İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Özet

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

Özet

Reseptörler ve enzim proteinleri, biyoaktif küçük moleküller için bağlayıcı hedefler görevi gören önemli biyomoleküllerdir. Bu nedenle, ilaç-protein etkileşimlerinin hızlı ve küresel olarak doğrulanması, sadece terapötik etkinliğin altında kalan moleküler mekanizmaları anlamak için değil, aynı zamanda klinik kullanım için adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, atılım ve toksisite (ADMET) gibi ilaç özelliklerini değerlendirmek için de son derece arzu edilir. Burada, faj kapsid üzerinde kolayca görüntülenebilen T7 faj ekranlı kısa peptitlerin biyopanlanması için biyosensör tabanlı yüksek verim stratejisi sunuyoruz. Reseptör ligand contact (RELIC) süitinde biyoinformatik programları kullanan ilaç bağlayıcı bölgelerin "kırık kalıntılar" olarak kısa segmentler içeren peptitlerin amino asit dizilerinin daha sonra analizi de gösterilmiştir. Bu yöntem klinik olarak onaylanmış iki ilaca, bir anti-tümör irinotecan'a ve bir anti-grip oseltamivirine uygulanarak, ilacı tanıyan peptit dizilerinin toplanması ve hedef proteinlerin ilaç bağlayıcı bölgelerinin vurgulanması için ayrıntılı süreç bu makalede açıklanmıştır. Burada açıklanan strateji, ilgi çekici herhangi bir küçük molekül için uygulanabilir.

Giriş

İlaç bağlayıcı hedeflerin belirlenmesi, ilaçların geliştirilmesinin yanı sıra hastalıkların moleküler mekanizmalarının anlaşılması için de gereklidir. Özellikle, reseptör ve enzim proteinleri biyoaktif küçük moleküllerin en önemli moleküler hedefleridir¹. Benzeşim yakalama, ilaç bağlayıcı proteinleri tanımlamak için iyi kurulmuş bir teknik olmasına rağmen², proteinlerin düşük çözünürlüğü gibi teknik sınırlamalar, genellikle ilaç hedeflerinin doğrulanmasını engeller². En önemlisi, hareketsiz küçük moleküller kenetlenme için gerekli özgürlük derecesini kaybeder ve daha büyük hedef proteinler üzerinde dahili olarak bulunan bağlama bölgelerine erişilemez olabilir. Ayrıca, protein yanlış katlanması, ko-kristalizasyon koşullarının analiz edilemezliği ve moleküler boyuta bağlı sınırlamalar genellikle X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve ilaç-protein etkileşimlerini incelemek için diğer deneysel analizlerin kullanımını engeller.

T7 faj ekran biyopanning kullanımı, küçük molekül yemleri için proteinler üzerindeki bağlama bölgesini belirlemek için etkili bir yoldur³. Özellikle, sentetik DNA'nın çoklu klonlama bölgesine yerleştirilmesiyle oluşturulabilen T7 fajlı rastgele peptit kütüphanesi etkilidir. Proteinleri görüntüleyen T7 faj kütüphanesi ile karşılaştırıldığında, kısa peptitler fiziksel kısıtlamalar olmadan T7 faj kapsidinde görüntülenecek şekilde kolayca tasarlanmıştır, bu da katı bir destek üzerine sabitlenmiş herhangi bir küçük molekül ilacı ile sterik olarak temas edebilir². Ayrıca, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörün T7 faj ekran biyopanning platformuna^girmesi,QCM frekansındaki azalmayı izleyerek kısa peptitlerin ilaçlarla zayıf ama spesifik etkileşimlerinin tanımlanmasını sağlar⁴,⁵. Bağlı T7 fajı daha sonra konak Escherichia coli (BLT5615) enfekte edilerek doğrudan iyileşir ve uyuşturucu tanıyan kısa segmentleri barındıran benzeşim tarafından seçilen peptidi kodlayan bölgenin DNA dizisi belirlenir. Peptit popülasyonunun amino asit dizisinin daha sonraki analizi ilaç tanıma hakkında bilgi sağlar. Kurtarılan amino asit dizilerinin siliko çift yönlü hizalamasında, seçilen bir proteom içinde ilacın biyolojik hedefi hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir. Bir ilaca yakınlığı olan protein parçalarının bu yüksek verim tanımlaması, ilaç bağlama bölgesini, çömlek parçalarından eski bir eserin yeniden inşasına benzer bir şekilde sezgisel olarak yeniden oluşturmak için kullanılabilir⁶. Özellikle, geleneksel proteomik yaklaşımlar başarısız olduğunda bu benzersiz yaklaşım yararlı olabilir.

Burada, T7 fajla görüntülenen peptitlerin biyopanningi için biyosensör tabanlı bir strateji ve küçük moleküllerin hedef doğrulaması için biyoinformatik analizi sunuyoruz. Geleneksel yöntemlerdeki teknik sınırlamaların ötesinde, bu strateji, aynı protokol kapsamında herhangi bir küçük ilgi molekülü için hedef proteinlerdeki ilaç bağlayıcı bölgelerin tanımlanmasını sağlar.

Protokol

NOT: Aşağıda, bir QCM biyosensörü kullanarak uyuşturucu tanıyan T7 fajlarının taranıp E. coli (BLT5615) enfeksiyonu yoluyla taranan fajların kurtarılması için adımlar yer bunların altı çizilmiştir. Kendi kendine monte edilmiş bir monolayer (SAM) oluşturan küçük bir molekülün türevinin sentezi ve T7 fajla görüntülenen 15 mer rastgele peptit kütüphanesinin inşası için protokoller başka bir yerde bulunabilir^6,7.

1. QCM sensör çipinin hazırlanması

1. 27 MHz'lik bir QCM cihazının osilatörüne seramik bir sensör çipi takın ve küçük molekül hareketsizleştirmeden önce iç frekansı (Hz) hava fazına kaydedin.
2. Çipi ayırın ve bir pipet kullanarak sensör çipinin altın elektrodu üzerine SAM oluşturan küçük bir molekül türevinin 20 μL çözeltisini (%70 etanolde 1 mM) bırakın.
   DİkKAT: Altın elektrodun (Au, 0,1 mm kalınlığında, 2,5 mm i.d., 4,9 mm²⁾bulunduğu sensör çip kristali son derece incedir ve kolayca çatlayabilir (SiO₂, 0,06 mm kalınlığında, 9 mm i.d.). Bu nedenle, pipet dikkatlice.
3. Nemlendirilmiş dokuya sahip ve oda ışıklarından korumalı bir Petri kabında oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) 1 saat bekletin.
4. Elektrot yüzeyini ultra saf su ile hafifçe yıkayın; ardından, bir şırınna veya hava tozlayıcı ile hava üfleyerek su damlalarını çıkarın.
5. QCM aparatı için sensör çipini kurun ve hareketsiz hale getirilen küçük molekülün miktarını ölçmek için hava fazında frekanstaki azalmayı kaydedin.
   NOT: Başarılı küçük molekül hareketsizleştirme için en az 100 Hz iç frekans gereklidir (1 Hz 30 pg'yi hareketsizleştirir).

2. T7 faj kütüphanesinin QCM biyosensör kullanılarak biyopanningi (Şekil 1)

1. QCM biyosensörde özel bir manyetik karıştırıcı ile bir cuvette ayarlayın ve reaksiyon tamponunun 8 mL'lik kısmını (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) cuvette'e dökün.
2. QCM sensör çipini osilatöre takın ve çipi 1000 rpm'de karıştırılan tampona batırmak için osilatörün kolunu aşağı çekin.
3. Kişisel bilgisayarda (PC) QCM frekansını izlemeye başlayın ve sensorgram frekans kaymasının yaklaşık 3 Hz / dakikasına kadar eşdeğer olana kadar bekleyin.
4. Cuvette'e 8 μL T7 faj kütüphanesi (1-2 ×^{10 10} pfu/mL) enjekte edin (son konsantrasyon: 1-2 ×^{10 7} pfu/mL) ve sensördeki enjeksiyon noktasını işaretleyin.
5. T7 fajlarının altın elektrot yüzeyinde hareketsiz hale getirilen küçük moleküle bağlanmasının neden olduğu frekans azaltmayı 10 dakika boyunca izleyin.
6. QCM frekans monitörünü durdurun, sensör çipini osilatörden çıkarın ve havayı üfleyerek ve/veya mendillerle fitilleyerek tamponu çıkarın.
7. Sensör çipini nemli bir Petri kabına yerleştirin ve kütük fazındaki 1 mM'ye IPTG ekleyerek 37 °C'de sallayarak E. coli (BLT5615) (OD₆₀₀ = 0.5—1.0) süspansiyonunun 20 μL'lik süspansiyonunu altın elektrot üzerine bırakın.
8. Kabın kapağını kapatın ve ışığı engellemek için alüminyum folyo ile örtün.
9. Bağlı T7 fajlarının geri kazanımını artırmak için kabı 96 kuyulu bir mikro plaka karıştırıcıda (1000-1500 rpm) 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
10. Çözeltinin 20 μL'lik kısmını geri alın ve 200 μL LB ortasına askıya alın.
    NOT: Bu adımda elde edilen numuneler 4 °C'de bir hafta korunabilir.
11. Üreticinin talimatlarında açıklanan genel prosedüre göre plak izolasyonu ve DNA dizilimi için faj çözeltisinin bir seyreltme serisini hazırlayın^8,9.
12. Altın elektrot yüzeyini% 1 sodyum dodecyl sülfat çözeltisi ile ıslatılmış bir pamuklu çubukla silin.
13. Altın yüzeyi yıkama şişesinden ultra saf su ile yıkayın ve ardından bir şırınna veya hava tozlayıcı ile hava üfleyerek su damlalarını çıkarın.
14. Altın yüzeye 5 μL piranha çözeltisi (Conc. H₂SO₄: %30 H₂O₂ = 3:1) bırakın ve 5 dakika bekletin.
15. Altın yüzeyi tekrar suyla yıkayın ve ardından hava üfleyerek ve/veya mendillerle fitilleyerek kurulayın.
16. 2.14 ve 2.15.
    DİkKAT: Piranha çözeltisini kullanmadan hemen önce hazırlayın. Çok güçlü bir asit olduğu için bu sıvıyı dikkatli kullanın. 5 dakikadan uzun süre tedavi sensör çipini aşındırır.

3. Reseptör Ligand Contact (RELIC) program paketi kullanılarak biyoinformatik analizi (Şekil 2)^10,11

1. MS Windows işletim sistemine sahip bir bilgisayarda tek başına RELIC programını açın.
2. İlacı kullanarak seçilen veya her metin formatı dosyasındaki (ad.txt) ekransız üst kitaplıktan rastgele seçilen 15 mer peptit benzeşiminin amino asit dizilerini hizalayın.
3. Fasta formatında her metin dosyasına tek veya birden çok proteinin amino asit dizisini yazın veya veritabanı metin dosyalarını fasta formatında herhangi bir protein veritabanından (örneğin UniProt (http://www.uniprot.org/) veya DrugBank (https://www.drugbank.ca/) indirin.
4. Metin dosyalarını (ve HETEROalign için PDB dosyalarını) her RELIC programını çalıştırmak için gerekli klasöre yerleştirin.
5. FTN95'in Kişisel Sürümünü açmak için bağımsız klasörde AADIV, BİlGİ, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon ve FASTAskan için yürütülebilir dosyayı (program.exe) tıklatın.
6. Her programı yürütmek ve gerekli metin biçimi dosyasını edinmek için komut iletisine uzantı (ad.txt) ile birlikte uygun dosya adını yazın.
7. Blosum62 (MATCH, HETEROalign) kullanılarak hesaplanan bilgi içeriği (INFO) veya kümülatif benzerlik puanlarının bir grafiğini oluşturmak için elde ettiği metin dosyasını bir elektronik tablo yazılımına (örneğin, Excel) verin.
   NOT: Özgün RELIC sunucusu (http://relic.bio.anl.gov) artık kullanılamıyor ve Windows platformuna sahip bilgisayarlarda çalışan bazı bağımsız türde RELIC programları ilgili yazardan (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp) edinilebilir.

Sonuçlar

Klinik olarak onaylanmış iki ilacın temsili sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. İlerlemiş kolorektal kanser ve küçük hücreli dışı akciğer kanserinin tedavisinde kullanılan doğal camptothecin'in suda çözünen bir prodrugu olan Irinotecan (Şekil 3A),kanser hücrelerinde topoisomeraz I'yi inhibe eden karaciğerde SN-38'e dönüştürülür¹². Ayrıca, bu bileşik doğrudan asetilkolinsteraz (AChE)^13,14inhibe eder. Strateji sayesinde, Iri'yi SAM olarak hareketsiz olarak tanıyan 29 peptit, QCM biyosensör tabanlı tek döngülü biyopannlama alt kümeleri tarafından tanımlandı. 29 peptit ve AChE'nin sonraki çift yönlü hizalaması Y121, Q225, F290, E327, H440 ve Y442 için maksimum puanlar verdi ve üç boyutlu yapıdaki kısmı vurguladı. Bu amino asit kalıntıları, AChE'nin Iri bağlayıcı bölgesini oluşturanlarla tutarlıydı. Aynı peptit alt kümesi E99'u başarıyla tanımladı, L100, L252, L305, I387 ve V474 katalitik üçlü (S221, E353 ve H467) karboksisteraz (CE) civarında, bu amino asitlerin Iri^15'inesterifikasyonu sırasında Iri tanıma için bir iskele oluşturduğunu gösterir. Katalitik bölgede bulunan bu tür amino asit kalıntıları, enzim reaksiyonu sorunsuz ilerledikçe ve genel deneysel koşullar altında statik kompleksi kesin olarak oluşturmadığı için geleneksel X-ışını kristalografisi veya NMR analizi kullanılarak doğrudan tanımlanamaz. Bu nedenle, belirli bir ilaç için metabolik reaksiyonlar sırasında enzimlerle oluşturulan ara komplekslerdekiler de dahil olmak üzere birden fazla proteinin ilaç bağlayıcı bölgelerinin kombinatoryal tespiti, bir ilaç için belirlenen benzeşim tarafından seçilen peptitler kullanılarak mümkündür.

Şekil 3B, influenza virüsünün neuraminidazını (NA) inhibe eden oseltamivir karboksilat için aktive edilen bir grip önleyici ilaç olan oseltamivir (Osel) için elde edilen diğer sonuçları göstermektedir¹⁶. QCM sensör çipi altın elektrot yüzeyini kaplayan Osel'i tanıyan peptitlerin 27'si, NA^16'dakiOsel bağlama bölgesini başarıyla tespit etti. Bu bağlama bölgesi, Osel ile kenetlenirken dinamik hareketten geçme potansiyeli olan yapılandırılmamış peptit döngülerinden oluşur. T7 faj kapsid üzerindeki Osel tanıyan peptitler, QCM sensör çipinin altın elektrot yüzeyine sabitlenmiş Osel'e bağlanırken bu dinamik yerleştirmeyi taklit edebilir. Gripli genç hastalarda nöropsikiyatrik advers olaylar (NPAE' ler) tanımlanmıştır, bu da hastalar üzerindeki etkisi muhtemelen ilaçtan ziyade hastalığın kendisiyle ilgilidir. Çalışmalar, Osel'in kemirgenlerin merkezi sinir sisteminden (CNS) kan-beyin bariyerinde (BBB) multidrug direnci (MDR) proteini yoluyla aktif olarak ihraç edildiğini göstermiştir¹⁷. Gerçekten de, bu MDR sınıfının proteinlerinden biri, çalışmamızda diğer ışınlayıcılara, nörotransmitterle ilgili enzimlere ve reseptörlere ek olarak yüksek bir puan (DrugBank 1.0 protein veritabanında^4.396'danen iyi% 5) gösterdi. Bu proteinlerin Osel'in yan etkilerinin ortaya çıkması açısından farmakolojik önemi araştırılmaktadır.

Şimdiye kadar, hedef proteinlerdeki tek ve çoklu küçük molekül bağlama bölgeleri, stratejimizi kullanan altı küçük molekül ilacı için başarıyla tanımlanmıştır (Şekil 4). Brz2001 ve roxithromycin (RXM) için, bir hedef protein üzerindeki özdeş ilaç bağlama bölgeleri, sayıları ve amino asit dizileri tamamen^7,19değişen farklı peptit havuzları kullanılarak tanımlanmıştır. Ayrıca, Iri, RXM ve Osel için elde edilen tek peptit havuzları, her ilaç için AChE ve CE for Iri (Şekil 3A) 20 , anjiyomotin ve RXM¹⁹,²¹için CYP3A4 ve Osel için NA ve MDR ilişkili protein gibi farklı proteinler üzerinde birden fazla bağlayıcı bölgenin tanımlanmasına yol açmıştır. Anti-tümör bileşik doxorubicin (FANCF)²²ve anti-anjiyojenik makrolid antibiyotik RXM (anjiyomotin)¹⁹için bilinmeyen bir moleküler hedef tanımlanmıştır.

Şekil 1: T7 fajla görüntülenen peptit kütüphanesinin QCM biyosensör bazlı biyopanninginin şematik gösterimi. Rastgele peptitleri görüntüleyen bir T7 faj kütüphanesi, QCM biyosensör çipinin batırıldığı ve frekansın stabilize edildiği tamponu (karıştırma altında) içeren cuvette enjekte edilir. T7 fajlarının sensör çipinin altın elektrot yüzeyinde hareketsiz hale getirilen küçük moleküllere bağlanması nedeniyle frekans azaltmayı izledikten sonra sensör çipi osilatörden ayrılır. Bağlı T7 fajından DNA daha sonra konak E. coli (BLT5615) enfeksiyonundan sonra doğrudan iyileşir. Elde edilen T7 fajları plak oluşumu ile izole edilir ve son olarak T7 faj kapsidinde görüntülenen ilaç benzeşimi seçilen peptitin amino asit dizisi genel faj görüntüleme yöntemine göre belirlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İlaçla seçilmiş peptitler ile tek veya çoklu proteinler arasındaki dizi karşılaştırmasının nicel değerlendirmesinin şematik gösterimi. İlaçla seçilen peptit dizileri sırasıyla tek ve çoklu proteinlerin birincil amino asit dizileri ile hizalanır ve her 3-5 amino asit kümesindeki benzerlik, değiştirilmiş bir BLOSUM62 matrisine göre çift yönlü hizalama ile kümülatif olarak puanlanır. Ortaya çıkan arsa veya diyagram, protein üzerinde potansiyel bir ilaç bağlama bölgesi oluşturan kalıntıları veya bölümleri gösterir. Uygun bir RELIC programı kullanarak daha fazla analiz, üç boyutlu yapıdaki bağlama sitesini vurgular (PDB dosyası varsa) veya muhtemelen bağlama hedefi olan tüm proteinleri sıralar (HETEROalign programı şu anda kullanılamıyor). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3:Peptit toplama ve sonraki biyoinformatik analizinin temsili sonuçları. (A) Irinotecan (anti-tümör prodrug, topoisomeraz I inhibitörü). T7 faj etkileşimi QCM frekansında azalma olarak 10 dakika izlendi. Bağlı T7 fajının DNA'sı ele geçirildi ve karşılık gelen amino asit dizisini belirlemek için sıralandı. Tek döngülü biyopannlamanın bir alt kümesi kullanılarak toplanan 29 adet 15 mer peptidden oluşan amino asit dizileri, AChE'nin Iri bağlayıcı bölgesini oluşturan amino asitleri vurgulamıştır [PDB ID 1U65]. Aynı 29 peptit kullanılarak yapılan daha fazla değerlendirmede, Iri'yi SN-38'e (aktif form) dönüştüren bir karaciğer enzimi olan CE'deki katalitik triyad'ın komşu amino asit kalıntıları (de-esterifikasyon için iskele kalıntıları) vurgulandı [PDB ID: 1K4Y]. Taranmamış üst kütüphane^7,19'dan rastgele seçilen¹⁰³ peptitin benzerlik puanları, kütüphane önyargısını ortadan kaldırmak için bu puanlardan çıkarıldı. Bu rakamlar Elsevier'in izniyle Ref. 20'den çoğaltılır. (B) Oseltamivir (grip önleyici ilaç). Osel tanıyıcı amino asitler içeren 27 peptit, neuraminidaz (NA) (virüs enzimi) için Osel bağlayıcı bölgenin düzensiz kısımlarını vurguladı [PDB Kimliği: 2HT7]. DrugBank 1.0^18'deki 27 peptit ve 4.396 protein arasındaki dizi benzerliğinin küresel olarak doğrulanması, NA'nın merkezi sinir sisteminin işlevleriyle ilişkili konak insan proteinlerine ek olarak ilk% 5 aralığında olduğunu ortaya koydu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Şekil 4:Bağlama hedefleri bustrateji kullanılarak tanımlanan küçük moleküllerin özeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Tartışmalar

Burada, ilaç tanıyan peptitlerin QCM biyosensör bazlı biyopannlaması için bir strateji ve ardından tanımlanan peptitleri kullanarak ilaç-protein etkileşimlerini doğrulamak için biyoinformatik analizi sunulmuştur. Biyosensörün altın elektrodu üzerinde hareketsizleştirme için küçük molekül türevlerinin tasarlanması önemli bir adımdır, çünkü tanıtılan bağlayıcı ilacı tanıyan peptitin bağlanmasını ve toplanmasını engelleyebilir. Bunu önlemek için, tanıtılan bağlayıcının farklı pozisyonlarına sahip türevler hazırlanır²³. Alternatif olarak, hidrofobik küçük molekülleri hareketsiz hale getirmek için, sensör çipi 10 cm Petri kabında dökme suya batırılır ve küçük molekülün 20 μL çözeltisi (dimetil sülfitte 10 mM çözeltisi) biyosensörün altın elektroduna, yüzeyini örtmek için bırakılır ve 5 dakika boyunca inkübe edilir. Bu, biyopannlama sırasında en az 10 dakika tutulan küçük moleküllerin yüz altı hertz iç frekansının tutulmasına izin verir. Gerçekten de, bu tür hareketsizleştirmeyi kullanarak, Osel benzeşimi tarafından seçilen peptitler, NA'daki Osel bağlama bölgesini açıkça vurgulamıştır (Şekil 3).

Buradaki peptit kütüphanesini hazırlamak için kullanılan T7 fajı, standart amino asitlerin 20'si için 32 kodon kodlayan ve 2 stop kodonunun (UAA, UGA) ortaya çıkışını bastıran ve sadece UAG ( Şekil 1 ) 6^,7ortaya çıkan NNK15kaseti kullanılarak genetik olarak tasarlanmıştır. Bu, 15 mer tam boy peptitlerin görüntülenmesi ve kütüphanenin çeşitliliğinin artırılması için önemlidir. T7 fajlı ekran sistemi 10^{7 —109} T7 fajlık teknik ekran sınırına sahiptir. Bununla birlikte, 15-mer peptit kütüphanesinin çeşitliliği teorik olarak 20^{15 'tir} (3.27 × 10^19); bu nedenle, tam kütüphane yapımı için kullanılamaz. Bununla birlikte, korunmuş motiflerin benzerlik araması veya madenciliği, kütüphanedeki bu sınırlı peptit çeşitliliği ile bile proteinlerin ilaç bağlama alanlarını oluşturan amino asitlerin tespit edilmesine izin verir. Ek olarak, kütüphane peptidi içinde 3-5 amino asit uzanır (görünüm oranı T7 faj görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilen 1/20³ ile^{1/ 20 5}arasındadır) küçük moleküllü ilaçların tanınmasında rol oynar; bu nedenle, peptit dizilerinin hedef proteinin ilaç bağlama bölgesini oluşturan 15-mer amino asit dizileri ile% 100 eşleşmesi gerekli değildir. Gerçekten de, yaklaşık 30 benzeşim seçilmiş peptit, test edilen her ilaç için hedef proteinin bağlama bölgesini başarıyla vurgulamıştır (Şekil 4). Böylece, kullanılan ana T7 faj kütüphanesinin çeşitliliği (1.7 × 10⁷ pfu/mL) ilaç bağlama bölgesini sezgisel olarak yeniden oluşturmak için kullanılabilir.

Tipik olarak, T7 fajlarının 3-5 kopyası, ilaç tanıyan amino asit esnemelerini barındıran 15-mer amino asit dizilerinin dizileriyle aynı dizileri gösteren, keyfi olarak izole edilen 16 plak içinde ortaya çıktı ve bu da protokolümüz kapsamındaki benzeşim seçiminin başarısını gösterdi. Bu, izole edilen 96 plakta (sayı mikro plaka formatı ile ilişkilidir) 18-30 farklı ilaç tanıyan peptit dizisinin toplandığını ve daha sonra DNA'nın dizilimi kullanılarak ve ilgili amino asit dizisinin elde edildiğini gösterir. Mevcut stratejide, T7 faj kütüphanesinin 8 μL'lik kısmının 8 mL tampon (kütüphanenin 1000 kat seyreltilmesi) içeren cuvette'e enjektesi, T7 fajlarının spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için uygundur. Benzeşim tarafından seçilen peptitlerin çeşitliliğini artırmak için, bir döngü seçimini birkaç kez tekrarlamak ve tarama başına 16 veya 32 plak izolasyonu kullanmak, aynı anda tek bir çözeltiden izolasyondan daha etkili olduğunu kanıtladı. Örneğin, yaklaşık 30 farklı sıralı benzeşim seçilmiş peptitleri etkili bir şekilde toplamak için, 3-6 set tek döngülü seçim yapıldı, her deneyde 16 veya 32 plak izole edildi. 16 veya 32 T7 faj plaklarının hepsinde aynı dizilerin ortaya çıkması, arka planın yanlışlıkla tespit edildiği veya taşıma olarak kontaminasyon olabileceği belirtilmektedir. Buna karşılık, 15 mer uzunluğundan daha kısa peptitlere sahip birçok T7 fajının aynı dizilimi veya görünümüne sahip T7 fajlarının bulunmaması, popülasyondaki T7 fajlarının özellikle yüksek olasılıkla ortaya çıktığını göstermektedir. QCM frekans azalması bu gibi durumlarda bile aynı ölçüde gerçekleştiğinden, seçimin başarısı izole T7 fajının DNA'sı sıralanarak kapsamlı bir şekilde değerlendirilmeli ve ardından peptitlerin amino asit dizilerinin biyoinformatik analizi yapılmalıdır. Ayrıca, geleneksel T7 faj ekran protokolünden farklı olarak, T7 fajlarının varyasyonu ve sayısı küçük olduğundan ve amplifikasyon ve seçim adımlarını tekrarladıktan sonra bile konsantre olmadığı için seçim turlarının tekrarlanması daha az etkilidir²³.

Daha da önemlisi, bu yöntem insanların, patojenik virüslerin ve hatta bitkilerin proteomlarında küçük molekül bağlayıcı bölgelerin madenciliği için geçerlidir. İlginçtir ki, T7 faj kapsid üzerindeki peptitlerin muhtemelen yapılandırılmamış kısa ekran uzunluğu, küçük bir molekülle kenetlenme sırasında protein peptitlerinin moleküler dinamiklerini taklit edebilir; bu dinamik bağlamayı yansıtabilir²⁴. Geleneksel yöntemlerin teknik sınırlamalarının ötesinde, küçük moleküller için aynı protokoller için geçerli olan bu strateji, ilaçlanabilir proteomu genişletebilir ve ilaç-protein etkileşim analizi ile ilgili daha ayrıntılılık sağlayabilir.

Bu yaklaşımın bazı teknik sınırlamaları göz önünde bulundurulmalıdır. Biyosensör çipinin altın elektrot yüzeyinde küçük molekül hareketsizleştirme için organik sentez gereklidir. Organik kimya uzmanı olmayanlar için, bazı hareketsizleştirme reaktifleri, küçük molekülü kaplinle mekanik olarak sabitlemek için ticari olarak mevcuttur. Ayrıca, peptitlerin bazı saçma kısımları, ilacın kenetlenmeyle ilgili olmayan proteinin bir kısmının yanlış pozitif olarak tespit edilmesine neden olabilir. Bu, T7 fajının kopyaları üretildiğinde, diğer standart amino asitlerden daha fazla kodon tarafından kodlanan lösin veya valin kalıntıları bakımından zengin beta-tabaka veya lösin bakımından zengin alanlara ampirik olarak karşılık gelir. Kitaplık peptit uzunluğunun kontrol altına alındırıcısı yanlış pozitiflerin oluşumunu kontrol edebilir. Buna karşılık, X-ışını kristalografisi veya NMR analizi kullanılarak gösterildiği gibi, kenetlenmede rol oynayan ilaç bağlama bölgesinde amino asit kalıntılarının tespit edilmediği durumlar olabilir. Bu, ilaç tanıyan peptitlerin daha fazla sayıda toplanması veya altın elektrot üzerindeki küçük moleküllerin sabitleme yönünün değiştirilmesiyle çözülebilir.

İlaç kullanımının ana ve ikincil etkileri ile ilgili birçok ilaç-protein etkileşimi henüz proteomda tanımlanamayabilir; ek olarak, ilaç emilimi, dağılımı, metabolizması, atılımı ve toksisiteden sorumlu enzimler ve taşıyıcılar da hala tanımlanamayabilir. Protein bağlama her zaman bir ilacın biyoaktivitesi için sorumlu değildir. Bu nedenle, biyolojik tahlillerden elde edilen diğer bilgilerin bir kombinasyonu, ilaçların ana ve olumsuz etkilerinden sorumlu temel ilaç hedeflerinin tanımlanmasını geliştirecektir. Bu özlü tekniğin daha fazla adaptasyonu, çok çeşitli küçük moleküllü ilaçların protein bağlayıcı alanlarının madenciliği için pratikliği ve verimi artıracaktır. Burada sunulan yöntem, sadece ilgili alanlarda temel araştırmaların yapılmasına değil, aynı zamanda klinik kullanımda ilaçların terapötik etkinliğinin veya diğer biyolojik etkilerinin altında kalan moleküler mekanizmaların açıklığa kavuşturulmasına da büyük ölçüde katkıda bulunacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFFINIXQN	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCM2008-STKIT	Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC
AADIV	Northeastern University (Lee Makowski)	AADIV.exe	Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.
Ceramic Sensor Chip	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMST27C	4 sensor chips/package
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
Ethanol	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	09-0850
FASTAcon	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAcon.exe	Identifies proteins from a population with short consensus sequences.
FASTAskan	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAskan.exe	Lists proteins with high similarity to a peptide population.
Immiblization kit for AFFINIX	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMIMKT	SAM reagent and amine coupling reagent
INFO	Northeastern University (Lee Makowski)	INFO.exe	Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).
Liquid LB medium	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	L3522	Autoclave for 20 min
MATCH	Northeastern University (Lee Makowski)	MATCH.exe	Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length).
MOTIF1	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF1.exe	Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.
MOTIF2	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF2.exe	Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.
NaCl	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	S3014
Receptor ligand contacts (RELIC)	Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA)	https://www.relic.anl.gov	Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)
Tris	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	252859