגד הוא התאושש ישירות על ידי הדבקת המארח Escherichia coli (BLT5615), ואת רצף ה-DNA של האזור המקודד את פפטיד שנבחרו זיקה מחסה סמים זיהוי קטעים קצרים נקבע. ניתוח עוקב של רצף חומצות האמינו של אוכלוסיית הפפטיד מספק מידע לגבי זיהוי סמים. ביישור זוגי של רצפי חומצות האמינו שניצלו ניתן להשתמש כדי לקבל מידע לגבי המטרה הביולוגית של התרופה בתוך פרוטאום נבחר. זיהוי תפוקה גבוה זה של שברי חלבון עם זיקה כלפי תרופה יכול לשמש כדי לשחזר באופן היוריסטי את האתר מחייב סמים באופן דומה לזה של שחזור חפץ עתיק מרסיסי חרס⁶. בפרט, גישה ייחודית זו יכולה להיות שימושית כאשר גישות פרוטאומיקה קונבנציונליות נכשלות.

כאן, אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת biosensor עבור ביופאנינג של T7 פאג מוצג פפטידים וניתוח bioinformatics עבור אימות היעד של המולקולות הקטנות. מעבר למגבלות טכניות על שיטות קונבנציונליות, אסטרטגיה זו מאפשרת זיהוי של אתרים מחייבי תרופות בחלבוני יעד עבור כל מולקולה קטנה בעלת עניין תחת הפרוטוקול הזהה.

Protocol

הערה: להלן השלבים להקרנת פאג'ים T7 זיהוי סמים באמצעות biosensor QCM ושחזור פאג'ים מוקרן באמצעות E. coli (BLT5615) זיהום. הפרוטוקולים לסינתזה של נגזרת של מולקולה קטנה היוצרת מונולייר בהרכבה עצמית (SAM) ולבניית ספריית פפטיד אקראית T7 פאג 'מוצג 15-mer ניתן למצוא במקום אחר^6,7.

1. הכנת שבב חיישן QCM

1. חבר שבב חיישן קרמיקה על המתנד של מנגנון QCM 27-MHz, ותקליט את התדר המהותי (Hz) בשלב האוויר לפני קיבוע מולקולה קטנה.
2. נתק את השבב ושחרר 20 μL של פתרון (1 מ"מ ב 70% אתנול) של נגזרת מולקולה קטנה היוצרת SAM על אלקטרודה הזהב של שבב החיישן באמצעות פיפטה.
   התראה: גביש שבב החיישן שבו אלקטרודה זהב (Au, 0.1 מ"מ עובי, 2.5 מ"מ i.d., 4.9 מ"מ 2 )^ממוקםדק מאוד ועלול להיסדק בקלות (SiO₂, 0.06 מ"מ עובי, 9 מ"מ i.d.). לפיכך, פיפטה בזהירות.
3. השאירו למשך שעה בטמפרטורת החדר (בסביבות 20 מעלות צלזיוס) בצלחת פטרי עם רקמה לחה ומוגן מפני אורות החדר.
4. לשטוף את משטח האלקטרודה בעדינות עם מים אולטרה סגולים; לאחר מכן, להסיר את טיפות המים על ידי נושבת אוויר עם מזרק או אבק אוויר.
5. הגדר את שבב החיישן עבור מנגנון QCM ותקליט את הירידה בתדירות בשלב האוויר כדי למדוד את כמות המולקולה הקטנה ששותקת.
   הערה: לפחות, 100 הרץ של תדר פנימי הכרחי עבור קיבוע מולקולה קטנה מוצלחת (1 הרץ משתקת 30 pg).

2. ביופאנינג של ספריית הפאג' T7 באמצעות ביוסנסור QCM (איור 1)

1. הגדר cuvette עם stirrer מגנטי ייעודי על biosensor QCM ויוצקים 8 מ"ל של מאגר התגובה (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) לתוך cuvette.
2. חבר את שבב חיישן QCM לתנין ומשוך את זרוע המתנד כדי לטבול את השבב לתוך החיץ מעורבב ב 1000 סל"ד.
3. התחל לנטר את תדר QCM במחשב האישי (PC) והמתן עד שהחיישן ישווה לכ- 3 הרץ/ דקה של סחף התדרים.
4. להזריק 8 μL של ספריית פאג T7 (1-2 × 10¹⁰ pfu / mL) לתוך cuvette (ריכוז סופי: 1-2 × 10⁷ pfu / mL) ולסמן את נקודת ההזרקה על החיישן.
5. לפקח על הפחתת התדר הנגרמת על ידי קשירה של פאג'ים T7 למולקולה הקטנה משותק על משטח אלקטרודה זהב במשך 10 דקות.
6. עצרו את צג התדר QCM, הוציאו את שבב החיישן מהמתנד, והסירו את החיץ על ידי ניפוח אוויר ו/או פתיל עם מגבונים.
7. שים את שבב החיישן לתוך צלחת פטרי לחה ושחרר את 20 μL של ההשעיה של E. coli (BLT5615) (OD₆₀₀ = 0.5 -1.0 לאחר רועד ב 37 מעלות צלזיוס על ידי הוספת IPTG ל 1 mM) תאים מארחים בשלב יומן אלקטרודה זהב.
8. סוגרים את המכסה של המנה ומכסים אותו בנייר אלומיניום כדי לחסום את האור.
9. דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות על מערבל microplate 96-היטב (1000-1500 סל"ד) לשיפור ההתאוששות של פאג'ים T7 מאוגדים.
10. לשחזר את 20 μL של הפתרון ולהשעות אותו לתוך 200 μL של מדיום LB.
    הערה: הדגימות שהושגו בשלב זה ניתן לשמר ב 4 מעלות צלזיוס בשבוע אחד.
11. הכן סדרת דילול של פתרון פאג 'לבידוד פלאק רצף DNA על פי ההליך הכללי המתואר בהוראות היצרן^8,9.
12. נגב את משטח האלקטרודה המוזהבת עם ספוגית כותנה ספוגה בתמיסת 1% נתרן דודקיל סולפט.
13. לשטוף את משטח הזהב עם מים אולטרה מים מבקבוק הכביסה ולאחר מכן להסיר טיפות מים על ידי נושבת אוויר עם מזרק או אבק אוויר.
14. טיפה 5 μL של פתרון פיראנה (Conc. H₂SO₄: 30% H₂O₂ = 3:1) על משטח הזהב ולהשאיר במשך 5 דקות.
15. לשטוף את משטח הזהב שוב עם מים ולאחר מכן יבש על ידי נושבת אוויר ו / או פתיל משם עם מגבונים.
16. חזור על שלבים 2.14 ו- 2.15.
    התראה: הכינו את פתרון הפיראנה מיד לפני השימוש. השתמש בנוזל זה בזהירות, שכן הוא חומצה חזקה מאוד. טיפול במשך יותר מ 5 דקות שוחק את שבב החיישן.

3. ניתוח ביואינפורמטיקה באמצעות קולטן ליגנד מגע (RELIC) חבילת תוכנית (איור 2)^10,11

1. בטל את ההזנה של תוכנית RELIC העצמאית במחשב עם מערכת הפעלה של MS Windows.
2. יישר את רצפי חומצות האמינו של זיקה לפפטידים של 15 מר שנבחרו באמצעות התרופה או נבחרו באופן אקראי מספריית האב הלא מסוננת בכל קובץ בתבנית טקסט (שם.txt).
3. הקלד את רצף חומצות האמינו של חלבונים בודדים או מרובים בכל קובץ טקסט בתבנית FASTA, או הורד את קבצי הטקסט של מסד הנתונים בפורמט FASTA מכל מסד נתונים של חלבונים (למשל UniProt (http://www.uniprot.org/) או DrugBank (https://www.drugbank.ca/).
4. מקם את קבצי הטקסט (וקבצי PDB עבור HETEROalign) בתיקיה הדרושה להפעלת כל תוכנית RELIC.
5. לחץ על קובץ ההפעלה (תוכנית.exe) עבור AADIV, מידע, מוטיב, התאמה, HETEROalign, FASTAcon ו- FASTAskan בתיקיה העצמאית כדי לפתוח את הגירסה האישית של FTN95.
6. הקלד את שם הקובץ המתאים, יחד עם הסיומת (שם.txt), בהודעת הפקודה כדי להפעיל כל תוכנית ולקבל את קובץ תבנית הטקסט הנדרש.
7. יצא את קובץ הטקסט שנוצר לתוכנת גיליון אלקטרוני (למשל, Excel) כדי ליצור התוויית תוכן מידע (INFO) או ציוני דמיון מצטברים שחושבו באמצעות BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign).
   הערה: שרת RELIC המקורי (http://relic.bio.anl.gov) אינו זמין עוד וכמה תוכניות RELIC עצמאיות שעובדות על מחשבים עם פלטפורמת Windows ניתן להשיג מהמחבר המתאים (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

תוצאות

התוצאות הייצוגיות של שתי תרופות שאושרו קלינית מוצגות באיור 3. Irinotecan (איור 3A), פרודרוג מסיס במים של קמפוטותצין טבעי המשמש לטיפול בסרטן המעי הגס מתקדם וסרטן ריאות תאים שאינם קטנים, מומר SN-38 בכבד, אשר מעכב topoisomerase אני בתאי סרטן¹². יתר על כן, תרכובת זו מעכבת ישירות אצטילכולין אסטראז (AChE)^13,14. באמצעות האסטרטגיה, 29 פפטידים שזיהו Iri משותק כמו SAM זוהה על ידי QCM biosensor מבוססי מחזור אחד biopanning subsets. יישור זוגי עוקב של 29 פפטידים ו- AChE הניב ציונים מרביים עבור Y121, Q225, F290, E327, H440 ו- Y442 והדגיש את החלק במבנה התלת מימדי. שאריות חומצות אמינו אלה היו עולות בקנה אחד עם אלה המרכיבים את האתר מחייב Iri של AChE. אותה תת-קבוצה של פפטידים זיהתה בהצלחה את E99, L100, L252, L305, I387 ו- V474 בקרבת השלישייה הקטליטית (S221, E353 ו- H467) ב- carboxylesterase (CE), מה שמצביע על כך שחומצות אמינו אלה יוצרות פיגום לזיהוי אירי במהלך דה-אסתריזציה של Iri^15. שאריות חומצות אמינו כאלה באתר הקטליטי לא ניתן לזהות ישירות באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן קונבנציונלי או ניתוח NMR, כמו תגובת האנזים מתקדם בצורה חלקה ואינו יוצר את קומפלקס סטטי יציב בתנאים ניסיוניים כלליים. לכן, כי זיהוי קומבינטורי של אתרי איגוד סמים של חלבונים מרובים, כולל אלה במתחמי הביניים אולי נוצר עם אנזימים במהלך תגובות מטבוליות עבור תרופה מסוימת, אפשרי באמצעות פפטידים שנבחרו זיקה שנקבעו עבור תרופה אחת.

איור 3B מראה את התוצאות האחרות שהושגו עבור oseltamivir (אוסל), תרופה נגד שפעת המופעלת oseltamivir קרבוקסילאט, אשר בתורו מעכב את neuraminidase (NA) של וירוס^{שפעת 16}. 27 הפפטידים שזיהו את אוסל מכסה את משטח אלקטרודה זהב שבב חיישן QCM בהצלחה זיהה את האתר מחייב אוסל ב NA¹⁶. אתר כריכה זה מורכב מלולאות פפטיד לא מובנות שעלולות לעבור תנועה דינמית בעת העגינה עם אוסל. הפפטידים המזהים את אוסל על קפסיד הפאג' T7 עשויים לחקות עגינה דינמית זו בעת קשירה לאוסל הקבוע על משטח האלקטרודה המוזהבת של שבב חיישן QCM. תופעות לוואי נוירופסיכיאטריות (NPAEs) זוהו בחולים צעירים עם שפעת, אשר השפעה על חולים עשויים להיות קשורים למחלה עצמה ולא לתרופה. מחקרים הראו כי אוסל מיוצא באופן פעיל ממערכת העצבים המרכזית (CNS) של מכרסמים באמצעות חלבון התנגדות multidrug (MDR) במחסום הדם - מוח (BBB)¹⁷. ואכן, אחד החלבונים של המעמד של MDR זה הראה ציון גבוה (העליון 5% מתוך 4,396 ב DrugBank 1.0 חלבון מסד נתונים¹⁸), בנוסף טרנספורטרים אחרים, אנזימים הקשורים נוירוטרנסמיטר, קולטנים, במחקר שלנו. המשמעות הפרמקולוגית של חלבונים אלה לגבי המראה של תופעות לוואי של אוסל נחקר.

עד כה זוהו בהצלחה שישה אתרי איגוד מולקולות קטנים בודדים ומרובים בחלבוני המטרה עבור שש תרופות מולקולות קטנות שמשתמשות באסטרטגיה שלנו (איור 4). עבור Brz2001 ו roxithromycin (RXM), אתרים זהים מחייבי סמים על חלבון היעד זוהו באמצעות בריכות שונות של פפטידים, המספרים ורצפי חומצות אמינו אשר השתנו לחלוטין^7,19. יתר על כן, בריכות פפטיד בודדות שהושגו עבור אירי, RXM ואוסל הובילו לזיהוי אתרי קשירה מרובים בחלבונים שונים עבור כל תרופה, כגון AChE ו- CE עבור Iri (איור 3A)²⁰, אנגיומוטין ו CYP3A4 עבור RXM^19,21, ו NA ו- MDR הקשורים חלבון עבור אוסל. מטרה מולקולרית לא ידועה זוהתה עבור תרכובת אנטי הגידול וקסורוביצ'ין (FANCF)²², ואת אנטי אנגיוגנית מקרולידים אנטי אנטיביוטי RXM (אנגיומוטין)¹⁹.

איור 1: ייצוג סכמטי של הביופאנינג מבוסס ה-QCM biosensor של ספריית הפפטיד המוצגת על-ידי פאג' T7. ספריית פאג' T7 המציגה פפטידים אקראיים מוזרקת לתוך ה- cuvette המכיל את החיץ (תחת ערבוב) שבו שבב ה- QCM biosensor שקוע והתדירות מיוצבת. לאחר ניטור הפחתת התדר עקב קשירה של פאג'ים T7 למולקולות קטנות משותק על פני אלקטרודה זהב של שבב החיישן, שבב החיישן מנותק מן המתנד. DNA מן פאג 'T7 מאוגד לאחר מכן התאושש ישירות לאחר המארח E. coli (BLT5615) זיהום. פאג'ים T7 וכתוצאה מכך מבודדים באמצעות היווצרות פלאק, ולבסוף, רצף חומצת האמינו של פפטיד בחר זיקה התרופה המוצג על קפסיד פאג T7 נקבע על פי שיטת התצוגה פאג 'הכללית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ייצוג סכמטי של ההערכה הכמותית של השוואת הרצף בין פפטידים שנבחרו על ידי סמים לבין חלבונים בודדים או מרובים. רצפי פפטיד שנבחרו על ידי תרופות מיושרים בהתאמה עם רצפי חומצות האמינו העיקריים של חלבונים בודדים ומרובים, והדמיון בכל 3-5 ערכות חומצות אמינו הוא הבקיע במצטבר באמצעות יישור pairwise על פי מטריצת BLOSUM62 שונה. העלילה או הדיאגרמה המתקבלות מציינות את השאריות או המנות המהוות אתר פוטנציאלי למחייב סמים בחלבון. ניתוח נוסף באמצעות תוכנית RELIC מתאימה מדגיש את אתר האיגוד במבנה התלת מימדי (אם קובץ PDB זמין) או מדרג חלבונים שלמים שהם אולי יעד האיגוד (תוכנית HETEROalign אינה זמינה כעת). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תוצאות מייצגות של איסוף פפטיד וניתוח ביואינפורמטיקה עוקב . (A)אירינוטקן (פרודרוג אנטי גידול, מעכב טופויסומראז I). אינטראקציית פאג' T7 הייתה במעקב במשך 10 דקות כירידה בתדירות QCM. הדנ"א של פאג' T7 המאוגד נמצא ורצף כדי לקבוע את רצף חומצות האמינו המתאים. רצפי חומצות האמינו של 29 פפטידים של 15 מר, שנאספו באמצעות תת-קבוצה של ביופאנינג במחזור אחד, הדגישו את חומצות האמינו המרכיבות את האתר המחייב Iri של AChE [PDB ID 1U65]. הערכה נוספת באמצעות אותם 29 פפטידים הדגישה את שאריות חומצות האמינו השכנות (שאריות פיגומים לביטול האסטריזציה) של השלישייה הקטליטית ב-CE, אנזים כבד הממיר את אירי ל-SN-38 (צורה פעילה) [PDB ID: 1K4Y]. ציוני הדמיון של 103 פפטידים שנבחרו באקראי מספריית האב הלא מסוננת^7,19 הופחתו מציונים אלה כדי להסיר הטיית ספרייה. נתונים אלה משוחזרים משופט 20, באישורו של אלסבייר. (ב) אוזלתמיביר (תרופה נגד שפעת). 27 הפפטידים המכילים חומצות אמינו מזהה אוסל הדגישו חלקים מופרעים של האתר מחייב אוסל עבור neuraminidase (NA) (אנזים וירוס) [PDB מזהה: 2HT7]. אימות גלובלי של דמיון רצף בין 27 פפטידים ו 4,396 חלבונים ב DrugBank^{1.0 18} גילה NA להיות בטווח העליון 5%, בנוסף חלבונים אנושיים המארח הקשורים הפונקציות של מערכת העצבים המרכזית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: סיכום המולקולות הקטנות, שהיעדים המחייבים שלהן זוהו באמצעות אסטרטגיה זו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כאן, אסטרטגיה עבור biopanning מבוסס QCM biosensor של פפטידים זיהוי סמים, ואחריו ניתוח bioinformatics לאימות אינטראקציות חלבון תרופתי באמצעות פפטידים מזוהים, הוצג. תכנון נגזרות המולקולות הקטנות לשיתוק על אלקטרודת הזהב של הביוסנסור הוא צעד חשוב, שכן המקשר שהוצג עלול לעכב את הכריכה והאיסוף של הפפטיד שמכיר בתרופה. כדי למנוע זאת, נגזרים עם עמדות שונות של המקשר הציג מוכנים²³. לחלופין, לשיתוק מולקולות קטנות הידרופוביות, שבב החיישן שקוע במים בתפזורת בצלחת פטרי 10 ס"מ, ותמיסת 20 μL של המולקולה הקטנה (10 מ"מ פתרון דימתיל סולפוקסיד) הוא ירד על אלקטרודה הזהב של biosensor, כדי לכסות את פני השטח שלה, דגירה במשך 5 דקות. זה מאפשר שמירה של תת מאה הרץ תדר מהותי של מולקולות קטנות, אשר מוחזק לפחות 10 דקות במהלך הביופאנינג. ואכן, באמצעות קיבוע כזה, הפפטידים שנבחרו על ידי אוסל הדגישו בבירור את האתר המחייב את אוסל ב- NA (איור 3).

פאג' T7 המשמש להכנת ספריית הפפטיד כאן מהונדס גנטית באמצעות קלטת NNK₁₅ המקודדת 32 קודונים לכל 20 חומצות האמינו הסטנדרטיות ומדחיקה את הופעתם של 2 קודונים עוצרים (UAA, UGA) ומגיחה רק UAG (איור 1)^6,7. זה חשוב להצגת פפטידים באורך מלא של 15 מר והגדלת המגוון של הספרייה. למערכת התצוגה T7 phage יש מגבלת תצוגה טכנית של 10⁷-10 9 פאג'ים T7. עם זאת, המגוון של ספריית פפטיד 15-mer הוא תיאורטית 20¹⁵ (3.27 × 10¹⁹); לפיכך, לא ניתן להשתמש בו לבניית ספריה מלאה. עם זאת, חיפוש דמיון או כרייה של מוטיבים שמורים מאפשרים זיהוי של חומצות האמינו המרכיבות את אתרי איגוד הסמים של חלבונים אפילו עם מגוון מוגבל זה של פפטידים בספרייה. בנוסף, 3-5 חומצות אמינו נמתח בתוך פפטיד הספרייה (שיעור המראה הוא בין 1/20³ ו 1/ 20⁵, אשר ניתן לממש באמצעות מערכת התצוגה פאג T7) מעורבים בזיהוי של תרופות מולקולה קטנה; לכן, התאמה של 100% של רצפי פפטיד עם רצפי חומצות אמינו 15-mer המהווים את האתר מחייב התרופה של חלבון היעד אינו נדרש. ואכן, כ-30 פפטידים שנבחרו על ידי זיקה הדגישו בהצלחה את האתר המחייב של חלבון היעד לכל תרופה שנבדקה (איור 4). לכן, המגוון של ספריית פאג 'T7 האב בשימוש (1.7 × 10⁷ pfu / mL) ניתן להשתמש כדי לשחזר באופן היוריסטי את האתר מחייב סמים.

בדרך כלל, 3-5 עותקים של פאג'ים T7 שהציגו רצפים זהים לאלה של רצפי חומצות אמינו 15-mer מחסה חומצות אמינו זיהוי סמים מתיחות הופיעו בתוך 16 לוחות מבודדים באופן שרירותי, המציין את ההצלחה של בחירת הזיקה תחת הפרוטוקול שלנו. הדבר מצביע על כך ש-18-30 רצפי פפטיד שונים לזיהוי סמים נאספים בתוך 96 הלוחות המבודדים (המספר משויך לפורמט המיקרופלאט), המזוהים לאחר מכן באמצעות רצף של הדנ"א והשגת רצף חומצות האמינו המתאים. באסטרטגיה הנוכחית, הזרקה של 8 μL של ספריית פאג T7 לתוך cuvette המכיל 8 מאגר מ"ל (דילול פי 1000 של הספרייה) מתאים להפחתת כריכה לא ספציפית של פאג'ים T7. כדי להגדיל את המגוון של פפטידים שנבחרו זיקה, חוזר על בחירת מחזור אחד מספר פעמים ושימוש 16 או 32 בידודים פלאק לכל הקרנה הוכיח להיות יעיל יותר מאשר בידוד מפתרון אחד בכל פעם. לדוגמה, כדי לאסוף ביעילות כ-30 פפטידים שנבחרו על-ידי זיקה ברצף שונה, נערכו 3-6 סטים של בחירת מחזור אחד, 16 או 32 לוחות בודדו בכל ניסוי. מראה של רצפים זהים בכל 16 או 32 לוחות פאג ' T7 מסומנים זיהוי מקרי של רקע או עלול זיהום כמו carryover. לעומת זאת, היעדר פאג'ים T7 עם אותו רצף או מראה של פאג'ים T7 רבים עם פפטידים קצרים יותר מאשר אורך 15-mer מציין כי פאג'ים T7 באוכלוסייה לא במיוחד הופיעו עם הסתברות גבוהה. כמו הפחתת תדר QCM מתרחשת באותה מידה גם במקרים כאלה, ההצלחה של הבחירה צריכה להיות מוערכת באופן מקיף על ידי רצף ה- DNA של פאג T7 מבודד, ואחריו ניתוח bioinformatics של רצפי חומצות אמינו של פפטידים. יתר על כן, בניגוד לפרוטוקול התצוגה הקונבנציונלי T7 פאג ', סיבובים חוזרים של בחירה הוא פחות יעיל, כמו וריאציה ומספר פאג'ים T7 הם קטנים ואינם מרוכזים גם לאחר חזרה על הגברה וקטעי בחירה²³.

חשוב לציין, שיטה זו ישימה לכריית אתרים קטנים המחייבים מולקולות בפרוטומים של בני אדם, וירוסים פתוגניים ואפילו צמחים. מעניין, אורך התצוגה הקצרה אולי לא מובנה של פפטידים על קפסיד פאג T7 יכול לחקות את הדינמיקה המולקולרית של פפטידים של חלבונים במהלך עגינה עם מולקולה קטנה; פעולה זו יכולה לשקף איגוד דינאמי²⁴. מעבר למגבלות הטכניות של שיטות קונבנציונליות, אסטרטגיה זו, החלה על פרוטוקולים זהים למולקולות קטנות, עשויה להרחיב את הפרוטום הניתן לתרופה, כמו גם לספק צפיפות רבה יותר לגבי ניתוח אינטראקציה בין חלבונים תרופתיים.

יש לשקול מגבלות טכניות מסוימות של גישה זו. סינתזה אורגנית נחוצה לשיתוק מולקולה קטנה על פני השטח של אלקטרודה זהב של שבב biosensor. עבור מי שאינם מומחים בכימיה אורגנית, ריאגנטים מסוימים של קיבוע זמינים מסחרית כדי לתקן באופן מכני את המולקולה הקטנה על ידי צימוד. יתר על כן, חלקים מסוימים שטויות של פפטידים עלול לגרום לגילוי של חלק של החלבון לא רלוונטי עבור עגינה סמים כמו חיובי כוזב. זה מתאים באופן אמפירי לתחומים עשירים בגיליון בטא או לאוצין עשירים בשאריות לאוצין או ואלין, המקודדים על ידי יותר קודונים מאשר חומצות אמינו סטנדרטיות אחרות, כאשר עותקים של פאג 'T7 מיוצרים. שליטה באורך פפטיד הספריה עשויה לשלוט במופע של תוצאות חיוביות שגויות. לעומת זאת, ייתכנו מקרים שבהם שאריות חומצות אמינו באתר מחייב הסמים המעורבים בעגינה, כפי שהוכח באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן או ניתוח NMR, אינם מזוהים. זה עשוי להיפתר על ידי איסוף מספר גדול יותר של פפטידים זיהוי סמים או שינוי הכיוון של תיקון של מולקולות קטנות על אלקטרודה זהב.

אינטראקציות רבות של חלבונים תרופתיים הקשורות להשפעות העיקריות והמשניות של השימוש בסמים עדיין עשויות להיות בלתי מזוהות בפרוטאום; בנוסף, אנזימים ומשגרים האחראים לספיגת תרופות, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה ורעילות, עשויים גם הם להיות עדיין בלתי מזוהים. חלבון מחייב לא תמיד אחראי על ביואקטיביות של תרופה. לכן, שילוב של מידע אחר מן מבחנים ביולוגיים ישפר את הזיהוי של מטרות סמים חיוניים האחראים על ההשפעות העיקריות והתופעות השליליות של תרופות. התאמות נוספות של טכניקה תמציתית זו יגדילו את המעשיות והתפוקה לכריית אתרי מחייבי החלבון של מגוון רחב של תרופות מולקולות קטנות. השיטה המוצגת בזאת תתרום במידה רבה לא רק לביצוע מחקרים בסיסיים בתחומים הקשורים, אלא גם להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס היעילות הטיפולית או השפעות ביולוגיות אחרות של תרופות בשימוש קליני.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFFINIXQN	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCM2008-STKIT	Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC
AADIV	Northeastern University (Lee Makowski)	AADIV.exe	Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.
Ceramic Sensor Chip	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMST27C	4 sensor chips/package
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
Ethanol	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	09-0850
FASTAcon	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAcon.exe	Identifies proteins from a population with short consensus sequences.
FASTAskan	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAskan.exe	Lists proteins with high similarity to a peptide population.
Immiblization kit for AFFINIX	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMIMKT	SAM reagent and amine coupling reagent
INFO	Northeastern University (Lee Makowski)	INFO.exe	Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).
Liquid LB medium	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	L3522	Autoclave for 20 min
MATCH	Northeastern University (Lee Makowski)	MATCH.exe	Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length).
MOTIF1	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF1.exe	Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.
MOTIF2	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF2.exe	Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.
NaCl	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	S3014
Receptor ligand contacts (RELIC)	Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA)	https://www.relic.anl.gov	Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)
Tris	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	252859