Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

Riepilogo

Questo studio mirava a presentare una strategia per identificare le interazioni farmaco-peptidico. La strategia prevede la biopanning di peptidi corti che riconoscono farmaci basati su un biosensore QCM (Quartz-Crystal Microbalance), seguito da un'analisi bioinformatica per valutare quantitativamente le informazioni ottenute per il riconoscimento del farmaco e l'annotazione dei siti di legame farmacologico sulle proteine.

Abstract

I recettori e le proteine enzimatiche sono importanti biomolecole che fungono da bersagli vincolanti per piccole molecole bioattive. Pertanto, la convalida rapida e globale delle interazioni farmaco-proteina è altamente auspicabile non solo per comprendere i meccanismi molecolari alla base dell'efficacia terapeutica, ma anche per valutare le caratteristiche del farmaco, come adsorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicità (ADMET) per uso clinico. Qui, presentiamo una strategia ad alta produttività basata su biosensore per la biopanning di peptidi corti visualizzati dal fago T7 che possono essere facilmente visualizzati sul capsid del fago. Viene anche mostrata la successiva analisi delle sequenze di amminoacidi dei peptidi contenenti brevi segmenti, come "reliquie rotte", dei siti di legame farmacologico che utilizzano programmi di bioinformatica nella suite di contatto con ligando recettore (RELIC). Applicando questo metodo a due farmaci clinicamente approvati, un irinotecan antitumoro e un oseltamivir anti-influenzale, il processo dettagliato per la raccolta delle sequenze peptidiche che riconoscono i farmaci e l'evidenziazione dei siti di legame farmacologico delle proteine bersaglio sono spiegati in questo documento. La strategia descritta nel presente documento può essere applicata per qualsiasi piccola molecola di interesse.

Introduzione

L'identificazione di obiettivi vincolanti per i farmaci è essenziale per lo sviluppo di farmaci e per la comprensione dei meccanismi molecolari delle malattie. In particolare, i recettori e le proteine enzimatiche sono i più importanti bersagli molecolari delle piccole molecole^{bioattive 1}. Sebbene la cattura dell'affinità sia una tecnica ben consolidata per identificare le proteine leganti^{farmaci 2}, i limiti tecnici, come la bassa solubilità delle proteine, spesso ostacolano la convalida degli obiettivi del farmaco². Ancora più importante, le piccole molecole immobilizzate perdono il grado di libertà necessario per l'attracco e possono essere inaccessibili ai siti di legame situati internamente su proteine bersaglio più grandi. Inoltre, il misfolding proteico, l'incapacità di analizzare le condizioni di co-cristallizzazione e le limitazioni dovute alle dimensioni molecolari spesso ostacolano l'uso della cristallografia a raggi X, della risonanza magnetica nucleare (NMR) e di altre analisi sperimentali per lo studio delle interazioni farmaco-proteina.

L'uso della biopanning del display del fago T7 è un modo efficiente per determinare il sito di legame sulle proteine per le esche di piccole molecole³. In particolare, una libreria peptidica casuale visualizzata dal fago T7, che può essere costruita inserendo DNA sintetico in un sito multi-clonazione, è efficace. Rispetto alla libreria di fago T7 che mostra proteine, i peptidi corti possono essere facilmente progettati per essere visualizzati sul capsid del fago T7 senza restrizioni fisiche, che può stericamente contatto con qualsiasi farmaco di piccola molecola fissato su un supporto solido². Inoltre, l'introduzione di un biosensore qcm (quartz-crystal microbalance) nella piattaforma di biopanning del display del fago T7 consente l'identificazione di interazioni così deboli ma specifiche di peptidi corti con farmaci monitorando la riduzione della frequenza QCM^4,5. Il fago T7 legato viene quindi recuperato direttamente infettando l'ospite Escherichia coli (BLT5615), e viene determinata la sequenza di DNA della regione che codifica il peptide selezionato dall'affinità che ospita brevi segmenti che riconoscono i farmaci. L'analisi successiva della sequenza amminoacidica della popolazione peptidica fornisce informazioni sul riconoscimento dei farmaci. Nel silico l'allineamento a coppie delle sequenze di amminoacidi salvati può essere utilizzato per ottenere informazioni sul bersaglio biologico del farmaco all'interno di un proteoma selezionato. Questa identificazione ad alta produttività di frammenti proteici con affinità verso un farmaco può essere utilizzata per ricostruire euristicamente il sito di legame farmacologico in modo simile a quello della ricostruzione di un antico manufatto da frammenti di ceramica⁶. In particolare, questo approccio unico può essere utile quando gli approcci proteomici convenzionali falliscono.

Qui presentiamo una strategia basata sul biosensore per la biopanning dei peptidi visualizzati dal fago T7 e l'analisi bioinformatica per la convalida target delle piccole molecole. Al di là delle limitazioni tecniche sui metodi convenzionali, questa strategia consente l'identificazione di siti di legame farmacologico sulle proteine bersaglio per qualsiasi piccola molecola di interesse secondo lo stesso protocollo.

Protocollo

NOTA: I seguenti sono i passaggi per lo screening dei fagi T7 che riconoscono i farmaci utilizzando un biosensore QCM e il recupero dei fagi schermati tramite l'infezione da E. coli (BLT5615). I protocolli per la sintesi di un derivato di una piccola molecola che forma un monostrato auto-assemblato (SAM) e per la costruzione della libreria peptidica casuale da 15 anni visualizzata dal fago T7 possono essere trovati altrove^6,7.

1. Preparazione del chip del sensore QCM

1. Attaccare un chip del sensore ceramico sull'oscillatore di un apparato QCM a 27 MHz e registrare la frequenza intrinseca (Hz) nella fase dell'aria prima dell'immobilizzazione di piccole molecole.
2. Staccare il chip e far cadere 20 μL di una soluzione (1 mM in etanolo al 70%) di una piccola derivata molecolare che forma SAM sull'elettrodo doo del chip del sensore utilizzando una pipetta.
   ATTENZIONE: Il cristallo del chip del sensore in cui si trova l'elettrodo d'oro (Au, 0,1 mm di spessore, 2,5 mm d.d., 4,9 mm²⁾è estremamente sottile e può rompersi facilmente (SiO₂, 0,06 mm di spessore, 9 mm i.d.). Quindi, pipetta con attenzione.
3. Lasciare per 1 h a temperatura ambiente (circa 20 °C) in una piastra di Petri con tessuto inumidito e schermata dalle luci della stanza.
4. Lavare delicatamente la superficie dell'elettrodo con acqua ultrapura; quindi, rimuovere le gocce d'acqua soffiando aria con una siringa o uno spolverino d'aria.
5. Impostare il chip del sensore per l'apparato QCM e registrare la riduzione della frequenza nella fase dell'aria per misurare la quantità della piccola molecola che è stata immobilizzata.
   NOTA: Almeno, 100 Hz di frequenza intrinseca sono necessari per l'immobilizzazione di piccole molecole di successo (1 Hz immobilizza 30 pg).

2. Biopanning della libreria di fago T7 utilizzando un biosensore QCM (Figura 1)

1. Impostare una cuvetta con un agitatore magnetico dedicato sul biosensore QCM e versare 8 mL del tampone di reazione (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) nella cuvetta.
2. Collegare il chip del sensore QCM all'oscillatore e tirare giù il braccio dell'oscillatore per immergere il chip nel tampone che viene mescolato a 1000 giri/min.
3. Iniziare a monitorare la frequenza QCM sul personal computer (PC) e attendere che il sensorgram equilibra a circa 3 Hz/min della deriva di frequenza.
4. Iniettare 8 μL di una libreria di fagi T7 (1-2 ×^{10 10} pfu/mL) nella cuvetta (concentrazione finale: 1-2 × 10⁷ pfu/mL) e contrassegnare il punto di iniezione sul sensore.
5. Monitorare la riduzione di frequenza causata dal legame dei fagi T7 alla piccola molecola immobilizzata sulla superficie dell'elettrodo d'oro per 10 minuti.
6. Arrestare il monitor di frequenza QCM, rimuovere il chip del sensore dall'oscillatore e rimuovere il buffer soffiando aria e/o assorbendo con salviette.
7. Mettere il chip del sensore in una piastra di Petri umida e far cadere i 20 μL della sospensione di E. coli (BLT5615) (OD₆₀₀ = 0,5-1,0 dopo aver tremato a 37 °C aggiungendo IPTG a 1 mM) cellule ospiti nella fase di log sull'elettrodo d'oro.
8. Chiudere il coperchio del piatto e coprirlo con un foglio di alluminio per bloccare la luce.
9. Incubare il piatto a 37 °C per 30 minuti su un miscelatore di micropiatte da 96 pozzetti (1000-1500 giri/min) per migliorare il recupero dei fagi T7 legati.
10. Recuperare i 20 μL della soluzione e sospenderla in 200 μL di mezzo LB.
    NOTA: I campioni ottenuti in questa fase possono essere conservati a 4 °C di una settimana.
11. Preparare una serie di diluizione della soluzione di fago per l'isolamento della placca e il sequenziamento del DNA secondo la procedura generale descritta nelle^{istruzioni del produttore 8,9}.
12. Pulire la superficie dell'elettrodo dorato con un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione di solfato di dodecile di sodio all'1%.
13. Lavare la superficie urea con acqua ultrapura dalla bottiglia di lavaggio e quindi rimuovere le gocce d'acqua soffiando aria con una siringa o uno spolverino d'aria.
14. Far cadere 5 μL di soluzione di piranha (Conc. H₂SO₄: 30% H₂O₂ = 3:1) sulla superficie urea e lasciare per 5 min.
15. Lavare di nuovo la superficie urea con acqua e poi asciugare soffiando aria e /o assorbendo con salviette.
16. Ripetere i passaggi 2.14 e 2.15.
    ATTENZIONE: Preparare la soluzione di piranha immediatamente prima dell'uso. Utilizzare questo liquido con attenzione, in quanto è un acido molto forte. Il trattamento per più di 5 minuti erode il chip del sensore.

3. Analisi bioinformatica utilizzando la suite di programmi Relic (Receptor Ligand Contact) (Figura 2)^10,11

1. Decomprimere il programma RELIC autonomo su un PC con un sistema operativo MS Windows.
2. Allineare le sequenze di amminoacidi dell'affinità dei peptidi di 15 anni selezionata utilizzando il farmaco o selezionata casualmente dalla libreria padre non schermata in ogni file di formato di testo (nome.txt).
3. Digitare la sequenza di amminoacidi di proteine singole o multiple in ogni file di testo con formato FASTA oppure scaricare i file di testo del database in formato FASTA da qualsiasi database proteico (ad esempio UniProt (http://www.uniprot.org/) o DrugBank (https://www.drugbank.ca/).
4. Inserire i file di testo (e i file PDB per HETEROalign) nella cartella necessaria per l'esecuzione di ogni programma RELIC.
5. Fare clic sul file eseguibile (programma.exe) per AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon e FASTAskan nella cartella indipendente per aprire la versione personale di FTN95.
6. Digitare il nome file appropriato, insieme all'estensione (nome.txt), nel messaggio di comando per eseguire ogni programma e ottenere il file di formato di testo richiesto.
7. Esportare il file di testo risultante in un software per fogli di calcolo (ad esempio Excel) per generare un grafico del contenuto delle informazioni (INFO) o punteggi di somiglianza cumulativi calcolati utilizzando un BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign).
   NOTA: il server RELIC originale (http://relic.bio.anl.gov) non è più disponibile e alcuni programmi RELIC di tipo autonomo che funzionano su PC con una piattaforma Windows possono essere ottenuti dall'autore corrispondente (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

Risultati

I risultati rappresentativi di due farmaci clinicamente approvati sono riportati nella figura 3. L'irinotecan (Figura 3A), un profarmaco solubile in acqua di camptotecina naturale utilizzato per il trattamento del cancro del colon-retto avanzato e del cancro polmonare non a piccole cellule, viene convertito in SN-38 nel fegato, che inibisce la topoisomerasi I nelle cellule tumorali¹². Inoltre, questo composto inibisce direttamente l'acetilcolinesterasi (AChE)^13,14. Attraverso la strategia, 29 peptidi che riconoscevano Iri immobilizzato come SAM sono stati identificati da sottoinsiemi di biopanning a ciclo unico basati su biosensore QCM. Il successivo allineamento a coppie dei 29 peptidi e dell'AChE ha prodotto punteggi massimi per Y121, Q225, F290, E327, H440 e Y442 e ha evidenziato la porzione nella struttura tridimensionale. Questi residui di amminoacidi erano coerenti con quelli che covano il sito iri-legante di AChE. Lo stesso sottoinsieme di peptidi identificò con successo E99, L100, L252, L305, I387 e V474 nelle vicinanze della triade catalitica (S221, E353 e H467) in carbossilesterasi (CE), indicando che questi amminoacidi formano un'impalcatura per il riconoscimento Iri durante la de-esterificazione di Iri¹⁵. Tali residui di amminoacidi nel sito catalitico non possono essere identificati direttamente utilizzando la cristallografia a raggi X convenzionale o l'analisi NMR, poiché la reazione enzimatica procede senza intoppi e non forma il complesso statico stabilmente in condizioni sperimentali generali. Pertanto, il rilevamento combinatorio di siti di legame farmacologico di più proteine, comprese quelle nei complessi intermedi eventualmente formati con enzimi durante le reazioni metaboliche per un particolare farmaco, è possibile utilizzando i peptidi selezionati dall'affinità determinati per un farmaco.

La figura 3B mostra gli altri risultati ottenuti per l'oseltamivir (Osel), un farmaco antinfluenzale che viene attivato sull'oseltamivir carbossilato, che a sua volta inibisce la neuraminidasi (NA) del virus influenzale¹⁶. I 27 peptidi che hanno riconosciuto Osel che copre la superficie dell'elettrodo d'oro del chip del sensore QCM hanno rilevato con successo il sito di legame Osel in NA¹⁶. Questo sito di legame è costituito da anelli peptidici non strutturati che potenzialmente subiscono un movimento dinamico durante l'attracco con Osel. I peptidi che riconoscono l'Osel sul capsid del fago T7 potrebbero imitare questo docking dinamico quando si legano all'Osel fissato sulla superficie dell'elettrodo dorato del chip del sensore QCM. Eventi avversi neuropsichiatrici (NPAE) sono stati identificati in giovani pazienti con influenza, che effetto sui pazienti sono probabilmente correlati alla malattia stessa piuttosto che al farmaco. Gli studi hanno dimostrato che Osel viene attivamente esportato dal sistema nervoso centrale (SNC) dei roditori attraverso proteine multifarmaco-resistenza (MDR) nella barriera emato-encefalica (BBB)¹⁷. Infatti, una delle proteine della classe di questo MDR ha mostrato un punteggio elevato (top 5% su 4.396 nel database delle proteine DrugBank 1.0¹⁸), oltre ad altri trasportatori, enzimi correlati al neurotrasmettitore e recettori, nel nostro studio. Si sta indagando sul significato farmacologico di queste proteine per quanto riguarda la comparsa di effetti avversi dell'Osel.

Finora, siti di legame di piccole molecole singole e multiple sulle proteine bersaglio sono stati identificati con successo per sei piccoli farmaci molecolari che utilizzano la nostra strategia (Figura 4). Per Brz2001 e roxitromicina (RXM), sono stati identificati siti identici di legame farmacologico su una proteina bersaglio utilizzando diverse pozze di peptidi, i cui numeri e sequenze di amminoacidi variavano^{completamente 7,19}. Inoltre, le singole piscine peptidiche ottenute per Iri, RXM e Osel hanno portato all'identificazione di più siti di legame su proteine diverse per ogni farmaco, come AChE e CE per Iri(Figura 3A)^20,angiomotina e CYP3A4 per RXM^19,21e proteina associata a NA e MDR per Osel. È stato identificato un bersaglio molecolare sconosciuto per il composto antitumomico doxorubicina (FANCF)²²e l'antibiotico macrolide anti-angiogenico RXM (angiomotina)¹⁹.

Figura 1: Rappresentazione schematica della biopanning basata su biosensore QCM della libreria peptidica visualizzata dal fago T7. Una libreria di fago T7 che visualizza peptidi casuali viene iniettata nella cuvetta contenente il buffer (sotto agitazione) dove il chip biosensore QCM è immerso e la frequenza è stabilizzata. Dopo aver monitorato la riduzione della frequenza dovuta al legame dei fagi T7 a piccole molecole immobilizzate sulla superficie dell'elettrodo d'oro del chip del sensore, il chip del sensore viene staccato dall'oscillatore. Il DNA del fago T7 legato viene quindi recuperato direttamente dopo l'infezione dell'ospite E. coli (BLT5615). I fagi T7 risultanti sono isolati attraverso la formazione di placche e, infine, la sequenza di amminoacidi del peptide selezionato dall'affinità del farmaco visualizzato sul capsid del fago T7 è determinata in base al metodo generale di visualizzazione del fago. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione schematica della valutazione quantitativa del confronto di sequenza tra peptidi selezionati dal farmaco e proteine singole o multiple. Le sequenze peptidiche selezionate dal farmaco sono rispettivamente allineate con le sequenze primarie di amminoacidi di proteine singole e multiple, e la somiglianza in ogni set di amminoacidi 3-5 viene segnata cumulativamente tramite allineamento a coppie secondo una matrice BLOSUM62 modificata. Il grafico o il diagramma risultante indica i residui o le porzioni che costituiscono un potenziale sito di legame farmacologico sulla proteina. Ulteriori analisi utilizzando un programma RELIC appropriato evidenziano il sito di associazione sulla struttura tridimensionale (se è disponibile un file PDB) o classificano intere proteine che sono probabilmente la destinazione di associazione (il programma HETEROalign non è attualmente disponibile). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati rappresentativi della raccolta dei peptidi e successiva analisi bioinformatica. (A) Irinotecan (profarmaco antitumoro, topoisomerasi I inibitore). L'interazione del fago T7 è stata monitorata per 10 minuti come riduzione della frequenza QCM. Il DNA del fago T7 legato è stato recuperato e sequenziato per determinare la corrispondente sequenza di amminoacidi. Le sequenze di amminoacidi di 29 peptidi da 15 mer, raccolte utilizzando un sottoinsieme di biopanning a ciclo unico, hanno evidenziato gli amminoacidi che coendono il sito iri-legante di AChE [PDB ID 1U65]. Ulteriori valutazione utilizzando gli stessi 29 peptidi hanno evidenziato i residui di amminoacidi vicini (residui di impalcatura per la deesterificazione) della triade catalitica in CE, un enzima epatico che converte Iri in SN-38 (forma attiva) [PDB ID: 1K4Y]. Punteggi di somiglianza di 103 peptidi selezionati casualmente dalla libreria principale non schermata^{7,19 sono} stati sottratti da questi punteggi per rimuovere i pregiudizi della libreria. Queste cifre sono riprodotte dal ref. (B) Oseltamivir (farmaco antinfluenzale). I 27 peptidi contenenti amminoacidi che riconoscono osel hanno evidenziato porzioni disordinate del sito legante osel per la neuraminidasi (NA) (enzima virus) [PDB ID: 2HT7]. La convalida globale della somiglianza della sequenza tra 27 peptidi e 4.396 proteine in DrugBank 1.0¹⁸ ha rivelato che NA rientra nella gamma superiore del 5%, oltre alle proteine umane ospiti associate alle funzioni del sistema nervoso centrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sintesi delle piccole molecole, i cui obiettivi di legame sono stati identificati utilizzando questa strategia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui è stata presentata una strategia per la biopanning a base di biosensore QCM dei peptidi che riconoscono i farmaci, seguita da un'analisi bioinformatica per la convalida delle interazioni farmaco-proteina utilizzando i peptidi identificati. Progettare i derivati delle piccole molecole per l'immobilizzazione sull'elettrodo d'oro del biosensore è un passo importante, in quanto il linker introdotto può ostacolare il legame e la raccolta del peptide che riconosce il farmaco. Per evitare questo, vengono preparate derivate con diverse posizioni del linker introdotto²³. In alternativa, per immobilizzare piccole molecole idrofobiche, il chip del sensore viene immerso nell'acqua sfusa in una piastra di Petri di 10 cm e una soluzione da 20 μL della piccola molecola (soluzione da 10 mM nel solfossido di dimetile) viene lasciata cadere sull'elettrodo d'oro del biosensore, per coprirne la superficie, e incubata per 5 minuti. Ciò consente la ritenzione di una frequenza intrinseca sottocento hertz di piccole molecole, che viene trattenuta per almeno 10 minuti durante la biopanning. Infatti, utilizzando tale immobilizzazione, i peptidi selezionati per l'affinità di Osel hanno evidenziato chiaramente il sito di legame dell'Osel nella NA (Figura 3).

Il fago T7 utilizzato per preparare la libreria peptidica qui è geneticamente modificato utilizzando la cassetta NNK₁₅ che codifica 32 codoni per tutti i 20 amminoacidi standard e reprime l'emergere di 2 codoni stop (UAA, UGA) ed emerge solo UAG(Figura 1)^6,7. Questo è importante per visualizzare peptidi a figura intera di 15 anni e aumentare la diversità della libreria. Il sistema di visualizzazione del fago T7 ha un limite tecnico di visualizzazione di^{10 7}-10⁹ fagi T7. Tuttavia, la diversità della libreria peptidica di 15 anni è teoricamente di 20¹⁵ (3,27 × 10^19); pertanto, non può essere utilizzato per la costruzione completa della biblioteca. Tuttavia, la ricerca di somiglianza o l'estrazione di motivi conservati consente di rilevare gli amminoacidi che comprendono i siti di legame farmacologico delle proteine anche con questa limitata diversità di peptidi in biblioteca. Inoltre, 3-5 amminoacidi si estendono all'interno del peptide della libreria (il tasso di aspetto è compreso tra 1/20³ e 1/ 20⁵, che può essere realizzato utilizzando il sistema di visualizzazione del fago T7) sono coinvolti nel riconoscimento di farmaci di piccole molecole; pertanto, non è necessaria una corrispondenza al 100% delle sequenze peptidiche con sequenze di amminoacidi 15-mer che costituiscono il sito di legame farmacologico della proteina bersaglio. Infatti, circa 30 peptidi selezionati per affinità hanno evidenziato con successo il sito di legame della proteina bersaglio per ciascun farmaco testato (Figura 4). Pertanto, la diversità della libreria di fagi T7 madre utilizzata (1,7 × 10⁷ pfu/mL) può essere utilizzata per ricostruire euristicamente il sito di legame farmacologico.

Tipicamente, 3-5 copie di fagi T7 che mostravano le stesse sequenze di quelle delle sequenze di amminoacidi di 15 anni che ospitavano tratti di amminoacidi che riconoscevano farmaci emersero all'interno delle 16 placche arbitrariamente isolate, indicando il successo della selezione di affinità secondo il nostro protocollo. Ciò indica che 18-30 diverse sequenze peptidiche che riconoscono i farmaci vengono raccolte all'interno delle 96 placche isolate (il numero è associato al formato micropiatta), che vengono identificate successivamente utilizzando il sequenziamento del DNA e ottenendo la corrispondente sequenza di amminoacidi. Nella strategia attuale, l'iniezione di 8 μL della libreria di fago T7 nella cuvetta contenente tampone da 8 mL (diluizione di 1000 volte della libreria) è adatta a ridurre il legame non specifico dei fagi T7. Per aumentare la diversità dei peptidi selezionati dall'affinità, ripetere più volte la selezione a un ciclo e utilizzare 16 o 32 isolamenti della placca per screening si è rivelato più efficace dell'isolamento da una singola soluzione alla volta. Ad esempio, per raccogliere efficacemente circa 30 peptidi selezionati dall'affinità sequenziati in modo diverso, sono stati condotti 3-6 set di selezione a un ciclo, 16 o 32 placche sono state isolate in ogni esperimento. L'aspetto di sequenze identiche in tutte le placche di fago 16 o 32 T7 è indicato come rilevamento accidentale dello sfondo o potrebbe contaminazione come riporto. Al contrario, l'assenza di fagi T7 con la stessa sequenza o comparsa di molti fagi T7 con peptidi più corti rispetto alla lunghezza di 15-mer indica che i fagi T7 nella popolazione non sono emersi specificamente con alta probabilità. Poiché la riduzione della frequenza QCM avviene nella stessa misura anche in questi casi, il successo della selezione dovrebbe essere valutato in modo completo sequenziando il DNA del fago T7 isolato, seguito dall'analisi bioinformatica delle sequenze amminoacidiche dei peptidi. Inoltre, a differenza del protocollo di visualizzazione del fago T7 convenzionale, i cicli ripetuti di selezione sono meno efficaci, in quanto la variazione e il numero dei fagi T7 sono piccoli e non si concentrano anche dopo aver ripetuto le fasi di amplificazione e^{selezione 23.}

È importante sottolineare che questo metodo è applicabile per l'estrazione di piccoli siti di legame molecolare nei proteomi dell'uomo, virus patogeni e persino piante. È interessante notare che la breve lunghezza di visualizzazione possibilmente non strutturata dei peptidi sul capsid del fago T7 può imitare la dinamica molecolare dei peptidi delle proteine durante l'aggancio con una piccola molecola; questo può riflettere l'associazione^{dinamica 24}. Oltre ai limiti tecnici dei metodi convenzionali, questa strategia, applicabile a protocolli identici per piccole molecole, può espandere il proteoma farmaco-beneficio e fornire una maggiore granularità per quanto riguarda l'analisi dell'interazione farmaco-proteina.

Si dovrebbero prendere in considerazione alcune limitazioni tecniche di questo approccio. La sintesi organica è necessaria per l'immobilizzazione di piccole molecole sulla superficie dell'elettrodo d'oro del chip del biosensore. Per i non esperti di chimica organica, alcuni reagenti di immobilizzazione sono commercialmente disponibili per fissare meccanicamente la piccola molecola accoppiando. Inoltre, alcune porzioni senza senso dei peptidi potrebbero comportare il rilevamento di una porzione della proteina non rilevante per l'attracco dei farmaci come falsi positivi. Ciò corrisponde empiricamente a domini ricchi di beta-fogli o leucine ricchi di leucina o residui di valine, che sono codificati da più codoni rispetto ad altri amminoacidi standard, quando vengono prodotte copie del fago T7. Il controllo della lunghezza peptidica della libreria potrebbe controllare il verificarsi di falsi positivi. Al contrario, ci possono essere casi in cui non vengono rilevati residui di amminoacidi nel sito di legame farmacologico coinvolti nell'attracco, come dimostrato utilizzando la cristallografia a raggi X o l'analisi NMR. Questo può essere risolto raccogliendo un maggior numero di peptidi che riconoscono il farmaco o cambiando la direzione di fissaggio delle piccole molecole sull'elettrodo d'oro.

Molte interazioni farmaco-proteina correlate ai principali e secondari effetti del consumo di stupefacenti possono ancora non essere identificate nel proteoma; inoltre, anche gli enzimi e i trasportatori responsabili dell'assorbimento, della distribuzione, del metabolismo, dell'escrezione e della tossicità dei farmaci potrebbero non essere ancora identificati. Il legame proteico non è sempre responsabile della bioattività di un farmaco. Pertanto, una combinazione di altre informazioni provenienti da saggi biologici migliorerà l'identificazione degli obiettivi essenziali in materia di farmaci responsabili degli effetti principali e negativi dei farmaci. Ulteriori adattamenti di questa tecnica concisa aumenteranno la praticità e la produttività per l'estrazione dei siti di legame proteico di una vasta gamma di farmaci a piccole molecole. Il metodo qui presentato contribuirà in gran parte non solo a condurre ricerche di base nei campi correlati, ma chiarirà anche i meccanismi molecolari alla base dell'efficacia terapeutica o di altri effetti biologici dei farmaci nell'uso clinico.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFFINIXQN	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCM2008-STKIT	Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC
AADIV	Northeastern University (Lee Makowski)	AADIV.exe	Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.
Ceramic Sensor Chip	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMST27C	4 sensor chips/package
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
Ethanol	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	09-0850
FASTAcon	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAcon.exe	Identifies proteins from a population with short consensus sequences.
FASTAskan	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAskan.exe	Lists proteins with high similarity to a peptide population.
Immiblization kit for AFFINIX	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMIMKT	SAM reagent and amine coupling reagent
INFO	Northeastern University (Lee Makowski)	INFO.exe	Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).
Liquid LB medium	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	L3522	Autoclave for 20 min
MATCH	Northeastern University (Lee Makowski)	MATCH.exe	Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length).
MOTIF1	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF1.exe	Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.
MOTIF2	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF2.exe	Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.
NaCl	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	S3014
Receptor ligand contacts (RELIC)	Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA)	https://www.relic.anl.gov	Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)
Tris	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	252859