Stratégie d'analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines

Résumé

Cette étude visait à présenter une stratégie pour identifier les interactions médicament-peptide. La stratégie consiste à biopanner les peptides courts reconnaissant les médicaments à partir d'un biocapteur de microbalance quartz-cristal (QCM), suivi d'une analyse bioinformatique pour évaluer quantitativement les informations obtenues pour la reconnaissance et l'annotation des sites de liaison médicamenteux sur les protéines.

Résumé

Les récepteurs et les protéines enzymatiques sont d'importantes biomolécules qui agissent comme cibles contraignantes pour les petites molécules bioactives. Ainsi, la validation rapide et globale des interactions médicament-protéine est hautement souhaitable non seulement pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'efficacité thérapeutique, mais aussi pour évaluer les caractéristiques des médicaments, telles que l'adsorption, la distribution, le métabolisme, l'excrétion et la toxicité (ADMET) à des fins cliniques. Ici, nous présentons une stratégie de débit élevé basée sur le biocapteur pour le biopannage des peptides courts t7 phage-affichés qui peuvent être facilement affichés sur le capside de phage. L'analyse ultérieure des séquences d'acides aminés des peptides contenant de courts segments, comme « reliques brisées », des sites de liaison médicamenteux utilisant des programmes de bioinformatique dans la suite de contact ligand récepteur (RELIC), est également montrée. En appliquant cette méthode à deux médicaments cliniquement approuvés, un irinotecan anti-tumoral et un oseltamivir antigri grippe, le processus détaillé de collecte des séquences peptidiques reconnaissant les médicaments et mettant en évidence les sites de liaison médicamenteuse des protéines cibles sont expliqués dans cet article. La stratégie décrite ci-après peut être appliquée à toutes les petites molécules d'intérêt.

Introduction

L'identification de cibles contraignantes pour les médicaments est essentielle au développement de médicaments ainsi qu'à la compréhension des mécanismes moléculaires des maladies. En particulier, les protéines réceptifs et enzymatiques sont les cibles moléculaires les plus importantes des petites molécules^{bioactives 1}. Bien que la capture par affinité soit une technique bien établie pour identifier les protéines²qui lier les médicaments, les limitations techniques, telles que la faible solubilité des protéines, entravent souvent la validation des cibles^{médicamentées 2}. Plus important encore, les petites molécules immobilisées perdent le degré de liberté nécessaire à l'amarrage et peuvent être inaccessibles aux sites de liaison situés à l'intérieur de l'intérieur sur de plus grandes protéines cibles. En outre, le mauvais déroulement des protéines, l'incapacité d'analyser les conditions de co-cristallisation et les limitations dues à la taille moléculaire entravent souvent l'utilisation de la cristallographie aux rayons X, de la résonance magnétique nucléaire (RM) et d'autres analyses expérimentales de ce genre pour l'étude des interactions médicament-protéine.

L'utilisation du biopannage d'affichage des phages T7 est un moyen efficace de déterminer le site de liaison sur les protéines pour les appâts à petites molécules³. En particulier, une bibliothèque de peptides aléatoires à écran phage T7, qui peut être construite en insérant de l'ADN synthétique dans un site multi-clonage, est efficace. Par rapport à la bibliothèque de phages T7 présentant des protéines, les peptides courts peuvent être facilement conçus pour être affichés sur le capside de phage T7 sans restrictions physiques, qui peut stérilisément entrer en contact avec n'importe quel médicament de petite molécule fixé sur un support solide². En outre, l'introduction d'un biocapteur de microbalance de quartz-cristal (QCM) dans la plate-forme de biopanning d'affichage de phage de T7 permet l'identification de telles interactions faibles mais spécifiques des peptides courts avec des drogues en surveillant la réduction de la fréquence de QCM^4,5. Le phage T7 lié est ensuite directement récupéré en infectant l'hôte Escherichia coli (BLT5615), et la séquence d'ADN de la région qui code le peptide sélectionné par affinité abritant des segments courts reconnaissant la drogue est déterminée. L'analyse suivante de la séquence d'acide aminé de la population de peptide fournit l'information concernant la reconnaissance de drogue. Dans l'alignement silico pairwise des séquences d'acides aminés sauvés peuvent être utilisés pour obtenir des informations concernant la cible biologique du médicament dans un protéome sélectionné. Cette identification à haut débit de fragments de protéines ayant une affinité avec un médicament peut être utilisée pour reconstruire heuristiquement le site de liaison médicamenteuse d'une manière similaire à celle de la reconstruction d'un artefact ancien à partir d'éclats de^{poterie 6}. En particulier, cette approche unique peut être utile lorsque les approches protéomiques conventionnelles échouent.

Ici, nous présentons une stratégie basée sur le biocapteur pour le biopannage des peptides et de l'analyse bioinformatique s'affichant sur les phages T7 pour la validation cible des petites molécules. Au-delà des limitations techniques des méthodes conventionnelles, cette stratégie permet d'identifier des sites de liaison médicamentaire sur les protéines cibles pour toute petite molécule d'intérêt dans le cadre du protocole identique.

Protocole

REMARQUE : Voici les étapes de dépistage des phages T7 reconnaissant les médicaments à l'aide d'un biocapteur QCM et de la récupération des phages examinés par l'intermédiaire de l'infection à E. coli (BLT5615). Les protocoles pour la synthèse d'un dérivé d'une petite molécule qui forme un monocouche auto-assemblé (SAM) et pour la construction de la bibliothèque de peptides aléatoires T7 phage-affiché 15-mer peuvent être trouvés ailleurs^6,7.

1. Préparation de la puce du capteur QCM

1. Fixez une puce de capteur en céramique sur l'oscillateur d'un appareil QCM de 27 MHz et enregistrez la fréquence intrinsèque (Hz) dans la phase d'air avant l'immobilisation de petites molécules.
2. Détachez la puce et déposez 20 μL d'une solution (1 mM dans 70% d'éthanol) d'un dérivé de petite molécule qui forme SAM sur l'électrode d'or de la puce du capteur à l'aide d'une pipette.
   AVERTISSEMENT : Le cristal de puce de capteur où l'électrode d'or (Au, 0.1 mm d'épaisseur, 2.5 mm i.d., 4.9 mm²⁾est situé est extrêmement mince et peut se fissurer facilement (SiO_2,0.06 mm d'épaisseur, 9 millimètres i.d.). Par conséquent, pipette soigneusement.
3. Laisser 1 h à température ambiante (environ 20 °C) dans une boîte de Pétri avec du tissu humidifié et à l'abri des lumières ambiantes.
4. Laver délicatement la surface de l'électrode avec de l'eau ultrapure; puis, retirez les gouttes d'eau en soufflant de l'air avec une seringue ou un duster d'air.
5. Configurer la puce du capteur pour l'appareil QCM et enregistrer la réduction de la fréquence dans la phase de l'air pour mesurer la quantité de la petite molécule qui a été immobilisée.
   REMARQUE: Au moins, 100 Hz de fréquence intrinsèque est nécessaire pour réussir l'immobilisation des petites molécules (1 Hz immobilise 30 pg).

2. Biopannage de la bibliothèque de phages T7 à l'aide d'un biocapteur QCM (Figure 1)

1. Placez une cuvette avec un agitateur magnétique dédié sur le biocapteur QCM et versez 8 mL du tampon de réaction (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) dans la cuvette.
2. Fixez la puce du capteur QCM à l'oscillateur et tirez vers le bas le bras de l'oscillateur pour plonger la puce dans le tampon agité à 1000 rpm.
3. Commencez à surveiller la fréquence QCM sur l'ordinateur personnel (PC) et attendez que le sensorgramme équilibre à environ 3 Hz/min de la dérive de fréquence.
4. Injecter 8 μL d'une bibliothèque de phages T7 (1-2 ×^{10 10} pfu/mL) dans la cuvette (concentration finale : 1-2 × 10⁷ pfu/mL) et marquer le point d'injection sur le capteur.
5. Surveiller la réduction de fréquence causée par la liaison des phages T7 à la petite molécule immobilisée sur la surface de l'électrode d'or pendant 10 min.
6. Arrêtez le moniteur de fréquence QCM, déloger la puce du capteur de l'oscillateur et retirez le tampon en soufflant de l'air et/ou en évacuant avec des lingettes.
7. Mettez la puce du capteur dans une boîte humide de Petri et déposez les 20 μL de la suspension de E. coli (BLT5615) (OD₆₀₀ = 0,5 à 1,0 après avoir secoué à 37 °C en ajoutant des cellules hôtes IPTG à 1 mM) dans la phase de notation sur l'électrode d'or.
8. Fermez le couvercle du plat et couvrez-le de papier d'aluminium pour bloquer la lumière.
9. Incuber le plat à 37 °C pendant 30 min sur un mélangeur à microplaques de 96 puits (1000-1500 rpm) pour améliorer la récupération des phages T7 liés.
10. Récupérez les 20 μL de la solution et suspendez-les en 200 μL de moyenne LB.
    REMARQUE : Les échantillons obtenus à cette étape peuvent être conservés à 4 °C par semaine.
11. Préparer une série de dilution de la solution de phage pour l'isolement de plaque et le séquençage d'ADN selon la procédure générale décrite dans les instructions^{du fabricant 8,9}.
12. Essuyer la surface de l'électrode dorée à l'aide d'un coton-tige imbibé de solution de sulfate de dodecyl de sodium à 1 %.
13. Lavez la surface dorée avec de l'eau ultrapure de la bouteille de lavage, puis retirez les gouttes d'eau en soufflant de l'air à l'aide d'une seringue ou d'un duster d'air.
14. Déposer 5 μL de solution piranha (Conc. H₂SO₄: 30% H₂O₂ = 3:1) sur la surface dorée et laisser pendant 5 min.
15. Lavez à nouveau la surface dorée avec de l'eau, puis séchez-la en soufflant de l'air et/ou en évacuant avec des lingettes.
16. Répétez les étapes 2.14 et 2.15.
    ATTENTION : Préparez la solution piranha immédiatement avant l'utilisation. Utilisez ce liquide avec soin, car il s'agit d'un acide très fort. Le traitement de plus de 5 minutes érode la puce du capteur.

3. Analyse bioinformatique à l'aide de la suite de programme Receptor Ligand Contact (RELIC) (Figure 2)^10,11

1. Dézidez le programme AUTONOME RELIC sur un PC avec un système d'exploitation MS Windows.
2. Aligner les séquences d'acides aminés des peptides de 15 mer sélectionnés à l'aide du médicament ou choisis au hasard à partir d'une bibliothèque de parents non sélectionnés dans chaque fichier de format texte (nom.txt).
3. Tapez la séquence d'acides aminés de protéines simples ou multiples dans chaque fichier texte au format FASTA, ou téléchargez les fichiers texte de base de données en format FASTA à partir de n'importe quelle base de données protéique (par exemple UniProt (http://www.uniprot.org/) ou DrugBank (https://www.drugbank.ca/).
4. Placez les fichiers texte (et les fichiers PDB pour HETEROalign) dans le dossier nécessaire à l'exécution de chaque programme RELIC.
5. Cliquez sur le fichier exécutable (programme.exe) pour AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon et FASTAskan dans le dossier indépendant pour ouvrir la version personnelle de FTN95.
6. Tapez le nom de fichier approprié, ainsi que l'extension (nom.txt), dans le message de commande pour exécuter chaque programme et obtenir le fichier de format texte requis.
7. Exportez le fichier texte résultant vers un logiciel de feuille de calcul (par exemple Excel) pour générer un tracé de contenu d'information (INFO) ou des scores de similitude cumulatifs calculés à l'aide d'un BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign).
   REMARQUE : Le serveur RELIC d'origine (http://relic.bio.anl.gov) n'est plus disponible et certains programmes RELIC de type autonome qui fonctionnent sur PC avec une plate-forme Windows peuvent être obtenus auprès de l'auteur correspondant (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

Résultats

Les résultats représentatifs de deux médicaments approuvés cliniquement sont indiqués à la figure 3. Irinotecan (Figure 3A), un prodrug soluble dans l'eau de camptothécine naturelle utilisé pour le traitement du cancer colorectal avancé et le cancer du poumon non à petites cellules, est converti en SN-38 dans le foie, qui inhibe la topoisomerase I dans les cellules cancéreuses¹². En outre, ce composé inhibe directement l'acétylcholinestéstéase (AChE)^13,14. Grâce à cette stratégie, 29 peptides qui reconnaissaient Iri immobilisé en tant que SAM ont été identifiés par des sous-ensembles de biopannage à cycle un cycle à base de biocapteurs QCM. L'alignement appariement subséquent des peptides 29 et de l'AChE a donné des scores maximaux pour y121, Q225, F290, E327, H440 et Y442 et a mis en évidence la partie de la structure tridimensionnelle. Ces résidus d'acides aminés étaient compatibles avec ceux qui ont fait le site iri-contraignant d'AChE. Le même sous-ensemble de peptides a identifié avec succès E99, L100, L252, L305, I387 et V474 à proximité de la triade catalytique (S221, E353 et H467) en carboxyléstéase (CE), ce qui indique que ces acides aminés forment un échafaudage pour la reconnaissance iri lors de la désestérification d'Iri¹⁵. De tels résidus d'acides aminés dans le site catalytique ne peuvent pas être identifiés directement à l'aide de la cristallographie conventionnelle des rayons X ou de l'analyse de la NM, car la réaction enzymatique se déroule sans heurts et ne forme pas le complexe statique de façon stable dans des conditions expérimentales générales. Ainsi, cette détection combinatoire des sites de liaison médicamenteuse de protéines multiples, y compris celles dans les complexes intermédiaires éventuellement formés avec des enzymes lors des réactions métaboliques pour un médicament particulier, est possible en utilisant les peptides sélectionnés par affinité déterminés pour un médicament.

La figure 3B montre les autres résultats obtenus pour l'oseltamivir (Osel), un médicament antigrippal activé pour l'oseltamivir carboxylate, qui à son tour inhibe la neuraminidase (NA) du virus grippal¹⁶. Les 27 peptides qui ont reconnu Osel couvrant la surface d'électrode d'or de puce de capteur de QCM ont détecté avec succès le site osel-contraignant dans NA^16. Ce site de liaison se compose de boucles peptidiques non structurées qui subissent potentiellement un mouvement dynamique lors de l'amarrage à Osel. Les peptides osel-reconnaissants sur le capside de phage de T7 pourraient imiter cet amarrage dynamique en se liant à l'Osel fixé sur la surface d'électrode d'or de la puce de capteur de QCM. Des effets indésirables neuropsychiatriques (ENP) ont été identifiés chez de jeunes patients atteints de grippe, dont l'effet sur les patients est peut-être lié à la maladie elle-même plutôt qu'au médicament. Des études ont démontré que l'Osel est activement exporté du système nerveux central (SNC) des rongeurs par l'intermédiaire de la protéine multirésistante (MDR) dans la barrière céphalo-encéphalique (BBB)¹⁷. En effet, l'une des protéines de la classe de ce MDR a montré un score élevé (top 5% sur 4396 dans la base de données de protéines DrugBank 1.0¹⁸), en plus d'autres transporteurs, enzymes liées aux neurotransmetteurs, et les récepteurs, dans notre étude. La signification pharmacologique de ces protéines en ce qui concerne l'aspect des effets défavorables d'Osel est à l'étude.

Jusqu'à présent, de petits et multiples sites de liaison de molécules sur les protéines cibles ont été identifiés avec succès pour six médicaments à petites molécules qui utilisaient notre stratégie (figure 4). Pour brz2001 et roxithromycine (RXM), des sites identiques de liaison médicamenteuse sur une protéine cible ont été identifiés à l'aide de différents bassins de peptides, les nombres et les séquences d'acides aminés^{pour lesquels variaient complètement 7,19}. En outre, des pools de peptides simples obtenus pour Iri, RXM et Osel ont conduit à l'identification de multiples sites de liaison sur différentes protéines pour chaque médicament, tels que l'AChE et le CE pour Iri (Figure 3A)²⁰, angiomotine et CYP3A4 pour RXM^19,21, et NA et protéine associée au MDR pour Osel. Une cible moléculaire inconnue a été identifiée pour la doxorubicine composée d'anti-tumeur (FANCF)^22,et l'antibiotique anti-angiogenic de macrolide RXM (angiomotin)^19.

Figure 1: Représentation schématique du biopannage à base de biocapteurs qcm de la bibliothèque de peptides t7 phage-affichée. Une bibliothèque de phages T7 qui affiche des peptides aléatoires est injectée dans la cuvette contenant le tampon (en remuant) où la puce du biocapteur QCM est immergée et la fréquence stabilisée. Après avoir surveillé la réduction de fréquence due à la liaison des phages T7 aux petites molécules immobilisées sur la surface de l'électrode d'or de la puce du capteur, la puce du capteur est détachée de l'oscillateur. L'ADN du phage T7 lié est ensuite directement récupéré après l'infection par l'hôte E. coli (BLT5615). Les phages T7 qui en résultent sont isolés par formation de plaque et, enfin, la séquence d'acides aminés du peptide sélectionné par affinité médicamenteux affichée sur le capside de phage T7 est déterminée selon la méthode générale d'affichage des phages. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 :Représentation schématique de l'évaluation quantitative de la comparaison des séquences entre les peptides sélectionnés par les médicaments et les protéines simples ou multiples. Les séquences peptidiques sélectionnées par les médicaments sont respectivement alignées avec les séquences primaires d'acides aminés de protéines simples et multiples, et la similitude dans chaque ensemble d'acides aminés de 3 à 5 est cumulativement notée par alignement appariement selon une matrice BLOSUM62 modifiée. La parcelle ou le diagramme qui en résulte indique les résidus ou les parties qui constituent un site potentiel liant les médicaments sur la protéine. Une analyse plus poussée à l'aide d'un programme RELIC approprié met en évidence le site de liaison sur la structure tridimensionnelle (si le fichier PDB est disponible) ou classe des protéines entières qui sont peut-être la cible contraignante (le programme HETEROalign n'est actuellement pas disponible). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 :Résultats représentatifsde la collecte du peptide et de l'analyse bioinformatique subséquente. (A) Irinotecan (anti-tumeur prodrug, inhibiteur de la topoisomerase I). L'interaction de phage de T7 a été surveillée pendant 10 min comme réduction de la fréquence de QCM. L'ADN du phage lié de T7 a été récupéré et séquencé pour déterminer la séquence correspondante d'acide aminé. Les séquences d'acides aminés de 29 peptides de 15 mer, recueillies à l'aide d'un sous-ensemble de biopannage à cycle unique, ont mis en évidence les acides aminés qui composent le site liant Iri d'AChE [PDB ID 1U65]. Une évaluation plus poussée utilisant les mêmes 29 peptides a mis en évidence les résidus d'acides aminés voisins (résidus d'échafaudage pour la désestérification) de la triade catalytique en CE, une enzyme hépatique qui convertit Iri en SN-38 (forme active) [ID PDB : 1K4Y]. Des scores de similitude de 103 peptides choisis au hasard de la bibliothèque parente non écran⁷,^{19 ont}été soustraits de ces partitions pour supprimer le biais de la bibliothèque. Ces chiffres sont reproduits à partir de l'article 20, avec la permission d'Elsevier. (B) Oseltamivir (médicament antigrigris). Les 27 peptides contenant des acides aminés reconnaissant l'Osel ont mis en évidence des parties désordonnées du site liant osel pour la neuraminidase (NA) (enzyme virale) [ID PDB : 2HT7]. La validation globale de la similitude de séquence entre 27 peptides et 4.396 protéines dans DrugBank 1.0¹⁸ a indiqué NA pour être dans la gamme supérieure de 5%, en plus des protéines humaines d'hôte liées aux fonctions du système nerveux central. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 4 :Résumé des petites molécules, dont les cibles contraignantes ont été identifiées à l'aide de cette stratégie. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ici, une stratégie pour le biopannage basé sur le biocapteur de QCM des peptides médicamenteux-reconnaissants, suivie de l'analyse bioinformatique pour valider des interactions médicament-protéine utilisant les peptides identifiés, a été présentée. La conception des dérivés de petites molécules pour l'immobilisation sur l'électrode d'or du biocapteur est une étape importante, car le linker introduit peut entraver la liaison et la collecte du peptide qui reconnaît le médicament. Pour éviter cela, des dérivés avec différentes positions du linker introduit sont préparés²³. Alternativement, pour immobiliser les petites molécules hydrophobes, la puce du capteur est immergée dans l'eau en vrac dans une boîte de Pétri de 10 cm, et une solution de 20 μL de la petite molécule (solution de 10 mM en sulfure de diméthyle) est déposée sur l'électrode d'or du biocapteur, pour couvrir sa surface, et incubée pendant 5 min. Cela permet la rétention d'une fréquence intrinsèque de sous-cent hertz de petites molécules, qui est maintenue pendant au moins 10 min pendant le biopannage. En effet, à l'aide d'une telle immobilisation, les peptides sélectionnés par affinité osel ont clairement mis en évidence le site de liaison Osel dans NA (Figure 3).

Le phage T7 utilisé pour la préparation de la bibliothèque peptidique ici est génétiquement modifié à l'aide de la cassette NNK₁₅ qui code 32 codons pour les 20 acides aminés standard et réprime l'émergence de 2 codons stop (UAA, UGA) et n'émerge que uag (figure 1)^6,7. Ceci est important pour afficher des peptides pleine longueur de 15 mer et augmenter la diversité de la bibliothèque. Le système d'affichage des phages T7 a une limite d'affichage technique^{de 10 7}à^{10 9} phages T7. Toutefois, la diversité de la bibliothèque peptidique de 15 mer est théoriquement de 20¹⁵ (3,27 × 10^19); par conséquent, il ne peut pas être utilisé pour la construction complète de la bibliothèque. Néanmoins, la recherche de similitudes ou l'extraction de motifs conservés permet la détection des acides aminés comprenant les sites de liaison médicamenteux des protéines, même avec cette diversité limitée de peptides dans la bibliothèque. En outre, 3-5 acides aminés s'étend dans le peptide de bibliothèque (le taux d'apparence est entre 1/20³ et 1/ 20⁵, qui peut être réalisé en utilisant le système d'affichage de phage T7) sont impliqués dans la reconnaissance des médicaments de petites molécules ; par conséquent, une correspondance de 100% des séquences peptidiques avec des séquences d'acides aminés de 15 mer constituant le site de liaison médicamenteux de la protéine cible n'est pas nécessaire. En effet, environ 30 peptides sélectionnés par affinité ont mis en évidence avec succès le site de liaison de la protéine cible pour chaque médicament testé (figure 4). Ainsi, la diversité de la bibliothèque de phages T7 parent utilisé (1,7 × 10⁷ pfu/mL) peut être utilisée pour reconstruire heuristiquement le site de liaison médicamenteux.

Typiquement, 3-5 copies des phages de T7 qui ont montré les mêmes séquences que ceux des séquences d'acides aminés de 15-mer hébergeant des tronçons d'acide aminé drogue-reconnaissants ont émergé dans les 16 plaques arbitrairement isolées, indiquant le succès de la sélection d'affinité sous notre protocole. Ceci indique que 18-30 séquences différentes de peptide drogue-reconnaissant sont rassemblées dans les 96 plaques isolées (le nombre est associé au format de microplaque), qui sont identifiées plus tard utilisant le séquençage de l'ADN et obtenant la séquence correspondante d'acide aminé. Dans la stratégie actuelle, l'injection de 8 μL de la bibliothèque de phages T7 dans la cuvette contenant un tampon de 8 mL (dilution 1000 fois de la bibliothèque) est appropriée pour réduire la liaison non spécifique des phages T7. Pour augmenter la diversité des peptides sélectionnés par affinité, répéter plusieurs fois la sélection d'un cycle et utiliser 16 ou 32 isolements de plaque par criblage s'est avéré plus efficace que l'isolement d'une solution unique à la fois. Par exemple, pour recueillir efficacement environ 30 peptides choisis par affinité différemment, 3 à 6 séries de sélection d'un cycle ont été effectuées, 16 ou 32 plaques ont été isolées dans chaque expérience. L'apparition de séquences identiques dans les 16 ou 32 plaques de phage T7 est indiquée détection accidentelle de fond ou pourrait être contaminée comme report. En revanche, l'absence de phages T7 avec la même séquence ou l'apparence de nombreux phages T7 avec des peptides plus courts que la longueur de 15 mer indique que les phages T7 dans la population non spécifiquement émergé avec une forte probabilité. Comme la réduction de fréquence qcm se produit dans la même mesure même dans de tels cas, le succès de la sélection devrait être complètement évalué en séquençant l'ADN du phage isolé de T7, suivi de l'analyse bioinformatique des séquences d'acide aminé des peptides. En outre, contrairement au protocole conventionnel d'affichage des phages T7, répéter les tours de sélection est moins efficace, car la variation et le nombre des phages T7 sont faibles et ne sont pas concentrés même après avoir répété les étapes d'amplification et de^{sélection 23}.

Fait important, cette méthode s'applique à l'extraction de petits sites liant des molécules dans les protéomes des humains, des virus pathogènes et même des plantes. Fait intéressant, la courte longueur d'affichage éventuellement non structurée des peptides sur le capside de phage T7 peut imiter la dynamique moléculaire des peptides des protéines pendant l'amarrage avec une petite molécule ; cela peut refléter la liaison dynamique²⁴. Au-delà des limites techniques des méthodes conventionnelles, cette stratégie, applicable à des protocoles identiques pour les petites molécules, peut étendre le protéome pharmacologique ainsi que fournir plus de granularité en ce qui concerne l'analyse de l'interaction médicament-protéine.

Certaines limites techniques de cette approche devraient être prises en considération. La synthèse organique est nécessaire pour l'immobilisation de petites molécules à la surface de l'électrode d'or de la puce du biocapteur. Pour les non-experts en chimie organique, certains reagents d'immobilisation sont disponibles dans le commerce pour fixer mécaniquement la petite molécule par couplage. En outre, certaines parties absurdes des peptides pourraient entraîner la détection d'une partie de la protéine non pertinente pour l'amarrage des médicaments comme faux positifs. Cela correspond empiriquement aux domaines riches en feuilles bêta ou en leucine riches en leucine ou en résidus de valine, qui sont codés par plus de codons que d'autres acides aminés standard, lorsque des copies du phage T7 sont produites. Le contrôle de la longueur du peptide de la bibliothèque peut contrôler l'apparition de faux positifs. En revanche, il peut y avoir des cas où des résidus d'acides aminés dans le site de liaison médicamentnelle qui sont impliqués dans l'amarrage, comme démontré à l'aide de la cristallographie aux rayons X ou de l'analyse de la NM, ne sont pas détectés. Ceci peut être résolu en recueillant un plus grand nombre de peptides médicamenteux ou en changeant la direction de fixation des petites molécules sur l'électrode d'or.

De nombreuses interactions médicament-protéine qui sont liées aux effets principaux et secondaires de la consommation de drogues peuvent encore ne pas être identifiées dans le protéome; en outre, les enzymes et les transporteurs responsables de l'absorption, de la distribution, du métabolisme, de l'excrétion et de la toxicité des médicaments pourraient également ne pas être identifiés. La liaison protéique n'est pas toujours responsable de la bioactivité d'un médicament. Ainsi, une combinaison d'autres informations provenant d'analyses biologiques améliorera l'identification des cibles essentielles des médicaments responsables des effets principaux et indésirables des médicaments. D'autres adaptations de cette technique concise augmenteront la praticité et le débit pour l'exploitation minière des sites de liaison protéique d'un large éventail de médicaments à petites molécules. La méthode présentée ci-après contribuera en grande partie non seulement à mener des recherches fondamentales dans les domaines connexes, mais aussi à clarifier les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'efficacité thérapeutique ou à d'autres effets biologiques des médicaments utilisés en clinique.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFFINIXQN	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCM2008-STKIT	Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC
AADIV	Northeastern University (Lee Makowski)	AADIV.exe	Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.
Ceramic Sensor Chip	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMST27C	4 sensor chips/package
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
Ethanol	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	09-0850
FASTAcon	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAcon.exe	Identifies proteins from a population with short consensus sequences.
FASTAskan	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAskan.exe	Lists proteins with high similarity to a peptide population.
Immiblization kit for AFFINIX	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMIMKT	SAM reagent and amine coupling reagent
INFO	Northeastern University (Lee Makowski)	INFO.exe	Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).
Liquid LB medium	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	L3522	Autoclave for 20 min
MATCH	Northeastern University (Lee Makowski)	MATCH.exe	Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length).
MOTIF1	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF1.exe	Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.
MOTIF2	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF2.exe	Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.
NaCl	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	S3014
Receptor ligand contacts (RELIC)	Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA)	https://www.relic.anl.gov	Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)
Tris	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	252859